VIII- Fundamentos da Engenharia Genética - a técnica do PCR.

DNA fingerprint e os testes

de paternidade. Genética forense.

Reação de Polimerização em Cadeia- PCR

Técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA in vitro, ou seja, fora de um
organismo, com o uso de produtos químicos especializados, como reagentes e enzimas.
Geralmente, o objetivo da PCR é fabricar uma porção suficiente de DNA, para que esta
possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira. A PCR é usada em muitas áreas
da biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia molecular, diagnósticos médicos e
mesmo alguns ramos da ecologia.

Material necessário:
- sequências de DNA que se pretende amplificar;
- um par de iniciadores (primers: uma sequência curta de nucleotídeos que fornece
um ponto de partida para a síntese de DNA);
- os quatro tipos de nucleótidos;
- uma polimerase DNA (Taq);
- cofatores (são substâncias inorgânicas necessárias ao funcionamento das enzimas)
- solução-tampão que impeça variações de pH e que contenha Mg, ião essencial para
a atividade da polimerase.
- Termociclador

Taq polimerase
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA
polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. O DNA
polimerase utilizado no processo de replicação do DNA não resiste às altas temperaturas
envolvidas neste processo, logo foi necessário outra polimerase, como a Taq polimerase.
A Taq polimerase é uma polimerase extraída da Thermus aquaticus, uma bactéria que
habita fontes termais com água extremamente quente, resistindo às variações de
temperatura e contribuindo significativamente para o sucesso da técnica de PC (o
aquecimento para desnaturar as cadeias de DNA provocava a inactivação definitiva da
polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por ciclo de aquecimento).

Primers
Um primer é uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a
Taq polimerase que irá sintetizar o DNA. Numa reação de PCR, o pesquisador determina a
região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher.
Ambos os primers, quando ligados, apontam "para dentro" – isso é, na direção 5' para 3'
rumo à região a ser copiada. Como outras DNA polimerases, a Taq Polimerase só consegue
sintetizar DNA na direção 5' para 3'. Quando os primers são estendidos, a região que está
entre eles será, assim, copiada.

Etapas da PCR
Para realizar a reação são reunidos os materiais principais como o DNA, os nucleotídeos,
os primers e a Taq polimerase e de seguida passam pelas 3 etapas da PCR que formam um
ciclo que depois irá ser repetida até existir uma quantidade suficiente de DNA copidada. Em
média, o ciclo é repetido de 25 a 35 vezes.
As 3 etapas da PCR:
1. Desnaturação da dupla hélice - é conseguida com a incubação do DNA a uma
temperatura de 95°C, o que provoca a quebra das ligações de hidrogénio entre as 2
cadeias polinucleotídicas, formando duas cadeias simples
2. Emparelhamento dos iniciadores - diminuição da temperatura aproximadamente
para os 55°C, para ocorrer a ligação dos primers;
3. Polimerização (síntese) de DNA - ocorre a 70°C, temperatura óptima de actividade
da Taq polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e promove a
polimerização, com elongação da cadeia de DNA, servindo a outra como molde.

Este ciclo é repetido dezenas de vezes, para obter milhões de cópias de DNA, em poucas
horas e sem intervenção manual. No final, leva a produção de 2^n moléculas de DNA de
interesse, em que n representa o número de ciclos.

Um dos aspectos mais negativos desta técnica é a grande sensibilidade à contaminação

com DNA estranho, podendo ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA
estranho, amplificando sequências não pretendidas.

Aplicações das Técnicas de Engenharia Genética

PCR: Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo a partir de uma

quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado por exemplo em
técnicas de sequenciamento de DNA, o que permite a identificação, diagnóstico e
desenvolvimento de tratamentos para doenças. Como também permite a realização do DNA
fingerprint, ou seja, a impressão digital do DNA que permite diferenciar cada indivíduo.

DNA Fingerprint

● Apenas 3% do DNA humano possui genes ativos (DNA codificante), o restante é

formado por DNA não codificante (DNA lixo) e as sequências de DNA fingerprint são
obtidas a partir de sequências não codificantes, pois estas diferem de pessoa para
pessoa.
● No genoma humano existem locais onde se encontram sequências de bases
repetitivas, denominadas zonas de restrição, que são reconhecidas e cortadas por
determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos
cujas dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e
refletem as diferenças entre os alelos dos vários loci. Diferentes fragmentos de DNA
movimentam-se de modo diferente quando submetidos a eletroforese – técnica em
que determinadas moléculas são sujeitas à ação de um campo elétrico num meio
poroso, onde as porções se separam umas das outras e posteriormente podem ser
visualizadas com o aspeto de bandas. O resultado é um padrão de bandas,
semelhante ao código de barras, que difere de indivíduo para indivíduo.

Aplicações das Técnicas de Engenharia Genética

DNA fingerprint:

Investigação criminal, forense e histórica - a técnica permite partir de material biológico

deixado num local (cabelo, sangue, esperma...) e compará-lo com o dos suspeitos; permite
a identificação de cadáveres; construção de árvores genealógicas.

Determinação de paternidade - a comparação das impressões digitais genéticas dos

progenitores e do descendente permite excluir a paternidade ou confirmá-la com um
elevado grau de certeza.

Exemplos:

Na realização de um teste de paternidade deve

se considerar que a criança possui metade do
DNA da sua mãe e a outra metade do seu pai.
Deste modo ao analisar as bandas de DNA, se
uma delas não for encontrada na mãe, terá de
estar presente na do pai.

Neste caso o suspeito B é o pai biológico da

criança, pois as bandas de DNA da criança que
não são encontradas na mãe estão presentes no
suspeito B.

No caso de um estupro, os segmentos do DNA da vítima, do esperma e dos suspeitos são

preparados e separados por eletroforese, tendo-se obtido as bandas de DNA:

Neste caso, podemos perceber que o suspeito 2 é o

violador, pois a amostra de DNA encontrada na vítima
coincide com a deste suspeito.