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Cada organismo usado em biologia celular e molecular tem vantagens para certos tipos de estudos
Vírus Moscas da Fruta (Drosophila melanogaster)
Bacteria (E. coli) Peixe Zebra (Danio rerio)
Leveduras (Saccharomyces cerevisiae) Arabidopsis thaliana
Planárias (Schmidtea mediterranea) Rato (Mus musculus)
Algas (Chlamydomonas reinhardtii) Nemátodos (Caenorhabditis elegans)
Tecnologia de DNA Recombinante
Ferramentas essenciais
Metodologias
- Clonagem molecular
- Processos de seleção dos recombinantes
Genes Policistrónicos – Gene que possui diferentes operões, operadores, promotor, diferentes ORFs,
mensageiro policistrónico único com diversos locais de ligação ao ribossoma (cada lugar para uma
proteína diferente).
Inibidor Promotor Operador Operão Lac
Z Y A
-35 -10 +1
Em procariontes, a RNA polimerase liga-se ao nucleótido -10 e -35 na região do promotor,
relativamente ao local de início da transcrição (+1 – primeira base do mRNA).
Operadores são as regiões regulatórias onde existem proteínas repressoras ou ativadoras que alteram
a transcrição da RNA polimerase.
- Ligase do fago T4
- Ligase de E. coli
- Transformação / Transfeção
- Infeção / Transdução
-Conjugação
- Isolamento dos fragmentos de DNA: requer enzimas de restrição, PCR, PCR de transcrição
reversa, eletroforese em gel, síntese química de DNA.
- Clonagem dos fragmentos de DNA: vetor, ligação, transformação, purificação
- Identificação dos fragmentos de DNA: sequenciação do DNA, Southern blot, Northern blot
Clonagem do plasmídeo
Enzimas de Classe II
Nas bactérias, as enzimas de restrição são usadas como defesa contra infeções. Enquanto o DNA
hospedeiro está sempre metilado (por uma metilase que adiciona CH3), o DNA infecioso não está, o
que leva ao corte pelas endonucleases.
A primeira enzima de restrição usada para corte de uma sequência específica é designada protótipo.
Qualquer outra endonuclease de restrição que ataque a mesma sequência que o protótipo, é
designada isosquisómero – não têm de cortar da mesma forma.
Enzimas importantes:
- Nuclease Mung Bean – corta a extremidade saliente das blunt ends, tornando-as abruptas
- Fosfatase Alcalina – remove o grupo fosfato da extremidade do DNA que impede a re-circularização
Vetor de Clonagem
Há digestão parcial do DNA de interesse com uma enzima que recorta em muitos locais do genoma.
A digestão não é levada até ao fim, de forma a obtermos fragmentos relativamente longos. Num gel
de agarose, os fragmentos formam arrastamento pois existem de diversos tamanhos, desses devem
ser colhidos os que se encontram no peso desejado.
Produção da Sonda
- De DNA: O DNA contendo o gene de interesse é desnaturado e colocado na presença de primers que
vão se ligar ao DNA e dar início à incorporação de NTPs e dNTPs. Estes últimos são detetados por
autoradiografia.
Biblioteca de cDNA
São bibliotecas onde estão representados os genes a ser expresso num determinado local e tempo.
Para purificar o mRNA, utiliza-se uma matriz de celulose contendo Oligo-dT que é complementar à
extremidade poli-A. Através de uma lavagem são excluídos os RNAs não poliadenilados (tRNA e rRNA).
Os mRNA associados à matriz são eluídos com auxílio a um tampão (sal).
O mRNA é hibridado com um oligo-dT, que serve de início à transcrição em cDNA com recurso a uma
transcriptase reversa. O RNA é removido com uma solução alcalina. Ao DNA é adicionado uma cauda
poli-G na 3’, ao qual se liga um primer de poli-C que dá início à síntese da cadeia complementar. O
dsDNA é metilado. São adicionados locais de corte da enzima de restrição que crie extremidades
compatíveis com as extremidades do bacteriófago λ.
Screening: - Usando uma sonda de DNA com sequência homóloga (ex. cDNA homólogo ou clone
de gene de espécies relacionadas.
- Usando uma sonda de oligonucleótidos baseado numa sequência de aminoácidos
conhecida (requer purificação da proteína e alguma sequenciação de péptidos).
- Usando um anticorpo contra a proteína de interesse (requer o uso de um vetor de
expressão).
Processo:
- T-Vetores têm extremidades 3’-TTT que coincidem com a extremidade 3’-A criada pela Taq DNA
polimerase. 3’ T
T T A
3’ A 3’ A T
A + =
3’
Síntese Química de DNA
Gibson Assembly
Vários oligonucleótidos sobreponíveis podem ser ligados numa única reação isotérmica.
Os oligonucleótidos são criados com homologia terminal.
Passos e Enzimas:
- Sequenciação de Sanger
Num meio com dNTP’s e ddNTP’s, a síntese de diversas cadeias é feita em simultâneo. Sempre que é
adicionado um ddNTP, a síntese dessa cadeia é terminada pois esse não possui um grupo 3’-OH para
reagir com o 5’-P do nucleótido seguinte.
Os ddNTP’s são marcados com fluorescência de cor de acordo com a base que carrega. Através de
uma eletroforese capilar os fragmentos de cor são separados, e um computador pode ler o espetro
de absorvência, atribuindo cada base a uma cor.
- Piro sequenciação
Genómica
As sequências que foram sequenciadas podem ser alinhadas e montadas, formando contigs.
A anotação do genoma procura caraterísticas conservadas da sequência e regiões codificantes de
proteína (ORF)
Transcriptómica
Criação de um perfil de Expressão Gênica a partir dos transcritos produzidos pelos genes ativos numa
célula, usando um microarray de DNA.
Lamela contendo genes representativos de uma certa célula. Duas amostras da
mesma célula, mas em condições diferentes têm o cDNA marcado com um fluoróforo diferente, que
vai resultar num gel com poços de cor, de acordo com o gene ativo em cada amostra.
Proteómica
Pode ser feita por sequenciação dos aminoácidos de peptídeos, usando um espetrofotómetro de massa
e fazendo coincidir a informação obtida numa base de dados de genes/proteínas.
Metabolómica
Interatómica
Vetor – Molécula de DNA usada como veículo para transportar artificialmente material genético
estranho para dentro de uma célula.
- A sua escolha depende do tipo de hospedeiro a usar.
Plasmídeos – dsDNA circular que possui sequências de DNA que permitam se replicar na célula
hospedeira. Possui uma Origem de replicação que permite que a molécula se multiplique de
forma semi-independente.
Cosmídeos – plasmídeos híbridos que contêm sequências Cos (fago λ), permitem introduzir
fragmentos maiores do que normal.
Vetores Virais – vírus modificados geneticamente de forma a não serem infeciosos.
Cromossomas Artificiais – feitos em laboratório - BACs (bactéria), YACs (levedura), HACs
(humano). Inclui origem de replicação, centrómero e regiões e sequências teloméricas.
Plasmídeos
Propriedades:
- Devem possuir uma região semelhante a uma Origem de Replicação para conseguir se auto-replicar.
- Episomas – Alguns plasmídeos são capazes de se inserir no cromossoma – plasmídeos integrativos.
Classificação:
Tipos de Plasmídeos:
Transformação Química
- As células são transformadas em células competentes (aptas a receber o DNA) a partir de tratamento
com Cloreto de Cálcio. As células são incubadas e submetidas a choque térmico que ajuda a
incorporação do DNA, seguindo um tratamento para recuperação da membrana, antes de serem
colocadas num meio onde serão selecionadas as transformantes.
Eletroporação
Blue-White Screening
Bactérias que possuem o gene LacZ tornam a célula capaz de produzir β-galactosidase.
Em bactérias que sofreram a deleção de uma zona no lacZ, a β-galactosidase não é funcional. Na
presença de X-gal:
Os plasmídeos que possuem o gene para lacZα, se não receberem o fragmento,
transportam a secção em falta que vai fazer complementação α ao gene LacZ e
tornar as células hospedeiras capazes de produzir a enzima funcional → AZUL
Plasmídeos que receberam o fragmento têm a zona do gene lacZα
interrompida com o fragmento clonado, e não permitem que a bactéria produza
uma β-galactosidase funcional → BRANCA
Requerem:
Plasmídeo pET: - Marca de Resistência a Antibiótico; ORI (em E. coli); MCS; gene LacI
Promotor e Terminador reconhecidos pela
RNA polimerase do fago T7; Operador lacI
Utiliza um E. coli modificada que possui o gene que codifica para uma polimerase do fago T7. Este
gene está sob o controlo do operador lac.
Num meio sem indutor (IPTG ou alo-lactose), o operão lac está bloqueado por um tetrâmero lacI, e
não está a ser produzida a polimerase do fago T7 e consequentemente o gene não é expresso.
Com indutor, o tetrâmero perde afinidade para o DNA e o operador fica livre.
O repressor cI do fago λ é transcrito a partir do promotor pcl. O gene de interesse está sob o controlo
do promotor pL e operador oL, que é regulado pelo repressor cI.
Um mutante de cI, mais sensível à temperatura, aos 42ºC desnatura e o gene é transcrito
Plasmídeo YCp e YEp
Plasmídeos de levedura.
Conseguem se replicar autonomamente
YCp YEp
- Possuem uma região centromérica CEN e - Possuem ORI e Marcador de levedura STB
sequência para replicação autónoma ARS
Permitem que o plasmídeo se comporte
como cromossoma e migre para o fuso
cromático. Mantêm o número de cópias
entre célula mãe e filha.
YIp
A inserção pode ser por: Recombinação simples ou Recombinação dupla. Se um plasmídeo possuir:
- Para inserir DNA numa levedura, a construção do plasmídeo é feita em E. coli e depois enviado para
a levedura após:
Tratamento com LiAc que facilita a entrada de DAN
Remoção da parede das células, formando spheroplastos e posterior fase de regeneração.
Eletroporação
Seleção de Transformantes
Complementação de mutações auxotróficos – células mutantes em genes que afetam a
biossíntese de nucleótidos ou aminoácidos (ura3, leu2, his3) necessitam do plasmídeo para
sobreviver sem input desses compostos.
Marcas de Seleção Dominantes – resistência a formaldeído, Cu2+, resistência a G418
Genes Repórter
São usados para verificar se um gene foi inserido na célula, localizar o gene ou quantificar a expressão
génica.
Ex. GFP, dsRed (green or red fluorescent protein), Luciferase, LacZ (β-galactosidase)
O gene a medir e o gene repórter têm de estar sobre o controlo do mesmo sistema de tradução.
Estas proteínas de fusão podem também ser usadas para facilitar a extração das proteínas alvo, por
exemplo ao diminuir a permeabilidade da membrana.
Células de Mamíferos
Transfeção – método não viral de entrega de DNA nas células (metodologias físicas e químicas).
Infeção – método viral de entrega de DNA, no qual os vírus se associam às células e injetam a sua
carga de DNA.
Metodologias:
K (Seq. Kozak)
S (Sequência Sinal) – para excreção da proteína para fora da célula
T (Tag de afinidade da proteína) – facilita o isolamento da proteína por coluna de afinidade
P (Local de corte proteolítico) – por ação de uma protease, será clivada neste local - separa a proteína
da cauda de aminoácidos de afinidade
SC (Codão stop)
CRISPR