BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA

Sistemática dos processos fermentativos:

Engenharia mecânica: componentes do sistema  interação dos componentes
 sistema
Engenharia metabólica: genômica (estuda o genoma), transcriptoma (RNA),
proteoma (proteína), metaboloma (quantificação de meabólitos), interatoma
(relaciona as informações anteriores), biologia sistemática (estuda os sistemas)

HISTÓRICO
Revolução biotecnológica  anos 60 e 70 com grandes avanços na biologia
molec, celular, bioquim e engenharia.
Otimização da manipulação genética de microrganismos (DNA recombinante)
A nova biotecnologia utiliza células e molec biologicas para a solução de
problemas ou produção de produtos uteis
As moléculas mais utilizadas são ác nucleicos (DNA e RNA) e proteínas
(enzimas). Os carboidratos são importantes no reconhecimento celular e
molecular (ex: interação Ag-Ac)
As células mais utilizadas podem ser oriundas em cultura, microrganismos
(bactéria, levedura...)

Todo o conhecimento cientifico adquirido (basicamente realizado em

universidades – meio acadêmico) em conjunto com instrumentos
biotecnológicos geram aplicações em várias áreas, como agricultura, meio
ambiente e medicina

EXEMPLOS DE APLICAÇÕES BIOTECNOLOGICAS

Ac monoclonais (MCA) – tanto para diagnostico e terapêutica (teste de
gravidez [hormônio produzido pela placenta], detecções de cél cancerosas
[tratamento de CA: MCA + radioisótopo  diminui efeitos de radioterapia])
*no caso da quimio, adiciona o fármaco no MCA, direcionando-o para um local
específico
Tecnologia de bioprocessamento  utiliza cél vivas ou componentes de sua
maquinaria bioquímica para sintetizar produtos, degradar substancias e
produzir energia.

Cada microrg, dependendo de suas condições de crescimento, seguirá uma

rota metabólica

Aplicações médicas  cultura de cél tronco embrionárias; tecnologia de

engenharia de tecidos e órgãos; tecnologia de biosensores

DNA RECOMBINANTE  ligação ou recombinação de material genético de

duas origens diferentes.
Ex: crossing over entre cromossomos homólogos do pai e mãe durante a
formação de gametas; fusão do óvulo e espermatozoide; troca de material
genético (conjugação e transformação)
*inserção do cód genético produtor da insulina em E. coli para produção de
insulina pela bactéria

Dogma central da bio molec: DNA  RNA  Proteina

Cél procariótica não possui DNA nuclear – síntese de mRNA e proteínas
ocorrem no mesmo espaço.
Em eucariotos, no mRNA os íntrons e éxons estão todos unidos. Esse
complexo devem ser processados, onde junta os éxons e descarta os íntrons.
Isso ocorre para a tradução e formação de proteína. Procariotos não possuem
íntrons.
Depois da tradução ocorre transformações pós-traducionais, onde ocorre a
formação tridimensional e (se necessário) a adição de outras moléc como
lipídios - lipoprot. e açúcares – glicoprot - através de enzimas. Quando se
coloca uma proteína para produzir em bactéria, ela deve suprir as ações do
organismo humano sobre a formação de todos os aspectos da proteína (ex:
uma bactéria não consegue inserir moléc glicolíticas necessárias para a
proteína ter sua ação)

Engenharia genética  enzimas de restrição (endonucleases)*  clivam o

DNA em pontos específicos, onde essas enzimas reconhecem características
de um ponto e “cortam” o DNA. Após, a DNA ligase permite a religação das
moléc de DNA
*existem mais de 1000 endonucleases para serem utilizadas in vitro. Cada
enzima possui um sitio de reconhecimento onde agirá
Microrg produzem endonucleases para defesa contra outros microrganismos

Com uma mesma enzima de restrição, é clivado o DNA do microrg (plasmídeo)

e o DNA da cél humana (a enzima cliva no mesmo ponto de restrição). Isso
permite que ocorra a ligação da parte removida da cél humana na região que
foi clivada do DNA do microrganismo (ocorre por complementariedade – pontes
de H - e pela DNA ligase. Assim ocorre a formação de um DNA híbrido. Pode
ocorrer a religação do DNA do microrganismo
São utilizados marcadores seletivos para obter somente o plasmídeo
modificado que se deseja. São colocados propositalmente sítios de restrição no
plasmídeo. O DNA que quer ser inserido foi cortado pela endonuclease que
também corta o sitio de restrição colocado de propósito no outro DNA, fazendo
com que o DNA clivado seja adicionado no DNA desejado.
Plasmideo – DNA circular extracromossomal – a cél humana não possui DNA
circular, tornando uso de microrganismos vantajosos p/ industria. Quando não
possível, é recomendado o uso de vírus (modificados geneticamente, que
infecta a célula humana e o RNA gera DNA que pode integrar no genoma
humano)

PCR  Reação de polimerase em cadeia  amplificação in vitro de uma

região específica de DNA
Permite a identificação de TAQ-polimerase (DNA polimerase termo-resistente)
Nº de erros são pequenos – 1 a cada 109
Extensão (72ºC)  cerca de 1Kb/min
Aplicações  diagnostico e acompanhamento de patologias...

Produtos utilizados – in vitro: DNA molde; par de primers; TAQ polimerase;

dNTP’s (dinucleotideos tri´fosfatos; termociclador (varia a temperatura
CICLO 1  É selecionado a sequência do DNA desejada para amplificação.
Com o aumento de temperatura, ocorre desnaturação do DNA (95ºC). A 60ºC*
(temperatura de anelamento. permite a ligação do primer a sequencia
genética), são utilizados os primers (oligonucleotídeos de síntese química que
são complementares a sequência que se deseja amplificar) que são
necessários para uma amplificação específica e segura. A temperatura sobe
para 72ºC para permitir a ação da TAQ polimerase, que irá sintetizar as novas
fitas. A temperatura controla a síntese, permitindo uma síntese mais específica.

CICLO 2  aumenta a temp para 95ºC para ocorrer a desnaturação do DNA, e

com a diminuição da temperatura (60ºC) ocorre a adesão dos primers (tanto no
DNA molde quanto na sequencia produzida). A temperatura sobe para 72ºC
para permitir a ação da TAQ polimerase,

CICLO 3  mesmo ciclo 2

São feitos até 35 ciclos

No decorrer dos ciclos, consegue promover o aumento da predominância da

sequência desejada, com o tamanho exato do produto desejado. Quando
formado o DNA alvo puro, ele aumenta exponencialmente de acordo com cada
ciclo.

*Para cada sequência de DNA possui pares de primers, exatamente

complementares com as extremidades da sequência do DNA. O tamanho do
primer depende do tamanho da sequência que se deseja amplificar. Cada par
de primer tem uma temp de anelamento (TM) diferente. Deve saber qual é a
ideal. Primer que tem muito G-C tem temp de anelamento mais alta devido G-C
ter tripla ligação e precisar de mais energia para ocorrer a quebra, e A-T ter
dupla ligação. Os primers utilizados devem ter TM semelhante pois o
termociclador utilizará uma única temperatura

ELETROFORESE  gel de agarose prende as moléculas maiores e permitem

a passagem de moléculas menores. O DNA possui cargas negativas (devido
grupos fosfatos), e no gel aplica-se uma carga fazendo com que o DNA migre
para próximo à carga positiva.
O DNA é corado para ser visualizado no gel (brometo de etídio intercala nas
fitas de DNA, permitindo a visualização por luz UV – DNA de cor rosa ou
alaranjado) o brometo de etídio é muito cancerígeno, sendo substituído por
outros produtos

RT-PCR  Usa a enzima transcriptase reversa (transforma RNA em DNA)

Aplicações  quantificação (expressão gênica), clonagem, biblioteca de cDNA;
sondas
SEQUENCIAMENTO DE DNA  modificação da PCR.
Na ligação fosfodiéster (formação do DNA), os dNTP’s formam as ligações dos
nucleotídeos. Os ddNTP’s (dideoxinucleotideos) não possui hidroxila que é
necessária para a ligação do próximo nucleotídeo. Quando d ddNTP é
incorporado, impede a adição do outro nucleotídeo (impede a ligação
fosfodiéster), impedindo o crescimento do DNA.
Foram desenvolvidos 4 diferentes ddNTP’s. São feitas 4 PCR, cada um com
um ddNTP. No processo do ciclo, após a adição do ddNTP (aleatoriamente) na
fita, interrompe a ação da TAQ polimerase. Isso permite a formação de várias
sequências genéticas (várias fitas molde).
Para realizar a eletroforese, o gel precisa de um alto poder de resolução. É
feira a eletroforese capilar, onde a amostra passa por alta pressão por um
polimero de acrilamida. Após revelação, ocorre a separação de cada sequencia
separadamente de cada ddNTP. Assim é feita a leitura sequencial do DNA
molde, do menor para o maior

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

HISTORICO
Cana-de-açucar é trazida da ilha da Madeira em 1532, interligação das
industrias de açúcar e álcool no BR
Crise internacional de 29  instalação da 1’ destlaria de álcool anidro (1931).
Decreto 19.717: mistura de 5% de etanol na gasolina
Crise internacional do petróleo (1974)  criação do programa Proalcool. Em
poucos anos a prod Brás sobre de 700kkL/ano para 15kkkL/ano

A partir de GLC ou frutose (sacarose é a principal fonte de açúcar da cana)

forma o piruvato, que pode passar pela fermentação alcoólica, lática, acética e
butírica

VIA FERMENTATIVA DE PRODUÇÃO DE ETANOL

3 fases:
 Preparo do substrato  Brasil é privilegiado pela extensão, diversidade
de climas e de solos
 Fermentação  transformação dos açucares fermentáveis (que a
levedura é capaz de fermentar) em etanol e CO2
 Destilação  separa o etanol d osubstrato fermentado (mistura
hidroalcoolica com aldeídos, alcoóis superiores e ác organicos).

SUBSTRATO
Matérias primas  é preciso considerar seu volume de produção, rendimento
industrial e custo de fabricação (produção)  isso impacta no preço do
combustivel
*é mais barato obter álcool da cana do que do milho. O milho é rico em amido,
e a levedura não possui enzimas aminoliticas. É preciso colocar essas enzimas
para degradar o amido em sacarose (sacarificação) e aí fermentar o açúcar. Da
cana extrai o caldo que é rico em sacarose, e a levedura fermenta facilmente a
sacarose.
*a levedura também não tem enzimas celulolíticas para quebrar a celulose,
tendo que também passar por um tratamento antes da levedura fermentar. A
celulose Tb está misturada com outras substancias da planta, como a lignina,
que possui pentoses e hidrocarbonetos que inibem a ação das leveduras

Classificação
 Matérias açucaradas (cana, sorgo sacarino)
 Matérias amilaceas e feculentas (grãos amilaceos)
 Matérias celulosicas (palhas, madeiras)
No BR temos destaque para a cana desde os tempos de colônia e atualmente
milho, mandioca e materias celulósicas mostram potencial.
A composição das matérias primas varia com a idade, região, condição
climática, colheita, transporte, armazenamento e industrialização

Tipos de substratos
Melaço  resíduos da classificação do açúcar que não são mais utilizados
para a sepaaração da sacarose
Composto por 62% de açucares, 20 de água, 8 de cinzas, 3 de matérias
nitrogenadas e 7 de outros  varia de acordo com o processo de produção do
açúcar. Em geral, o melaço tem cerca de 50% de açucares fermentáveis*
*o melaço tem que ser diluído para ser fermentado, pois a osmolaridade de
açucares é muito alta para a levedura

Cana-de-açucar  o açúcar redominante é a sacarose (GLC + frutose)

Composto por 74.5% de água, 14 de açucares (12.5 de sacarose, 0.6 de GLC
e 0.6 de frutose), 10 de fibras
A cultura de cana é produtiva por 3 anos consecutivos. A media do rendimento
agrícola esta entre 85-100t por ha, decrescendo anualmente
Composição do caldo: 78-86% água, 10-20 de sacarose. O pH varia de 5.2 a
6.8. em media 850L de caldo são obtidos por tonelada. Esse valor depende do
preparo da cana para moagem, numero de esmagamentos e porcentagem de
embebiçao usada (a embebição extrai mais sacarose, mas dilui o caldo normal
 em consequência, aumenta o gasto de vapor).
 Conservação  deve-se cokher e moer a cana o mais rápido possível,
sendo o ideal faze-lo no mesmo dia. Admite-se 3 dias de conservação
para a cana colhida sem queimar, as que são quemiadas tem período
ainda mais curto
 Riscos durante conservação  deterioração física, química, enzimática
ou microbiana, que prejudicam a futura fermentação do caldo
*não tem como esterilizar o caldo. A cana é lavada antes de ser processada,
mas isso não retira os microrganismos, que podem competir com as leveduras
pela sacarose e diminuir o poder fermentativo (passa por estresse. Hj as
leveduras estão sendo preparadas para suportar o estresse da competição
com outros microrganismos).
Outros substratos, como o milho e cereais, podem ser armazenados por longos
períodos em silos de diversos tipos onde a umidade e temperatura podem ser
controlados
*o milho tem tanto material fibroso que quando centrifugado para separar o
etanol, as leveduras ficam presas nas fibras, não podendo reaproveita-las.

Milho  composto por 9-15% água, 59-70 de ede extrativos não-nitrogenados,

5-15 de material proteico
Produz media de 3t/há
Milho sacarino: variedade de milho que armazena sobretudo sacarose em seu
colmo. Os sólidos totais do caldo de colmo chega a 18ºBrix

Sorgo sacarino  algumas variedades acumulam altas concentrações de

sacarose em seu colmo. Entretanto, o período agrícola e de colheita é inferior
ao da cana levando a problemas de utilização industrial continuada.

Mandioca  67-75% água, 18-23 de fécula mais material proteico, celulose,

cinzas. Teores de amido podem passar de 30%
O volume de álcool produzido por tonelada de mandioca é superior ao
produzido por tonelada de cana. No BR é utilziado a cana pois a mandioca
demora muito para ser produzida, tornando inviável economicamente.

Resíduos celulósicos  palhas, folhas, resudos de exploração madeireira e

agricula.
Dificuldades  preparação do mosto, presença de ele/tos tóxicos nos
substratos hidrolisados de celulose (lignina), baio rendimento de açucares
fermentáveis
*a fermentação de celulose foi melhorada devido a produção de leveduras
resistentes ao acido acético (0,9% de ác acético já atrapalha a fermentação da
levedura)

Outras matérias primas  arroz, centeio, cevada, milheto, trigo, batata, batata-
doce
Possuem baixa produtividade agrícola, competição por fontes alimentares

PREPARAÇÃO DOS MEIOS

No Brasil a maior parte do bioetano é produzido a partir do melaço e caldo de
cana, sendo a sacarose o principal açúcar. Os mostos requerem preparação
previa adequada antes de serem transferidos para as dornas (recipientes de
fermentação). O preparo dos mostos faz-se em tanques de medição, balanças,
diluidores mecânicos, depósitos de sais minerais e antisepticos, aquecedores e
resfriadores, medidores de ácidos e outros acessórios.

Preparação dos mostos de melaço  obtem pela diluição em água. Os

melaços são diluídos a concentrações finais de 15-25ºBrix.
Os mostos muito diluídos fermentam mais rapidamente (ler sobre alta
osmolaridade anotado mais pra cima), sujam menos os aparelhos de
destilação, exigem maior volume de fermentadores, mais consumo de vapor,
exige período maior de safra, mais água para diluição e favorecem as
infecções (contaminações)
Os mostos mais concentrados tem fermentação mais demorada e/ou
incompleta, temperaturas mais altas durante a fermentação (a temperatura
ótima da levedura é 30ºC. a variação de temperatura causa estresse térmico
na levedura, podendo levar a sua morte), sujam mais os aparelhos de
destilação, exige menor volume útil de dornas, menor consumo de vapor e
periodo de safra

Preparação dos mostos de caldo de cana  o caldo obtido pela moagem da

cana pode ser utilizado para fermentação diretamente (caldo bruto) ou diluído e
clarificado. A clarificação por meio de aquecimento, decantação e filtração
separa coloides, omas e materiais nitrogenados, evitando a formação
excessiva de espuma e sujando menos as colunas de destilação.

Preparação dos mostos de materiais amilaceos  sacarificação dos grãos

(amilaceos) e raízes e tubérculos (feculentos). Os agentes fermentadores NÃO
possuem enzimas amiloliticas. A sacarificação transforma o amido ou fécula
em açucares fermentáveis, por via biológica ou ação direta de enzimas

Preparo do malte  Malte e um cereal germinado em condições especiais de

umidade, temperatura e aeração. Durante a germinação ocorrem modificações
físicas, químicas e bioquim no cereal
Passos:
 Limpeza e classificação dos grãos em peneiras, ventiladores, aparelhos
magnéticos e classificadores
 Maceração – com água limpa entre 10 e 12ºC na poporção 1:3 de água.
Renovação do liquido a cada 8-12h e arejamento da cuba. A operação
acaba quando os grãos tiverem absorvido água a 40-50% do seu peso
 Germinação  uma serie de enzimas atam (amilofosfatase,
amilopectinase, alfa-amilase, beta-amilase, maltase). Realiza-se em
saloes próprios (germinadores) onde a temp e umidade são controladas
(15ºC)
Sacarificação  o malte é hidratado e cozido (55-65ºC) por 13-15h. o principal
açúcar liberado é a maltose (dissac de GLC)
*a sacarificação microbiana utiliza fungos com propriedades amiloliticas
(Aspergillus oryzae). Nesse caso o fungo e a levedura selecionada são
utilizados em associação.

Preparo do inoculo  incuba-se esporos de levedura selecionada em meio

contendo fonte de carbono, nitrogênio e micronutrientes a 30ºC por 2-3dias. O
volume de cel utilizadas nos fermentadores corresponde a 10-20% do volume
total do fermentador.
A levedura se multiplica por esporulação.

FERMENTAÇÃO ALCOOLICA
Rota bioquim:
Piruvato  piruvato descarboxilase (libera CO2)  aldeído acético  álcool
desidrogenase (NADH em NAD+)  etanol  biocombustível ou bebidas
*a industria de bebidas está interessada no etanol produzido e nos metabolitos
secundários, que serão responsáveis por dar o aroma e sabor da bebida.
ESTEQUIOMETRIA
1 mol GLC (180g)  2 mols etanol (92g) + 2 mols CO2 (88g)
*nunca é 100% (as leveduras usadas atualmente produzem 88-92% de
sacarose em etanol), pois a glicose tb é utilizada para produção de ATP,
biossintese – multiplicação da levedura. O glicerol Tb é produzido em paralelo
com o etanol.
* a [glicose] na fermentação determina quando já está bom para ir para a
destilação.

Se um fermentador contend 100mL de GLC 30% perde 5g de peso nas

primeiras 24h de fermentação, qual a porcentagem de GLC inicial consumida?
 VER SLIDE

O agente fermentador em destaque é a Saccharomyces cerevisiae.

 Não-patogênica
 Unicelular com diferentes ploidias
 Primeiro eucarioto a ter o genoma sequenciado
 Organismo modelo para estudos bioquim e genéticos
 Aplcação industrial: panificação, cervejaria, vinho e biocombustíveis
(bioetanol, biodiesel e alcoóis superiores como o isobutanol)  algumas
cepas toleram até 21% de etanol (v/v) (no BR a fermentação fina está
entre 8 e 12% v/v – acima de 12% o etanol começa a ficar toxico)
 Produção de proteínas heterólogas e biofármacos (insulina e vacinas de
DNA).

A transformação do açúcar em etano e gás carbônico envolve 12 reações em

sequencia ordenada, cada qual realizada por uma enzima especifica. A
fermentação alcoólica forma ATPs que são utilizados pelas cel para os
diferentes trabalhos celulares. O etanol e gás carbônico são excretados.

FERMENTAÇÃO ALCOOLICA
Glicose  etanol + Co2
O etanol é tóxico também as leveduras em altas concentrações. Portanto a
“domesticação” delas para uso industrial passou por adaptações evolutivas que
aumentaram sua robustez contra situações fermentativas estressantes.
Produtos secundários da fermentação  relacionados direta ou indiretamente
a adaptação e sobrevivência (glicerol, ác orgânicos – succínico principalmente,
alcoóis superiores, biomassa, etc)
*no inicio da produção de etanol no BR fez perceber que com o tempo as
leveduras utilizadas foram sendo substituídas por leveduras selvagens de
acordo com o decorrer das fermentações. Isso fez com que fosse descoberto
várias outras leveduras fermentadoras mais “potentes”.
Ex: VRI (2n), PEZ (2n), CAT1 (2n), FTSS8L (3n) – leveduras haploides
geralmente não são usadas pois as haploides sofrem mutações facilmente com
a aplicação de estresse. A triploide geneticamente resiste mais

O glicerol é o produto secundário mais abundante. Importante para a

manutenção do equilíbrio REDOX celular e resposta ao estresse osmótico
(quando concentrações elevadas de açúcar sao utilizadas no mosto – aumenta
osmolaridade intracelular e evita a perda de água).
Ác succínico  teria um efeito antibacteriano juntamente com o etanol,
evitando contaminações.

FATORES QUE AFETAM A FERMENTAÇÃO ALCOOLICA

Podem diminuir a eficiência fermentativa, diminuindo a formação de etanol e
aumentando a produção de compostos secundários

Agente fermentador
A levedura Saccharomyces cerevisiae e espécies evolutivamente próximas são
as mais utilizadas em fermentação alcoólica. Bactérias, entre as quais a
Zymomonas mobilis são capazes de produzir rtanol mas não tão eficientemente
como as leveduras.
O desempenho do processo fermentativo é enormemente afetado pela
levedura que realiza a fermentação.
Leveduras selvagens encontradas na região da destilaria podem ser isoladas e
selecionadas para ID de uma cepa (linhagem) que apresente o fenótipo
desejado. Entretanto muitas leveduras selvagens podem acarretar problemas
na fermentação (baixo rendimento, formação excessiva de espuma e
floculação – leveduras se agrupam em formato de cacho de uva, sedimentando
e diminuindo o contato com a glicose). Ex: usinas que se localizam em altas
temperaturas precisam de leveduras termorresistentes, onde cepas de
leveduras selvagens termorresistentes ajudam a modificar a levedura utilizada
para a fermentação alcoólica.

*as bolhas de CO2 que saem do fermentador auxiliam a “misturar” novamente

as leveduras, auxiliando na fermentação.
* a flotação ocorre quando tem a liberação excessiva de espuma. As células
começam a passar do meio de cultura para a espuma, perdendo o contato com
a glicose. Isso Tb favorece contaminação

Nutrição mineral e orgânica

 Fonte de carbono – ex: GLC
 Fonte de nitrogênio: a levedura S. cerevisiae utiliza nas formas
aminuacal (NH4+), amidica (ureia) ou aminica (AA)
 Vitaminas (tiamina e ác pantotênico)
 Micronutrientes: P, K, Ca, Mg, SO4-, Na
Isso varia de levedura para levedura. Cada uma varia a quantidade e tipo de
nutrição.

Temperatura
As leveduras sao mesófilas (tem ótima entre 25-35ºC). Maiores que 35
diminuem a viabilidade celular (por maior toxidez ao etanol Tb) alem de permitir
maior perda de etanol por evaporação em dornas abertas.

pH
As fermentações se desenvolvem em uma faixa de pH entre 4 e 5.5. Os
mostos industriais geralmente tem pH entre 4.5 e 5.5, com boa capacidade
tamponante. No bioetanol brasileira faz-se a lavagem das células (1h) a cada
ciclo fermentativo em pH ácido (2 a 2.5) no intuito de se reduzir a contaminação
bacteriana. Ao final da fermentação alcoólica o pH varia entre 3.5 e 4
normalmente – ocorre uma acidificação ocasionada pelos ác succinico, acético
e alguns orgânicos, e a formação d eum gradiente de prótons que a levedura
cria durante o processo fermentativvo (a levedura tem uma boba de prótons –
próton-ATPse para jogar os prótons para fora da célula, acidificando o meio.
Ela cria um gradiente eletroquímico – o lado de fora fica mais positivo e o intra
fica negativo – isso facilita o transporte da glicose para dentro da levedura.

Inibidores da fermentação
O próprio etanol é um inibidor do processo fermentativo a me Dida em que ele
se acumula nas dornas. Alem disso, outras substancias podem afetar
negativamente o processo fermentativo (ex: alumínio e sufito) – regiões com o
solo rico em Al passa o minério para a cana, e o caldo vai ter o Al, que inibe
varias enzimas importantes para o processo fermentativo

Concentrações de açucares
Aumentando-se a concentração de açucares aumenta-se a produtividade de
etanol ate um limite que varia de acordo com a levedura empregada. Elevados
teores de açúcar ocasionam estresse hiperosmotico, que leva a maior
produção de glicerol e menor rendimento alcoólico.

Concentração do inoculo
Maiores concentrações de levedura na dona permitem fermentações mais
rápidas, com maior produtividade e maior controle sobre bactérias
contaminantes, alem de restringir o crescimento da própria levedura
(biomassa). As dornas tem entre 10-20% de biomassa, variando a viabildiade
celular da mesma durante a safra – essa proporção é próxima da máxima do
crescimento ótimo da levedura, evitando que a levedura se multiplique e
consuma a glicose em vez de transformá-la em etanol
Para a multiplicação celular, o oxigenio é indispensável para a multiplicação da
levedura. Quando não se quer multiplicação, coloca-se em situaçãod e
anaerobiose. A formação de CO2 na produção de etanol traz o
desfavorecimento de multiplicação da levedura, tendo pouco O2 solubilizado no
fermentador

Contaminação bacteriana
Como a fermentação industrial, pela dimensão do processo não pode ser
realizada em condições de completa assepsia, ocorrem contaminações
bacterianas, principalmente de Lactobacillus e Bacillus. A contaminação
aumenta o tempo de fermentação e diminui o rendimento alcoólico, alem de
ocasionar estresse a levedura selecionada do processo (ex: formação do ác
lático) – por isso que deve ser feita a lavagem em pH ácido
O uso de antissépticos (pentaclorofenol, hexaclorofeno, sulfato de cobre)
podem reduzir a contaminação bacteriana. Pore, podem afetar Tb as
leveduras. O seu uso é restrito à industria, estando alguns deles inclusive com
o uso proibido nos últimos anos.
Os antibióticos podem ser utilizados como antissépticos, ficando a escolha
dependente de seu custo de tratamento. a penicilina é um bom inibidor de
contaminações (500 a 1k U.I/L de mosto). Destacam-se o cloranfenicol,
tetracilina, clorotetracclina, virginiamicina.

CORREÇÃO DOS MOSTOS

O objetivo é condicionar o substrato para obtenção de fermentações regulares,
homogêneas e putas. A correção depende da matéria prima e dos fatores que
afetam o processo fermentativo.
Os substratos amilaceos sofrem esterilização, pela tec de preparação do
mosto. Se necessário corrigi-se a acidez com ác sulfúrico.
Para substratos de melaço, faz-se normalmente apenas a diluição. Se
necessário adiciona-se fosfatos e sais de amônio (1g/L mosto). Para o caldo de
cana geralmente juntam-se fosfatos, sais de amônio e vitaminas.

PREPARO DO INOCULO
Uso de leveduras selecionadas – ideal. Em destilarias de aguardente utiliza-se
leveduras selvagens (fermentação espontânea). Na panificação leveduras
úmidas e prensadas ou secas e granuladas (estabilidade muito alta)
Inoculação inicial total ou intermitente
Vai aumentando o colume de açúcar de acordo com o meio de cultura –
aumenta o grau de eficiência de multiplicação.
Fermentadores para multiplicação possuem fornecimento de O2 e agitação
para ter a formação de biomassa. Geralmente ao termino da multiplicação, a
inoculação é imediata – pode deixar as células em temperaturas baixas (+-5ºC)
para entrarem em período de latência.

ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR EM LEVEDURA

Coloração com azul de metileno e análise microscópica  coloca a levedura
nesse corate. As leveduras mortas ficam coradas de azul, e as vivas
permanecem transparentes – faz a contagem de cél vivas e mortas e calcula %

FASES DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

Preliminar ou lag
 Inicia-se no momento do contato do mosto com as leveduras.
 Durante o inicio da fermentação há uma multiplicação celular
 Ocorre pequeno aumento de temp – devido ao metabolismo
 Pequeno desprendimento de CO2 – inicio da fermentação
 A duração varia com o sistema de fermentação da destilaria – pode ser
reduzida com inoculo volumoso e concentrações ótimas de açúcar
 Adaptação das leveduras a condições de estresse e/ou mudança de
meio de cultura – se for muito intenso o estresse, ocorre morte. Se as
leveduras se adaptam, ocorre multiplicação

TUMULTUOSA
 Desprendo,enmto volumoso e intenso de CO2
 Fase de maior tempo de duração
 A temp eleva-se (necessidade de refrigeração em alguns casos)
  Formação de espuma pode ser problemática

Complementar
 Diminuição da intensidade do desprendimento de CO2
 Diminuição de temp
 Concentração de açucares chega ao fim ou ao perto do fim

PUREZA DAS FERMENTAÇÕES

 Processo fermentativo rústico: canas cortadas há muitos dias, secas,
infeccionadas por dif microrg, mosto sujo de terra
 Necessidade de monitoramento: detecção e controle de infecções
 Tempo de fermentação: mais longo com substratos amiláceos
comparado com caldo e melaço de cana
 Odor da fermentação: em fermentações puras tende para odor de frutas
maduras. Se há contaminação o cheiro pode tornar-se acido, ranço ác
sulfídrico, etc
 Aspecto de espuma: varia com o mosto e cepa de levedura
 Drosófilas  quando há infecção acética, aparecem “moscas do
vinagre” proporcionalmente à contaminação
 Temperatura: recomenda-se operar entre 32-34ºC. varia com a região
geográfica e a cepa usada
 Densidade do mosto: decresce segundo uma curva condizente com as
fases de fermentação, estando relacionada ao consumo de açucares do
mosto
 Acidez: quando a acidez final é maior que o dobro da acidez inicial, há
indícios de irregularidades na fermentação

SISTEMAS DE FERMENTAÇÃO
Descontínuo
Sistema de cortes  faz uma divisão meio/meio da primeira fermentação e
completa com mosto novo – faz a segunda fermentação. Um dos
fermentadores vai para destilação. O outro tanque é dividido meio/meio e
completado com mosto novo – e assim sucessivamente.
Nesse sistema ocorre perda de biomassa

Sistema de reaproveitamento de inoculo  faz uma fermentação e faz a

separação das leveduras por decantação. Faz a destilação do sobrenadante e
adiciona mosto novo na levedura
Usado por produtores pequenos que não possuem centrifugação

Sistema de cultura pura  é descartada toda a cultura

Sistema de recuperação de leveduras  faz a 1º fermentação e centrifuga as

leveduras, fazendo destilação do sobrenadante. Depois completa com mosto
novo
Continuo
Acontece sem interrupção. Feita em 4 modos. De modo geral, o material
fermentado passa de um tanque para outro de forma continua em
concentrações de açucares decrescentes (o primeiro tanque tem MT açúcar e
o ultimo quase não tem). O mosto fermentado é chamado de vinho (mesmo
sendo utilizado cana)

Processo biostil  reduz o volume de vinhaça produzido de 10L/L de álcool

para 2L/L de álcool
Fermentação de alta gravidade realizada inicialmente com leveduras
osmotolerantes.
*a vinhaça é rica em nitrogênio e pode ser usada para adubação de solo. O
excesso deve ser tratado para ser despejado no ambiente, porém é MT caro.

SALAS DE FERMENTAÇÃO
Construções que abrigam dornas abertas ou fechadas), centrifugas, pré-
fermentadores, tanques de tratamento do femento, - dornas muito grandes
ficam a céu aberto
Elas trazem maior higiene, controlam temperatura, ventilação adequada e
escoamento de resíduos.

Dornas
São de aço-carbono cilindro cônica. A altura é 1.5 o diâmetro. O volume é
compatível com a capacidade de destilação.

DESTILAÇÃO
Vinho  produto obtido aos fermentação dos meios açucarados
Na destilação dos vinhos para formar álcool, há formação de mistura
azeotropica (fenômeno que ocorre na mistura de líquidos, em uma determinada
concentração, na qual se formam vapores com todos os componentes, em um
ponto de ebulição inferior ao de qualquer um dos integrantes da mistura.

Composição do vinho: 88-93% água, 7-12% etanol

Mais alcoóis amilico, isoamilico, propílico, butílico, isobutilico, aldeídos, ácidos,
furfurol, ésteres e ác orgânicos.

Descontinua  usada na produção de cachaça (colunas de baixo grau)

Continua  utilizada industrialmente, retira-se continuamente a vinhaça pela
base e o alcool pelo topo da coluna de destilação
*ciclohexano  usado para tratar o álcool retirando as moleculas de água que
hidratam o álcool

Retificação
Flegma  liquido obtido da destilação do vinho (liquido alcoólico mais rico do
que o liquido que o originou, mas em estado impuro
O objetivo é separar o alcool das impurezas
Não se consegue fazer purificação completa do álcool por retificação – 96-97%
v/v
Desidratação do álcool
Químicos  emprego de subst químicas que são capazes de absorver a água
do etanol retificado no estado de vapor ou liquido
Fisios  baseiam-se na variação de pressão e destilação de mistura
hiperazeotropica obtida por processos químicos. o arrastamento de álcool é Tb
utilizado (cicloexano)

Ocorre muitas flutuações de emissão de CO2, onde pesquisadores falam que

isso é ocasionado pelas eras glaciais, e a industrialização humana não tem
tanto efeito encima disso. Camadas de gelo da Antártida são retiradas para
fazer essa medição.
Nas ultimas décadas tem aumentado e muito, fugindo da flutuação normal das
eras glaciais. A estimativa é que esse crescimento seja exponencial.
No ponto de vista agrícola, um aumento de CO2 seria benéfico, pois
aumentaria a fotossíntese, aumentando a biomassa.

Existem descrições do uso do bioetanol a partir da década de 30, onde o uso

de cana de açúcar já era bem explorado. Em 77 com o programa Proálcool,
ocorre aumento da produção mais efetiva da cana, tendo aumento da produção
de açúcar e etanol.
O predomínio de usinas de alcool predominam no sudeste, principalmente DP
e MG. São mais de 400, e a produção estima-se de 27kkk de litros/ano,
empregando +- 1.28kk de pessoas. A matriz bioenergética no Brasil é 18%,
maior que a hidroelétrica. Estima-se que mais de 800kk de CO2 não foram
emitidos desde a criação do projeto Proalcool.
Ambientalistas relatam que a produção de biocombustíveis podem afetar
biomas, como a Amazônia. Porem, a área destinada para produção de açúcar
no Brasil é 2,5% da área total destinada para agricultura.

O etanol tem uma tecnologia bem madura no BR. Grandes desenvolvimentos

foram feitos nas ultimas décadas. No BR o clima é ótimo para a produção de
cana, e possui território suficiente para expansão. O BR Tb tem a melhor
produção de biomassa e biocombustível do mundo. A união europeia não
importa muito bioetanol, mas com a pressão mundial sobre o uso de
combustíveis renováveis tem aumentado significamente, tendendo a aumentar
essa importação.
O bagaço da cana é queimado produzindo bioeletricidade (vapor), onde as
usinas são autossustentáveis para eletricidade e fornecem o excesso
produzido.
Existem programas que estão sendo implantados e estudados para uma
melhor produção e distribuição do bioetanol no BR.
Com o progresso e desenvolvimento tecnológico, existem muitos desafios para
o bioetanol no BR. Um deles é a sustentabilidade do biocombustível (o da cana
é o mais eficiente, mas é difícil analisar o ciclo de vida do biocombustível.
Cálculos são efetuados para ver o quanto de energia é necessário para a
produção da cana. Estimativas relatam que a cana é o melhor substrato para a
produção de bioetanol; maior diversidades de cana, maior distribuição, atender
a especificações técnicas (principalmente as do exterior, destinadas à
exportação), uso de combustíveis fosseis para a produção de biomassa e
biocombustível.

Um dos avanços na produção da biomassa é a mecanização da colheita. A

queima anterior a colheita está proibida no BR, principalmente em áreas
planas. Essa colheita mecanizada também facilita o armazenamento de
resíduo celulósico, utilizado para produzir mais etanol ou ter uma queima mais
controlada, produzindo bioeletricidade.

Diversos parâmetros alteram a sustentabilidade do ciclo de vida da biomassa e

devem ser observados:
 Impacto na biodiversidade e ecossistemas
 Uso de recursos naturais
 Balanço energético
 Emissão de poluentes
 Condições dos trabalhadores – segurança e saúde
 Impacto na produção de alimento
 Impactos socioeconômicos.

Economicamente falando, o custo para a produção de etanol decresceu e

muito, aumentando e muito também a produção do bioetanol (com uma
estagnação de produção entre 1985 e 90). É estimado o custo de R$0,40 a
0,70 por litro de produção

A fisica, biologia e quimica estão diretamente relacionadas com a produção de

bioetanol. Aspectos sociais, econômicos e políticos estão envolvidos também,
observando conceitos de melhorar ou inibir a produção de bioetanol

A produção de bioeletricidade tem um potencial ótimo, onde parte do bagaço

da cana e a folhagem podem ser queimados para produzir eletricidade.
Considera-se a produção de cana utilizada para bioetanol. a variação do preço
da energia pode influenciar o destino desses substratos para a produção de
bioeletricidade, em vez da produção do etanol 2º e 3º

BOETANOL DE 1º GERAÇÃO
Utiliza a cana de açúcar – rica em sacarose – dissacarídeo de GLC + frutose. A
levedura (agente fermentador) é capaz de transportar a sacarose para a célula,
mas na maioria das vezes hidrolisa a sacarose antes de transportá-la. A
levedura possui parede celular, e o espaço periplasmatico é onde se dá a
maior parte dessa hidrólise – possui enzima invertase (Suc2p) que hidrolisa,
liberando os monossacarídeos que podem ser passadas para dentro da célula
por transportadores presentes na membrana plasmática.
A osmolaridade duplica – 1M de sacarose tem 1M de GLC e 1M de frutose.
Dependendo a quantidade de sacarose e qtde de invertase, pode-se criar um
estresse osmótico na levedura antes da metabolização da GLC e da frutose.
Isso reduz a viabilidade celular, baixa performance fermentativa e menor
produtividade. O ideal é que a atividade da invertase seja compatível com o
fluxo glicolítico.
Rendimento fermentativo
Os produtos secundários que podem afetar o rendimento da fermentação
alcoólica é a biomassa (inoculação de muita levedura, para evitar a
multiplicação celular) e o glicerol
Na via glicolitica ocorre acumulo de NADH, que geralmente vão para a cadeia
respiratória. O NADH começa a acumular, tendo pouco NAD+ para a
fermentação alcoolica, diminuindo sua velocidade. Para regenerar parte do
NAD, as células produzem o glicerol, pq em uma das bifurcações da via
glicolitica a DHA-P pode ser convertida em glicerol 3-P, transformando NADH
em NAD+, controlando o valor REDOX do NAD. O glicerol 3-P por uma
fosfatase é convertido para glicerol.
Outra função do glicerol é o estresse hiperosmótico – no caso do meio extra
estar mais concentrado que o intra. Quando se acumula dentro d célula,
aumenta a osmolaridade intracelular. Para que a célula não perca água,
aumenta a osmolaridade interna produzindo o glicerol. Esse aumento de
glicerol diminui a produção de etanol
A engenharia metabólica busca o controle de diferentes enzimas da via
glicolitica, não afetando a rota do REDOX e nem o controle de estresse
hiperosmotico – pode permitir um rendimento de até 92%

Estratégias
Para melhorar a produção de bioetanol, observa-se
 A produtividade de cana de açúcar  aumentar a produção por ha,
melhorando a fotossíntese e maior fornecimento de alimento para a
cana
 Avanços na fermentação  melhorando as carac do agente
fermentador, melhora o rendimento alcoólico, melhora características
dos estresses industriais (como a lavagem com pH ácido). O uso de
leveduras geneticamente modificadas é um grande passo

Cerca de 2/3 da energia presente na cana está na parede celular – no bagaço.

Parte desse resíduo celulósico pode ser usado para bioeletricidade ou Tb para
a produção de etanol – o de 2º geração. Estudos da parede celular avançam os
resultados para fermentação do bagaço – a levedura que fermenta sacarose
não consegue fermentar celulose, precisando de um pré tratamento e hidrolise
da celulose para permitir a fermentação. Na parede celular existe muita
pentose – como a xilose – e levedura não fermenta pentoses. Trabalhos de
engenharia genética permitem a fermentação de pentoses, tendo um bom
aproveitamento do resíduo celulósico

BIOETANO DE 2º GERAÇÃO
Entender a estrutura de biomassa é importante.
 A arquitetura da parede tem impacto na estatura e forma da planta (qtde
de biomassa)
 Tb limita a degradação da celulose em açucares fermentáveis
 A composição da parede pode ser otimizada para atender as demandas
do processo de produção de biocombustíveis
Na composição do vegetal existe lignina, celulose e hemicelulose – pode ter
pectina (inibidora da fermentação pelo ácido galacturônico, não fermentável
pelas leveduras comuns. Trabalhos genéticos produziram leveduras que
podem fermentar).
A celulose libera principalmente hexoses. A hemicelulose libera hexoses e
pentoses. A lignina libera compostos fenólicos que inibem as leveduras.
A engenharia genética isolou genes de fungos fermentadores de pentoses e
inoculou em leveduras. Isso altera a metabolização da levedura, pois a
metabolização de pentoses necessita de vias diferentes do que das hexoses.
A celulose está estruturada em complexos de microfibras, dificultando o
tratamento. Alem da glicose presente na estrutura do vegetal, encontra-se
outros acucares fermentáveis e não fermentáveis. Dependendo a concentração
de determinados açucares, o trabalho da engenharia genética é fundamental
para metabolizar os açucares mais presentes.

As hemiceluloses tem hexoses e pentoses, com ramificações diferentes – varia

de vegetal para vegetal, e no próprio vegetal.

Existem varias ligações glicosídicas diferentes em um mesmo polimero,

necessitando de várias enzimas para degradar o polímero.

A lignina é responsável pela parte de sustentação da planta, envolvendo a

celulose e hemicelulose. Essa lignina produz compôs fenolicos prejudiciais
para a planta.

Para produzir bioetanol, o bagaço e as folhagens devem ser trituradas o

Maximo possível, permitindo um melhor pré tratamento – relaxamento da
estrutura compacta . Esse varia por tratamentos químicos (ácidos e bases
fortes para quebrar as ligações glicosidicas).
Após isso, deve ser feita a detoxificação e neutralização do substrato –
principalmente quando utilizado ácidos e bases fortes. Depois é feita a
separação de resíduos sólidos e líquidos.
Antes da etapa de fermentação pode ser feita uma hidrolise enzimática (muito
caro). Essa fermentação celulósica é mais para hexoses.
Após a separação do solido e liquido, pode ser feita a fermentação
hemicelulósica.
Após fermentação realiza a destilação. Alguns resíduos – co-produtos – podem
ser produzidos, e alguns utilizados posteriormente

Um ods pontos mais importantes para a produção de etanol 2º geração é o uso

de pentoses – principalmente a xilose. O uso de genes de outros microrg em
leveduras permite a fermentação dessas pentoses. O clone da xilose
desidrogenase e a redutase são as mais importantes para produzir a D-
xilulose-5-P, que entra na via glicolitica. Porém co-fatores são necessários, e
devem ser presentes para esse processo.
BIOETANOL DE 3º GERAÇÃO
É a “fusão” do 1º e 2º geração. É um bioprocesso consolidado (CBP), tendo a
utilização de leveduras geneticamente modificadas que expressam as enzimas
necessárias para a liberação dos açucares fermentáveis do vegetal.

BIODIESEL NO BRASIL
É mais similar ao hidrocarboneto encontrado no diesel. A diferença é encontrar
hidrocarbonetos insaturados no biodiesel. Essas insaturações devem ser
eliminadas – uso de metanol permite essa remoção, liberando os
hidrocarbonetos saturados.
A distribuição de usinas é mais homogênea do que a do bioetanol
78% do óleo produzido para o biodiesel é da soja.
A levedura Yarrowia lipolytica é utilizada para a produção de biodiesel. Essa
levedura acumula lipídeos (acido palmítico e oleico) que podem ser utilizados
para a produção de biodiesel.