UNIVERSIDADE LÚRIO

FACULDADE DE CIÊNCIAS DE SAÚDE

LICENCIATURA EM MEDICINA GERAL

2º ANO / IIº SEMESTRE

HISTORIAL DA PCR

ARLETE ERNESTINA JOSÉ LIMA

NAMPULA 2023

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Arlete Ernestina José Lima

Historial da PCR

Trabalho de caracter avaliativo, da cadeira de

Genética a ser apresentado na Faculdade de
Ciências de Saúde, na turma do 2º semestre do
curso de Medicina Geral 2023.

Docente: Martins Moloiua

Nampula 2023

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Índice
Introdução..................................................................................................................... 4
1. Histórico da PCR. ................................................................................................... 5
2. O que é PCR? ......................................................................................................... 6
2.1 Importância da PCR .......................................................................................... 6
2.2 Componentes da PCR e suas funções na reacção: ................................................. 7
2.2.1 DNA molde: .............................................................................................. 7
2.2.2 DNA polimerase: ....................................................................................... 8
2.2.3 Tampão e sais: ........................................................................................... 8
2.2.4 Cátion metal divalente: ............................................................................... 9
2.2.5 Desoxinucleotídeos: ................................................................................... 9
2.2.6 Primers sintéticos: ...................................................................................... 9
2.2.7 Gel de agarose/poliacrilamida: ..................................................................... 9
2.2.8 Termociclador:......................................................................................... 10
2.2.9 Reagentes de alta densidade e corantes: ...................................................... 10
2.2.10 Marcador de massa molecular (ladder): ................................................... 10
2.3 Como se faz? .................................................................................................. 10
2.4 Tipos de PCR ................................................................................................. 12
2.4.1 RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): ....................................... 12
2.4.2 Multiplex PCR: ........................................................................................ 13
2.4.3 Nested PCR: ............................................................................................ 13
2.4.4 PCR Competitiva: .................................................................................... 13
2.4.5 AFLP: ..................................................................................................... 13
2.4.6 Hot Start:................................................................................................. 14
2.4.7 PCR–colony: ........................................................................................... 14
2.4.8 Real-Time PCR: ....................................................................................... 14
2.4.9 Long: ...................................................................................................... 15
2.4.10 Inverse: ................................................................................................ 15
2.4.11 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorfism): ................................... 15
2.5 Análise do produto da PCR : ............................................................................ 15
Conclusão ................................................................................................................... 17
Referencias Bibliográficas ............................................................................................ 18

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Introdução

Reacção em cadeia da polimerase (PCR) é um método in vitro rápido, sensível e versátil para
amplificação selectiva de sequencias definidas de DNA (ou RNA) a partir de amostras
complexas de ácidos nucleicos.

O desenvolvimento da PCR no meio científico tem sido comparado frequentemente com o

desenvolvimento da internet. Ambas as invenções surgiram nos últimos 20 anos, sendo difícil
imaginar a vida sem eles. Ambos têm crescido muito além dos limites do seu design original
simples e criaram oportunidades inimagináveis antes de sua invenção. É difícil acreditar que a
técnica que se formou com o projecto genoma humano é fundamental para os laboratórios de
biologia molecular. A técnica do PCR é valiosa para os cientistas, auxiliando o mapeamento
genético, detecção de doenças, estudo das funções dos genes, a identificação de células, e
análises de identificação forense. Pode ser usada para estudos de diversidade genética em
qualquer grupo de animal ou vegetal. A PCR também revolucionou a biologia evolutiva,
tornando possível analisar o DNA dos mamutes e restos mortais de antigos humanos
encontrados em pântanos.

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1. Histórico da PCR.

Na década de 60 vários pesquisadores procuraram obter a síntese de DNA in vitro. A obtenção

do DNA em tubo de ensaio foi o primeiro passo para um universo de experimentos em genética
molecular. O primeiro a conseguir Arthur Kornberg, que identifica a “polimerase”, uma enzima
que catalisa a síntese de DNA.

Em 1983, Kary Banks Mullis, pesquisador da Cetus Corporation, em Emervylle, Califórnia,

imaginou uma forma de fazer com que a DNA polimerase iniciasse e terminasse seu trabalho
em trechos pré-determinados do DNA. Através deste sistema seria possível amplificar milhões
de vezes um pequeno trecho de um longo segmento de DNA. Mullis percebeu que possuía uma
importante ferramenta em mãos, tentou publicar seus experimentos nas duas revistas científicas
mais importantes do mundo, a Science e a Nature, ambas negaram a publicação, resignado,
conseguiu publicar então seu artigo sobre amplificação do gene da betaglobina humana na
Methods in Enzymology, de impacto infinitamente menor. A ideia da PCR foi aprimorada na
Cetus e apresentada pela primeira vez em 1985.

A Cetus Corporation pagou a Mullis para desenvolver a patente PCR 10.000 dólares, que a
corporação venderia mais tarde por 300.000.000 de dólares. Frustrado tanto pelo tamanho do
prêmio e como as restrições a sua pesquisa, Mullis deixou a Cetus em 1986, tornando –se um
consultor de pesquisa privado. Em 1989, a revista Science escolheu a molécula usada na PCR,
a Taq polimerase, como a primeira molécula do ano.

Em 1991 a PCR se tornou comum em laboratórios do mundo todo e referências ao uso da

técnica já somavam milhares nas revistas científicas. Na década de 90 foi referenciada em pêlos
menos 10.000 publicações científicas por ano.

Em 1993 , Mullis ganhou o Prêmio Nobel em Química. Cientistas da Cetus desenvolveram

uma versão comercial do PCR e uma máquina chamada do termociclador, com a adição de
elementos químicos do DNA, chamados nucleotídeos, e um catalisador bioquímico chamado
polimerase, a máquina realizaria o processo automaticamente em um pedaço alvo de DNA.

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2. O que é PCR?

PCR ou Reacção de Cadeia Polimerase é uma técnica de Biologia Molecular que tem como
função amplificar uma porção específica do material genético por meio de uma enzima
termostátil in vitro. Ela faz uma amplificação exponencial selectiva de uma quantidade reduzida
de material genético de uma única célula, que pode variar de poucos pares de bases a muitos
pares de bases.

Através desse processo o DNA molde sofre uma amplificação controlada por enzimas
obtendo-se milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse. Essa técnica explora a função
natural da enzima chamada de taq- polimerase extraída da bactéria Thermus aquaticus que é
capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no sentido 5’ – 3’. Essa Bactéria além de
ser capaz de sintetizar o DNA teve grande importância neste processo, pois antes da sua
utilização o grande problema para a execução da técnica era o aumento da temperatura, o que
foi controlado por esta.

O molde utilizado pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla como o DNA genómico,
podendo se utilizar uma gota de sangue, um fio de cabelo, fragmentos de pele e órgãos ou até
uma célula do epitélio bucal. Esse método tem como princípios básicos a utilização de
oligonucleotídeos (primers) e regiões específicas da molécula de DNA e a acção da DNA
polimerase. Esses primers são utilizados para direccionar a síntese do DNA em ciclos repetidos.
A cada ciclo as fitas servem de molde para a geração de novas fitas e o número de ciclos é
determinado pelos objectivos e condições utilizadas.

2.1 Importância da PCR

 Amplificação de DNA: A PCR permite a amplificação selectiva de fragmentos de DNA
específicos. Isso é útil em muitos contextos, como na identificação de genes específicos,
na detecção de doenças genéticas, no estudo de marcadores genéticos e na análise de
DNA antigo.
 Diagnóstico de Doenças: A PCR é usada extensivamente para diagnosticar doenças
infecciosas, genéticas e outras condições médicas. Ela permite a detecção de material
genético de peptógenos, como vírus e bactérias, no sangue, tecidos ou outros fluidos
corporais.

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  Medicina Forense: A PCR é uma ferramenta essencial na identificação de suspeitos em
investigações criminais, na análise de amostras de DNA em cenas de crime e na
confirmação da identidade de indivíduos em testes de paternidade.
 Estudos de Evolução e Filogenia: A PCR é usada para comparar sequências de DNA
entre espécies diferentes, ajudando na reconstrução de árvores filogenéticas e no estudo
da evolução.
 Pesquisa Científica: A PCR é amplamente usada na pesquisa científica para investigar
a função de genes, estudar processos biológicos e realizar experimentos de biologia
molecular.
 Medicina Personalizada: A PCR é utilizada na medicina personalizada para identificar
variações genéticas individuais que podem influenciar a resposta de um paciente a
medicamentos específicos. Isso ajuda os médicos a escolher tratamentos mais eficazes
e personalizados.
 Engenharia Genética: A PCR desempenha um papel crucial na clonagem de genes, na
criação de bibliotecas genômicas e na produção de DNA recombinante, que são
fundamentais para a engenharia genética e a biotecnologia.

2.2 Componentes da PCR e suas funções na reacção:

2.2.1 DNA molde:

É a informação que se deseja amplificar. Tora reacção de PCR parte de um DNA molde,
extraído da amostra que está sendo utilizada. Pode ser utilizada uma amostra de DNA ou de
RNA. No caso de uma amostra de RNA esta deverá primeiramente ser convertida em uma fita
de cDNA (DNA complementar). O ideal é que o ácido nucleico esteja livre de impurezas como
proteínas, lipídios, outros ácidos nucleicos ou reagentes de extracção, e em uma concentração
mínima de 5µg/mL, porém quantidades menores também podem ser utilizadas (VIEIRA).

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2.2.2 DNA polimerase:

É a enzima responsável pelo processo de amplificação do DNA alvo. A DNA polimerase a

adição dos desoxinucleotídeos em sequencias complementares ao DNA molde, gerando assim
novas cadeias de DNA iguais ao DNA molde. Para esta tarefa ela utiliza também os primers
sintéticos, que acoplam-se ao DNA molde e marcam os pontos de inicio da adição de
nucleotídeos (VIEIRA, Aula 1).

A DNA polimerase mais utilizada é a Taq polimerase, uma polimerase isolada da bactéria
Thermus aquaticus, que habita fontes termais. Existe também a Tth polimerase, isolada em
Thermus thermophilus. A taq é uma enzima chamada non-proofreading, o que quer dizer que
podem haver alguns erros na sequência do fragmento final. Enzimas desta classe percorrem a
fita de DNA apenas uma vez, dando a chance de que algum erro durante a duplicação não seja
reparado. Além disso ela também adiciona uma adenina as extremidades 3’ do DNA, o que
pode dificultar o uso posterior do amplificado (VIEIRA, Aula 2).
Para estes casos existem as enzimas da classe proofreading, que além de percorrerem a fita mãe
pelo menos duas vezes, em geral não adicionam nucleotídeos extras nas bordas das cadeias-
filhas. Deste grupo pode-se destacar a Pfu (de Pyrococcus furiosis) e a Tli (de Thermococcus
litoralis) (VIERIA, Aula 2).

2.2.3 Tampão e sais:

Os tampões têm por função manter o pH da solução ideal para a atividade da enzima e para a
conservação do DNA molde. Os sais proporcionam força iônica para a atividade enzimática e
influenciam a cinética de hibridização do DNA (RABELO).

As soluções-tampão são geralmente fornecidas juntamente com a DNA polimerase, e possuem

composições específicas de acordo com cada fabricante, por questões de maior especificidade.
Basicamente estas soluções contêm íons diversos, Na+, Cl-, K+ entre outros. Alguns tampões
contêm ainda detergentes, inibindo a formação de dímeros das cadeias enzimáticas, proteínas
estabilizantes (BSA – albumina sérica bovina) e algumas substâncias que agem na desnaturação
da cadeia molde, quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases (VIEIRA, Aula1.
RABELO).

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2.2.4 Cátion metal divalente:

Reagente de grande importância na reacção. Um dos mais utilizados é o MgCl2, um doador

muito estável de íons Mg+2, que são cofactores indispensáveis para a actividade da enzima.
Algumas enzimas utilizam também outros íons metálicos como cofactores. Um exemplo é a
Tth polimerase. Na presença de Mg2= ela possui actividade DNA polimerásica. Porém na
presença de Mn2+ ela apresenta actividade de uma transcriptase reversa, ou seja, sintetiza DNA
a partir de uma cadeia de RNA (VIEIRA Aula 1).

2.2.5 Desoxinucleotídeos:

Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima da reacção de PCR. São compostos por

nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono 5’ da desoxirribose. São
adicionados pela DNA polimerase complementarmente a fita molde, para compor as cópias do
DNA. Adiciona-se na reacção uma mistura de todos os nucleotídeos em concentrações iguais
(VIEIRA Aula 1. RABELO)

2.2.6 Primers sintéticos:

São oligonicleotídeos curtos e de fita simples. Possuem sequência linear e complementar ao

DNA alvo (sequência de DNA que se procura e deseja amplificar). Os primers acoplam-se ao
DNA molde nos pontos onde o DNA é complementar à sua sequência de bases, e a partir daí
servem como ponto de inicio (sítios de iniciação) para a DNA polimerase realizar a adição de
nucleotídeos, no processo de amplificação do DNA ((CORRÊA & POSSIK. RABELO).

2.2.7 Gel de agarose/poliacrilamida:

Utilizados como matriz de separação dos fragmentos de DNA durante a corrida eletroforética.
A utilização de uma matriz ou outra depende do tamanho dos fragmentos que se procura, devido
à diferença no tamanho dos poros de cada gel. O gel de agarose pode ser utilizado para separar
fragmentos de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases), e a poliacrilamida para fragmentos
menores, de até 1 kb (CORRÊA & POSSIK. SILVA, 2001).

Apesar de ser mais efetiva na separação de fragmentos menores, ela apresenta alguns
problemas, como o fato de, em solução, ser neurotóxica (CORRÊA & POSSIK).

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A agarose é um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha e formado por resíduos
de D e L galactose unidos por ligações glicosídicas α (1 3) e β (1 4), é um material gelatinoso
e semelhante à gelatina incolor. O gel de agarose pode ser reciclado após o uso e utilizado na
preparação de outros géis (CORRÊA & POSSIK).

2.2.8 Termociclador:

Este equipamento comanda os ciclos de temperatura necessários para o processo de

amplificação do DNA. Ele é responsável por controlar as elevações e reduções de temperatura
e controlar o tempo de duração de cada ciclo. Cada etapa do processo demanda uma temperatura
e um tempo específico (SILVA, 2001).

A maioria dos termocicladores segue o padrão: aquecimento por resistência eléctrica e

refrigeração por ventoinhas e serpentina preenchida por etileno glicol. Os termicicladores mais
sofisticados possuem um bloco de aquecimento composto por uma liga metálica que aquece ou
resfria de acordo com o sentido da corrente elétrica aplicada (VIEIRA, Aula 1. SILVA, 2001).

2.2.9 Reagentes de alta densidade e corantes:

Estas substâncias geralmente estão presentes no tampão. Os reagentes de alta densidade

(sacarose, glicerol ou ficol). Sua função é garantir que a amostra de DNA entre nos poços pela
força da gravidade. Já os corantes facilitam a aplicação da amostra no gel e auxiliam no
monitoramento da corrida (CORRÊA & POSSIK).

2.2.10 Marcador de massa molecular (ladder):

O ladder é uma mistura de diversos fragmentos de DNA de tamanhos e concentrações

conhecidos, gerados a partir da digestão de plasmideos com enzimas de restrição. Ele permite
inferir, por comparação, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra analisada (CORRÊA
& POSSIK).

2.3 Como se faz?

Para a execução da técnica da PCR é preciso que se tenha conhecimento prévio da sequência
do ácido nucléico que se deseja amplificar, dita “sequência alvo.” A partir disto, desenham-se
dois iniciadores (“primers”) para dar partida ao processo de síntese em um local específico. Um
“primer” serve para sintetizar a sequência alvo no sentido 3’- 5’e outro para o sentido inverso
isto é, 5’-3.’ O “primer” é uma pequena sequência de nucleotídeos que hibridiza no início da

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sequência alvo que se quer amplificar e da qual ele é complementar. Ao reconhecer o “primer,”
a polimerase sintetiza uma cópia complementar, obedecendo à informação contida na sequência
de DNA que será replicada (sintetizada). A PCR precisa ainda de deoxinucleosídeos
trifosfatados (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) que são quatro componentes químicos diferentes que
atuam como se fossem tijolos na construção da molécula de DNA.

O primeiro passo para a realização de um PCR é a coleta da amostra biológica. Para tanto, é
importante levar em consideração o que se deseja pesquisar. Por exemplo: se um paciente
apresenta uma lesão na pele, deve ser recolhida uma amostra da mesma e não do sangue do
paciente.

O segundo passo consiste em extrair o DNA a partir do material coletado. Esta extracção segue
um critério de metodologia básico, que varia dependendo da amostra utilizada. Basicamente
utilizam-se substâncias desproteinizantes como o fenol-clorofórmio, capazes de desnaturar e
retirar as proteínas que estão acopladas ao DNA. A adição posterior de etanol, então, fará com
que o material genético precipite no tubo que posteriormente será solubilizado em tampão
apropriado para o uso na reacção.

O terceiro passo consiste em preparar a mistura de reação. A mistura de reação contém as

substâncias necessárias para fazer novas cópias de DNA no processo da PCR. Então, dentro de
um tubo são colocados:

1) Solução tampão para manter a mistura de reacção no pH e condições iônicas ideais para a
reacção.

2) Os deoxinucleotídeos já mencionados;

3) Os “primers.”

4) A Taq Polimerase

5) O DNA extraído da amostra.

O quarto passo consiste na reacção em si que é feita em uma máquina especial, chamada de
termociclador, que aquece e resfria o tubo em vários ciclos consecutivos para amplificar o DNA.
Primeiramente, o tubo é aquecido a 90-96 graus para que o DNA seja desnaturado (separação
das fitas). Em seguida, a temperatura do termociclador diminui para permitir a hibridização ou
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anelamento; nesta fase, os “primers” se ligam, especificamente, às suas sequências
complementares no DNA. A próxima etapa é a síntese pela polimerase. Após diversos ciclos
(geralmente em torno de 30 ciclos) o DNA estará amplificado em milhões de cópias.

Os problemas técnicos podem surgir. O mais importante é a contaminação da amostra com

material genético estranho que pode gerar cópias de DNA não relacionadas ao DNA que está
sendo investigado e o resultado pode levar a conclusões erradas. Para diminuir os riscos deste
tipo de contaminação ao mínimo possível, os laboratórios devem ter cuidado no manuseio da
amostra, utilizando luvas, tubos descartáveis etc...O laboratório deve ter áreas separadas para
cada etapa do processo: para o preparo da amostra, da mistura de reacção, realização do
processo da reacção e análise.

Outro problema pode ser a presença, na amostra, de substâncias que, conhecidamente, inibem
a reacção (como exemplo a hemoglobina). Para isso a amostra deve ser devidamente tratada
para “limpá-las” destas substâncias.

O passo final é a análise do produto de reacção. Esta pode ser feita através de gel de
poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de agarose, corado por brometo de
etídio. Em qualquer uma delas, o material amplificado é visualizado como uma banda, a ser
analizada de acordo com o seu peso molecular.

2.4 Tipos de PCR

Existem vários tipos de reacções de PCR que possuem processos e finalidades singulares. A
descrição dos principais processos de reacção em cadeia da polimerase está descritos a seguir:

2.4.1 RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction):

É um processo constituído de duas etapas: uma transcrição reversa e a amplificação

propriamente dita. O diferencial deste procedimento é que a amostra fornece apenas um molde
de RNA, sendo necessário converter esse RNA em cDNA (DNA complementar) antes de
realizar a amplificação. A reação em cadeia da transcriptase reversa é muito útil, pois avaliando
o mRNA podemos detectar quais proteínas estão sendo efectivamente expressas.

O primeiro passo da reacção consiste na síntese de uma fita de DNA utilizando como template
uma fita de RNA numa reação catalisada por uma transcriptase reversa. Geralmente esta enzima
pode ser extraída de dois vírus: AMV (Avian Mieloblastosis Vírus) ou M-MuLV (Moloney

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Murine Laeukemia Vírus). Também são utilizados primers, inespecíficos e que se nunca
apresentam aos pares, compostos de varias timinas consecutivos (6 a 35), que são aneladas às
regiões Poly-A do RNA, ricas em adeninas. Após este ciclo tem-se o cDNA necessário para a
realização da PCR.

2.4.2 Multiplex PCR:

Nesta reacção mais de um segmento genómico é amplificado, cada um com seu par de
primeiros específicos. Este processo é útil para a introdução de um controle de reacção e para
simplificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores
genómicos devem ser analisados.

2.4.3 Nested PCR:

É a variação de PCR na qual são utilizados dois pares de primeiros para amplificar um mesmo
fragmento. Para melhorar a especificidade e a eficiência da reacção, o segmento genómico é
amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo sequências localizadas fora
dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real sequencia-alvo. Estas
duas etapas podem ser realizadas concomitantemente ou em duas reacções separadamente
(Semi-Nested PCR).

2.4.4 PCR Competitiva:

Nesta reacção além do DNA molde, é adicionado à reacção outro trecho de DNA, que possui
sequência, tamanho e concentração conhecidos (controle). As extremidades deste pedaço de
DNA são complementares também aos primeiros que irão amplificar a sequência-alvo. O
resultado é a amplificação de dois trechos de DNA: a de interesse e a controle. A amplificação
de controlo serve de padrão para a quantificação do DNA-alvo.

Desta forma, se conhecemos a quantidade final do fragmento controle e as condições da

reacção, podemos dizer o quanto de DNA-alvo foi amplificado.

2.4.5 AFLP:

Análise do polimorfismo dos fragmentos amplificados ou AFLP PCR foi originalmente

descrita em 1993. AFLP é um método muito sensível baseado na reacção de PCR para detecção
de polimorfismos no DNA. Também é usado para genotipagem individual de um grande
número de loci usando um número mínimo de reacções de PCR.

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2.4.6 Hot Start:

PCR Hot Start é o processo que permite a inibição da actividade da polimerase durante a
preparação para a reacção de PCR. Através da limitação da actividade da polimerase antes da
celagem do PCR, a Hot Start PCR reduz amplificações não especificas e aumenta o rendimento-
alvo do produto da PCR.

Este tipo de PCR é realizado pelo uso de modificações químicas incluídas, métodos de
barramento com ceras e inibição por anticorpos direccionados à enzima Taq.

2.4.7 PCR–colony:

O PCR-colony baseia-se na selecção de clones de bactérias (E. Coli), leveduras ou produtos de

plasmídeos. As colónias seleccionadas de bactérias ou leveduras são colhidas com um palito
estéril ou pipeta de uma placa de crescimento (agarose). Este é então inserido no máster mix
PCR ou pré-introduzido na água Auto lavada. A PCR é então conduzida para determinar se a
colónia contém o fragmento de DNA ou plasmídeo de interesse.

2.4.8 Real-Time PCR:

O PCR em tempo real é caracterizado pelo período de tempo, quando a amplificação do produto
da PCR de interesse é detectada antes mesmo da verificação da quantidade final do produto da
PCR acumulada depois da reacção, que continha um grande número de ciclos. Este tipo de
PCR, através do monitoramento da quantidade de fluorescência emitida durante a reacção de
PCR, funciona como um indicador de quantidade de amplificação de PCR que ocorre durante
cada ciclo de PCR. Portanto, em novas máquinas de PCR é possível acompanhar a reacção em
“tempo real”.

A PCR em tempo real ainda contém uma gama dinâmica muito maior de até 107 vezes, em
comparação a 1000 vezes na RT-PCR convencional, resultando em uma quantificação mais
precisa. A faixa dinâmica de um ensaio determina o quanto a concentração-alvo pode variar e
ainda assim ser codificado.

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2.4.9 Long:

Long PCR é a reacção que é mais extensa ou mais longa que o padrão da PCR, ou seja, mais
de 5 kilo bases. É geralmente útil somente se for de alta precisão, assim, misturas especiais de
polimerases proficiente juntamente com polimerases precisas são muitas vezes misturadas.

Este processo PE frequentemente usado para clonar genes maiores ou grandes segmentos de
DNA que a PCR convencional não consegue realizar.

2.4.10 Inverse:

PCR inversa ou também chamada IPCR, foi descrito pela primeira vez em 1988. A PCR padrão
possui a limitação de que é necessário conhecer as regiões laterais de sentido 5’ e 3’ do
fragmento de DNA de interesse. A PCR inversa permite a condução da reacção de PCR com a
informação apenas de uma sequência interna.

2.4.11 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorfism):

É uma reacção em que os organismos podem ser diferenciados pela análise de padrões derivados
da clivagem do seu DNA, ou seja, os comprimentos dos fragmentos produzidos pela clivagem
de uma endonuclease de restrição de dois organismo diferentes vai diferir quando o DNA for
digerido com uma enzima de restrição.

Para esta técnica é utilizada a metodologia de “Shouthern Blotting”, descrita e 1975, onde após
a restrição enzimática os fragmentos de DNA genómico são sujeitos a electroforese em gel e
posteriormente transferidos para um suporte solido de nitrocelulose através do arrastamento por
capilaridade. Após hibridização com sondas radioactivas este processo possibilita a
identificação, entre milhares de fragmentos de restrição obtidos, de sequências bem
determinadas.

2.5 Análise do produto da PCR :

O produto da reacção em cadeia da polimerase é analisado através da técnica de electroforese

em gel. Esta se vale do principio de que a carga global de uma fita de DNA é negativa, desta
forma, uma solução que possua íons livres e que tenha moléculas de DNA em suspensão pode
ser purificada ao se aplicar uma dada voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA
estarão próximas ao cátodo (positivo), atraente de moléculas de carga negativa.

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O objectivo desta técnica é separar os fragmentos por tamanho, já que a reacção gera
fragmentos de mesma extensão. A solução é “peneirar” o resultado da PCR por peneiras
moleculares. As cadeias são “empurradas” através da peneira pela corrente eléctrica, e de
acordo com o tamanho dos furos dela, elas serão retidas ou liberadas. A distância que o
fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros
fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. São os marcadores de tamanho
molecular (Ladders = Escadas), que são misturas de trechos de DNA com tamanhos variáveis,
normalmente equidistante entre si. Por exemplo, um Ladder de 50bp quer dizer na prática que
ele mostrará várias bandas, cada uma maior 50 pares de base do que a anterior (50bp,
100bp,150bp, 200bp, 250bp...).

Existem dois tipos de electroforese: Baseada em géis de agarose ou em géis de poliacrilamida.

As duas formam tramas de poros de tamanhos variáveis, possibilitando a separação dos
fragmentos, sendo que estas substâncias são dissolvidas numa solução-tampão electrolítica,
obrigatoriamente a mesma que recobrirá o gel na cuba de electroforese e possibilitará a
passagem de corrente eléctrica. Para impedir que a amostra comece a flutuar no tampão de
corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema, esta sofre uma mistura com outra
substancia tampão, com o objectivo de aumentar sua viscosidade.

Para a visualização do andamento da corrida utiliza-se um corante no tampão da amostra.

Usualmente, pode-se utilizar uma mistura de Azul de Bromofenol (Corante), Xileno-Cianol e
Glicose (aumentam a viscosidade), dissolvidos no tampão de corrida apropriado para cada
reacção.

Na cuba de electroforese aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel (entre 10 e

200V) e corrente de 50 a 3000mA. Quanto maior a concentração de gel maior a capacidade de
distinguir tamanhos próximos (definição), normalmente usa-se 0,5 a 3% de agarose. A
visualização dos produtos no gel após a corrida se dá pela reacção de ligação do DNA com
brometo de Etídio que possui a capacidade de inserir-se nas fendas da cadeia de DNA e
apresenta fluorescência quando excitado com radiação ultravioleta. Utiliza-se 10µg/mL de EtBr
no gel liquefeito antes da corrida.

Apesar da sua versatilidade e relativo baixo nível de dificuldade de realização, a electroforese

convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho, e não
quanto à sequência.
16
Conclusão

Técnicas precisas de diagnóstico são de suma importância para a prática clínica e pesquisas na
área da saúde, pois se bem desenvolvidas fornecem informações precisas. Com o advento do
teste PCR pode-se estudar o padrão de expressão génica, fazer sequenciamento directo de
produtos amplificados, detecção de mutações em genes, diagnóstico de doenças infecciosas,
detecção de bactérias, vírus, protozoários e parasitos, elucidar relações evolutivas entre espécies
e auxiliar na Medicina Forense.

A PCR pode amplificar qualquer sequência específica de DNA, a partir de amostras de

diferentes materiais biológicos como sangue, urina e outros fluidos corporais, cabelo e cortes
de tecidos (biópsias frescas ou em blocos de parafina). Amostras de microorganismos, células
animais ou vegetais, alguns deles com milhares, possivelmente até milhões, de anos de idade
podem, também, ser detectadas.

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Referencias Bibliográficas

BARTLETT, John M. S e STIRLING, David. PCR Protocols. 2ª edition. Humana Press.

CORRÊA, Elisete Marcia. POSSIK, Patrícia Abraão. A análise de DNA por

eletroforese.

GENESIS. Reação em cadeia da polimerase. Disponível em:

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