Disciplina: Perícia Forense - Genética Forense

Aula 7: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e eletroforese

capilar – Parte I

Apresentação
Nesta aula, apresentaremos o histórico que permitiu o desenvolvimento da Técnica
de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e destacaremos os princípios gerais para o
funcionamento adequado dessa técnica

Para isso, apresentaremos o passo a passo que deve ser realizado durante os
procedimentos de PCR, que incluí ciclagens de desnaturação, anelamento e extensão
do DNA a fim de que ocorra amplificação de uma sequência gênica alvo, pela
utilização de oligonucleotídeos sintéticos, denominados primers. Também serão
apresentadas as diferentes modalidades dessa técnica que incluem, por exemplo,
PCR-RFLP e PCR-nested.

Objetivos
Identificar os princípios gerais e o funcionamento da técnica de PCR;
Demonstrar o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores para o uso em
PCR;
Listar alguns subtipos diferenciados de PCR.
Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain
Reaction) possibilita a multiplicação (amplificação) de pedaços (fragmentos)
específicos DNA, usando uma enzima específica denominada DNA
polimerase, a mesma que participa da duplicação do material genético
(DNA) nas células.

O desenvolvimento da técnica de amplificação

de segmentos de DNA, utilizando a PCR, trouxe
enormes perspectivas para a análise de genes,
diagnóstico de doenças genéticas, detecção de
agentes infecciosos e aplicações na
criminalística.


Saiba mais

A técnica de Reação em cadeia da Polimerase (PCR) revolucionou a

Biologia Molecular ao permitir que o DNA (ácido desoxirribonucleico),
presente em pequenas quantidades nas amostras biológicas encontradas
em locais de crime, fosse multiplicado (amplificado) em milhares de
cópias, com a finalidade de realizar análises mais detalhadas nesse
material. Para que isso fosse possível, algumas descobertas históricas
foram importantes nesse processo. Vamos estudar isto a seguir.
  Fonte: Connect world / Shutterstock

Histórico e Curiosidades da PCR

Em 1960, Arthur Kornberg’s, um bioquímico americano, isolou e
caracterizou uma enzima (proteína) denominada DNA polimerase, que é
fundamental durante o processo de duplicação do DNA.

O isolamento desta enzima possibilitou o desenvolvimento da síntese in vitro

de cadeias de DNA, ou seja, tornou possível produzir uma molécula de DNA
em laboratório (in vitro).

Após alguns anos dessa descoberta, já era possível sintetizar artificialmente

oligonucleotídeos, que são sequências curtas de nucleotídeos com as bases
nitrogenadas adenina, timina, guanina, citocina (exemplo hipotético:
ATTCTGAC). Esse tipo de síntese tornou-se rotina nos laboratórios de
pesquisa.

A partir desses conhecimentos prévios, Kary Banks Mullis (bioquímico

americano), em 1983, criou a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) e, em 1985, apresentou a mesma à comunidade científica com uma
publicação na renomada revista Science.

Essa técnica possibilitou a amplificação in vitro

de DNA e foi tão revolucionária que acelerou os
estudos de genomas de vários organismos, pois
possibilitou a clonagem e o sequenciamento de
DNA.
Paralelamente à descoberta de Kary Mullis, outros passos históricos foram
importantes para os avanços da PCR como uma importante técnica de biologia
molecular.

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Exemplo

Por exemplo, em 1986, foi descoberta a bactéria Termus aquaticus, que

recebe esse nome por ser um organismo aquático extremófilos, ou seja,
que sobrevive em temperaturas superiores a 100ºC.

Essa descoberta tornou possível a extração e isolamento da enzima DNA

polimerase desse organismo, que recebeu o nome de Taq (abreviatura do
nome da espécie da bactéria) polimerase.

Isso possibilitou o aperfeiçoamento da técnica, que não necessitava mais da

adição da enzima DNA polimerase a cada ciclo da reação, pois a enzima obtida
de Termus aquaticus suportava temperaturas muito altas, que rotineiramente
são utilizadas na PCR.

Atividade
1. Pesquise como foi a descoberta da enzima taq Polimerase de Termus
aquaticus.

Hoje é possível comprar na indústria, para o uso em laboratórios,

diferentes tipos de taq polimerase. Por isso, apresente também alguns
desses diferentes tipos de enzimas.

Linha do tempo da PCR

 1987
Em 1987, Karl Mullis e a empresa onde ele trabalhava, denominada
Perkin-Elmer Cetus. Também no ano de 1987, a empresa Perkin-
Elmer Cetus desenvolve a automação criando o equipamento chamado
de Termociclador, que controla o aumento e redução da temperatura
durante a execução da técnica.

1990
Em 1990, o primeiro kit de PCR forense, desenvolvido pela Cetus, foi
utilizado para a identificação humana individual. Isso permitiu que o DNA
fosse usado como evidência poderosa e aliado do sistema judiciário em
diversos casos criminais, trazendo importantes impactos na ciência
forense.

1991
A Perkin-Elmer Cetus em 1991, vende a patente para a empresa
Hoffmann-La Roche.

1993
Somente em 1993, Karry Mullis recebeu o Prêmio Nobel de Química
pela importante e impactante descoberta científica.

2003
Ao longo dos anos, vários subtipos de PCR foram sendo desenvolvidos e
mais recentemente, em 2003, houve o desenvolvimento da PCR em
Tempo Real, também chamada de qPCR, que permite o
acompanhamento em tempo real, pelo computador, da multiplicação do
DNA.

Princípio Gerais da PCR

A Reação em Cadeia da Polimerase permite que a partir de uma única cópia
de DNA, sejam obtidos milhões de cópias de DNA amplificadas (multiplicadas)
artificialmente.
Essa técnica recria em laboratório, o processo natural de replicação
(duplicação) da molécula de DNA. Porém, no caso da técnica, a amplificação
ocorre apenas em um fragmento específico do DNA e não na molécula toda.

Para que seja possível amplificar o DNA, alguns elementos são importantes. O
primeiro deles é a presença do DNA de interesse, que deve ter sido
previamente extraído, com boa qualidade, a partir de um dos tipos de
amostras biológicas presente em cenários de análises forenses.

Também se torna necessária a presença da

Enzima DNA polimerase, que recebe o nome
específico de Taq DNA polimerase, devido ao
organismo de origem da mesma.

Esta enzima sintetiza uma sequência complementar de DNA, ou seja, ela

adiciona nucleotídeos (Adenina, Timina, Guanina e Citocina), desde que exista
uma fita molde, como modelo. Recordando que existe complementariedade
das bases nitrogenadas entre Timina e Adenina; Guanina e Citocina.

Porém, é importante ressaltar que a Taq DNA polimerase só iniciará a ação

efetora de inserir nucleotídeos, quando um pequeno fragmento (sequência
com poucos nucleotídeos) já estiver ligado a uma das cadeias do DNA, no
ponto escolhido para o início da síntese.

Esse pequeno fragmento é chamado de iniciador ou primer, em inglês, e é

específico para o gene de interesse que se deseja amplificar.


Exemplo

Em uma situação hipotética, um pesquisador deseja amplificar o gene

humano que produz a proteína hemoglobina. Este deverá usar uma
sequência de iniciadores (primers) que seja específica para esse gene. É
 por isso que a PCR passa a ser uma técnica tão específica, pois só existe
amplificação na região do gene no qual o primer se liga.

Um fator importante é que, normalmente, são

utilizados dois primers, aos pares, por reação,
chamados de primers sense (forward) e
antisense (reserve). De modo que, um primer se
liga a uma das fitas moldes e o outro primer se
liga a outra fita original.

Assim, quando é preparada uma reação de PCR, é necessário misturar todos

esses elementos. Este passo inicial é conhecido no jargão laboratorial como
“preparação do Mix” de PCR, conforme ilustrado na imagem abaixo.

Durante a preparação do Mix de PCR é importante adicionar o DNA de

interesse; a enzima Taq polimerase e, junto com ela, o Cloreto de Magnésio
(MgCl2) — que é um cofator dessa enzima, ou seja, somente com a presenta
desse composto químico a enzima terá funcionamento adequado —, os
primers ou iniciadores, os nucleotídeos livres — conhecidos pela sigla dATP
(nucleotídeo de Adenina), dTTP (nucleotídeo de Timina), dCTP (nucleotídeo de
Citocina) e dGTP (nucleotídeo de Guanina) — e um tampão específico para
garantir que a reação ocorrerá em meio aquoso e com condições ideais, por
exemplo de pH.
Passo a passo
Após a união de todos os elementos necessários para que a PCR ocorra, é
necessário utilizar diferenças de temperatura para garantir que o DNA irá
“abrir” sua fita dupla com o aumento da temperatura e também permitir que
os primers se liguem em uma das fitas moldes.

É importante relembrar que esse processo ocorre naturalmente nas células.

Porém, para isso, existem várias enzimas (proteínas), que auxiliam na
duplicação do DNA.

Como em laboratório não é possível utilizar todas essas enzimas, com exceção
da DNA polimerase, essas moléculas foram substituídas por variações de
temperatura.

Nesse sentido, a reação ocorre em um

equipamento denominado de termociclador.

Como o próprio nome diz, este equipamento permite que ocorra inúmeros
ciclos com diferentes temperaturas, que ora aumentam e ora diminuem.

A imagem apresenta um dos modelos de termociclador. Nesse equipamento é

possível programar as temperaturas que serão utilizadas durante a reação de
PCR, bem como o tempo de cada uma delas e a quantidade de vezes (ciclos)
que o processo ocorrerá.
  Fonte: Cbbiotech
<https://portuguese.alibaba.com/product-
detail/clinical-chemistry-analyzer-dna-real-
time-pcr-machine-thermal-cycler-
60270074047.html>

Esse processo de mudanças de temperatura ocorre basicamente em três

passos sequenciais:

Desnaturação

Quando a temperatura atinge em média 95ºC. Nesse momento, no DNA,

que é fita dupla, há o rompimento das pontes de hidrogênio, separando
as duas fitas que servirão como molde para a produção de uma nova
molécula de DNA.

Anelamento

Quando a temperatura diminui, podendo normalmente variar entre 60ºC

e 65ºC. Nessa etapa, o primer (iniciador) consegue se anelar, ou seja, se
ligar à fita de DNA molde, baseado no princípio da complementariedade
de bases.
 Extensão

A temperatura volta a aumentar para em torno de 70ºC. Nessa

temperatura, a enzima Taq DNA polimerase começa a adicionar
nucleotídeos para formar a nova vida de DNA a partir da fita molde
original.

Esquema dos passos realizados de maneira sequencial em uma reação de

PCR. Após a desnaturação das fitas-molde representadas em vermelho, ocorre
o pareamento dos primers (fragmentos representados em verde e azul). A
enzima, representada em verde, adiciona os nucleotídeos (A; T; C; G)
complementarmente às fitas originais.

 Fonte: Apostila Técnicas de PCR: Aplicações e

Padronização de Reações. Disponível neste link
<http://www.imt.usp.br/wp-
content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf>
.

Após a finalização de uma reação de PCR, onde a figura mostra as duas fitas
originais (em vermelho) pareadas com as suas fitas-filha complementares,
sintetizadas a partir da adição dos nucleotídeos pela Taq DNA polimerase.
  Fonte: Apostila Técnicas de PCR: Aplicações e
Padronização de Reações. Disponível neste link
<http://www.imt.usp.br/wp-
content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf>
.

É importante ressaltar que a amplificação do DNA é exponencial, daí a

necessidade de se realizar vários ciclos de:

DESNATURAÇÃO

ANELAMENTO

EXTENSÃO

Dessa forma, a partir de uma única molécula de DNA são produzidas duas
novas moléculas filhas; das duas moléculas filhas são produzidas quatro novas
moléculas e assim por diante. Isso justifica o fato de, no final da reação,
serem obtidas milhões de cópias do DNA a partir de uma única molécula
inicial.
  Esquema representativo para demonstrar a
amplificação exponencial do DNA em uma PCR. 1
origina 2 moléculas; 2 origina 4 moléculas; 4
origina 8 moléculas e assim por diante.

Tipos de PCR: PCR-RFLP e PCR

nested
Com a evolução da técnica de PCR e com o crescimento contínuo das
aplicações que essa técnica permite, surgiram uma infinidade de métodos
complementares a partir do entendido básico de PCR. Assim, foram criados
novos tipos de PCR, como, por exemplo, PCR-RFLP e PCR nested.

PCR-RFLP

A ciência forense, por muito tempo, utilizou a técnica de RFLP

(Polimorfismo no Tamanho do Fragmento de Restrição) para montar os
códigos de barras individuais do DNA de interesse, também chamado de
DNA fingerprint.

Porém, o processo de obter os resultados utilizando apenas RFLP é

bastante laborioso e utiliza componentes radioativos.

Com o advento da PCR, foi possível unir as duas técnicas, nascendo,

assim, a chamada PCR-RFLP.

Assim é possível amplificar um gene específico por PCR e,

posteriormente, colocar o produto obtido da PCR em contato com
enzimas de restrição para verificar se estas cortam ou não aquela região
específica.

Por fim, para visualizar essas diferenças, é necessário fazer uma

eletroforese em gel de agarose para confirmar presença e ausência
de bandas de DNA, bem como a quantidade dessas bandas.

Inicialmente, é amplificado um fragmento de 400 pares de bases por

PCR. Logo após o corte pela enzima de restrição, que só reconhece como
local de corte, nesse caso, a sequência GAATTC, podem haver diferentes
possibilidades apresentadas no gel de agarose:

1. O indivíduo AA é homozigoto, ou seja, os seus dois alelos do gene

possuem o local de corte da enzima de restrição e, por isso,
apresenta duas bandas, sendo uma de 300pb e outra de 100pb;
2. O indivíduo AB é heterozigoto, ou seja, possuí dois alelos diferentes,
em um deles tem o sítio para o corte com a enzima de restrição e
no outro não. Por isso, aparecem três bandas, duas delas de 300pb
e 100pb correspondentes ao alelo onde houve o corte com a enzima
de restrição e uma banda de 400pb referente ao alelo que não
possuí o sítio de restrição;
3. O indivíduo BB é homozigoto e possuí dois alelos que não
apresentam local de corte para enzima de restrição. Por isso que,
nesse caso, há a formação de uma única banda com o tamanho de
400pb.

PCR Nested

Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o fragmento

daquela região específica do DNA é amplificado inicialmente utilizando
um primer que reconhece uma região mais abrangente do gene,
copiando até mesmo sequências localizadas fora dessa região.

Com o produto amplificado dessa primeira reação de PCR, é realizada

uma nova amplificação agora utilizando primers específicos para
sequência-alvo.

Por isso, a técnica é chamada de PCR nested, ou seja, fazer uma nova
amplificação a partir de um produto que já foi amplificado anteriormente.

Este tipo de reação tem como vantagem o ganho em especificidade e

eficiência, uma vez que o DNA-molde da segunda amplificação está em
concentrações altíssimas, e os primers da segunda etapa têm menos
chances de anelamento em sequências inespecíficas.

 Fonte: Apostila Técnicas de PCR: Aplicações

e Padronização de Reações.

Esquema de uma reação de PCR nested. O produto da amplificação do 1º

Round (etapa) é utilizado como molde no 2º round (etapa). No final das
duas etapas, obtém-se um produto menor daquele obtido na primeira
amplificação.

Atividade
2. Pesquise quais outros tipos de PCR podem ser utilizados na genética
forense.
3. Durante a reação de amplificação (multiplicação) do DNA por PCR
existem três passos que ocorrem em sequência devido às mudanças de
temperatura no equipamento conhecido como termociclador. Quais são
esses três passos em sequência?

a) Desnaturação, Anelamento e Extensão

b) Extensão, Desnaturação e Anelamento
c) Desnaturação, Anelamento e Expansão
d) Desnaturação, Amplificação e Extensão

4. Só é possível amplificar o DNA em laboratório pela obtenção de uma

enzima específica e pela utilização de oligonucleotídeos iniciadores
sintéticos. Como é chamada a enzima e os iniciadores?

a) Helicase e primers
b) DNA polimerase e sonda
c) DNA polimerase e primers
d) RNA polimerase e primers
 5. Existem diversos subtipos de PCR. Uma dessas versões é aplicada nas
análises forenses e utiliza enzimas de restrição, após a amplificação, para
detectar variações entre os indivíduos. Qual é esse subtipo de PCR?

a) PCR-RAPD
b) PCR-RFLP
c) PCR-Nested
d) PCR em tempo real

Referências

FARAH, S. B. DNA segredos e mistérios. 2. ed. São Paulo: Sarvier, 2007.

GARRIDO, R. G. & RODRIGUES, E. L Ciência forense: da cena do crime ao

laboratório de DNA. 1. ed. Projeto Cultural, 2014.

Próximos Passos

Outros tipos de PCR: multiplex, PCR em tempo real, hot start;

Sequenciamento de DNA;
Eletroforese capilar.

Explore mais

Assista aos seguintes vídeos para complementar os assuntos estudados nesta aula:

PCR Reação em cadeia da POLIMERASE

<https://www.youtube.com/watch?v=T2XGEE0wHRA> ;
Extração de DNA, PCR, Eletroforese - Genotipagem ACTN3 (alelos R e X);
<https://www.youtube.com/watch?v=I3BIMKNbZL0>
Como solucionar crimes usando DNA
<https://www.youtube.com/watch?v=rdoFwlPepdk> .