Preparação para o Estudo ACS

Conheça as diferentes técnicas de tecnologia de DNA (Capítulo 9)

 Gel blotting é uma técnica para visualizar um subconjunto particular de macromoléculas –
proteínas, ou fragmentos de DNA ou RNA – inicialmente presentes em uma mistura complexa
 As etapas envolvidas no gel blotting são:
1. Separação das moléculas por eletroforese. Isso é feito em um gel que permite que as
moléculas migrem sob a influência de um campo elétrico
2. A eletroforese resultante é então "borrada" com um filtro de nitrocelulose. As
moléculas aderem firmemente ao filtro e manterão suas posições relativas quando
inundadas com fluido na próxima etapa
3. O filtro é então banhado com uma solução contendo uma "sonda"
 A sonda irá combinar especificamente com as moléculas alvo, ou seja, aquelas
que você está procurando
 A sonda carrega um meio de visualização (um marcador radioativo ou
fluorescente)
 O procedimento para detectar fragmentos de DNA contendo uma determinada sequência é o
seguinte
1. O DNA é extraído da célula
2. O DNA é parcialmente digerido por uma endonuclease de restrição – também chamada
de enzimas de restrição, reconhece e cliva o DNA em sequências específicas (sequências
de reconhecimento ou sítios de restrição) para gerar um conjunto de fragmentos
menores
3. Os fragmentos de DNA resultantes são separados por eletroforese e então
desnaturados para formar moléculas de fita simples (ssDNA)
4. Sem alterar suas posições, as bandas separadas de ssDNA são transferidas para um filtro
de nitrocelulose e expostas a um cDNA ou RNA radiomarcado
5. Se a sonda detectar sequências de DNA complementares, ela se ligará a elas
 Os diferentes tipos de manchas são os seguintes:
Moléculas
Tipo de Blot separadas por Sondar
eletroforese
Austral ssDNA cDNA ou RNA
Setentrional RNA desnaturado RNA ou cDNA
Ocidental Proteína Anticorpos
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/G/GelBlotting.html
 O Northern blot é uma técnica usada em pesquisas de biologia molecular para estudar a
expressão gênica através da detecção de RNA (ou mRNA isolado) em uma amostra
 A eletroforese em gel é uma técnica usada para a separação de moléculas de DNA, RNA ou
proteínas usando um campo elétrico aplicado a uma matriz de gel
 A reação em cadeia da polimerase (PCR) envolve a amplificação de sequências específicas de
DNA
o O processo envolve a ampliação do número de cópias de um determinado segmento de
DNA
 o É uma técnica em biologia molecular para amplificar uma única ou poucas cópias de um
pedaço de DNA em várias ordens de magnitude, gerando milhares a milhões de cópias
de uma determinada sequência de DNA
o O processo envolve e depende da ciclagem térmica, consistindo em ciclos de
aquecimento e resfriamento repetidos da reação para fusão do DNA e replicação
enzimática do DNA. Primers (fragmentos curtos de DNA) contendo sequências
complementares à região alvo juntamente com uma DNA polimerase são componentes
fundamentais para permitir amplificação seletiva e repetida
o À medida que a PCR progride, o próprio DNA gerado é usado como um molde para
replicação, colocando em movimento uma reação em cadeia na qual o molde de DNA é
exponencialmente amplificado
1. As cadeias de DNA são separadas por aquecimento
2. As fitas de DNA são recozidas a um excesso de iniciadores curtos de DNA
sintético que ladeiam a região a ser amplificada
3. Novo DNA é sintetizado por polimerização

Conheça o aspecto genético da bioquímica

 Um códon triplete em uma sequência de ácido nucleico geralmente especifica um único
aminoácido
 O código genético define um mapeamento entre sequências de trinucleotídeos, chamadas
códons, e aminoácidos
 DNA (ácido desoxirribonucleico) é um ácido nucleico que contém as instruções genéticas
usadas no desenvolvimento e funcionamento de todos os organismos vivos conhecidos e alguns
vírus
o O principal papel das moléculas de DNA é o armazenamento de informações a longo
prazo
o O DNA consiste em dois polímeros longos de unidades simples chamadas nucleotídeos,
com espinhas dorsais feitas de açúcares e grupos fosfato unidos por ligações ésteres
o As duas vertentes correm em direções opostas uma da outra e, portanto, são
antiparalelas
o Ligado a cada açúcar está um dos quatro tipos de moléculas chamadas bases
o É a sequência dessas quatro bases ao longo do backbone que codifica as informações
o Esta informação é lida usando o código genético, com especifica a sequência dos
aminoácidos dentro das proteínas
 O RNA (ácido ribonucleico) é um tipo biologicamente importante de molécula que consiste em
uma longa cadeia de unidades nucleotídicas
o Cada unidade nucleotídica consiste de uma base nitrogenada, um açúcar ribose e um
fosfato
o O RNA é transcrito do DNA por enzimas chamadas RNA polimerases, e geralmente é
processado por outras enzimas
o O RNA é fundamental para a síntese de proteínas
 Diferenças entre RNA e DNA
o O RNA é geralmente de fita simples, enquanto o DNA é geralmente de fita dupla
 RNA, uma cadeia muito mais curta de nucleotídeos
o Os nucleotídeos de RNA contêm ribose, enquanto o DNA contém desoxirribose (um tipo
de ribose que não possui um átomo de oxigênio)
  Esses grupos hidroxila tornam o RNA menos estável que o DNA porque é mais
propenso à hidrólise
o O RNA tem a base uracila, enquanto o DNA tem a base timina
 A base complementar à adenina não é a timina, pois é o DNA, mas sim o uracilo,
que é uma forma não metilada da timina
 RNAs ribossomais (rRNAs) são componentes dos ribossomos , os complexos que realizam a
síntese de proteínas
 Os RNAs mensageiros (mRNAs) são intermediários, transportando informações genéticas de um
ou alguns genes para um ribossomo, onde as proteínas correspondentes podem ser sintetizadas
 RNAs de transferência (tRNAs) são moléculas adaptadoras que traduzem fielmente a
informação em mRNA em uma sequência específica de aminoácidos

Saiba o que são fragmentos de Okazaki

 Fragmentos de Okazaki são fragmentos relativamente curtos de DNA (sem primer de RNA no
término 5') criados na fita atrasada durante os fragmentos de DNA
o Quando a fita atrasada estiver sendo replicada na fita original, o padrão 5'-3' deve ser
usado; assim, ocorre uma pequena descontinuidade e um fragmento de Okazaki se
forma
o Esses fragmentos são processados pela maquinaria de replicação para produzir uma fita
contínua de DNA e, portanto, uma hélice de DNA filha completa
o Ao lidar com a síntese de cadeias complementares de DNA, a vertente líder emergente
sempre lê 3' a 5'. A vertente do complemento antiparalelo, a vertente defasada
emergente lê-se 5' a 3'
 Como as cadeias originais de DNA são antiparalelas, e apenas uma nova fita
contínua pode ser sintetizada na extremidade 3' da fita principal devido à
polaridade 5'-3' das DNA polimerases, a outra fita deve crescer
descontinuamente na direção oposta
 Em relação à fita atrasada, o resultado da replicação descontínua dessa fita é a
produção de uma série de seções curtas de DNA chamadas fragmentos de
Okazaki
 Cada fragmento de Okazaki é iniciado próximo ao garfo de replicação em um
primer de RNA criado por uma primase e estendido pela DNA polimerase III

Conservador versus semiconservador

 A replicação do DNA é semiconservadora
o Cada fita de DNA serve como um molde para a síntese de uma nova fita, produzindo
duas novas moléculas de DNA, cada uma com uma nova fita e uma fita antiga
o A replicação semiconservadora produziria duas cópias que cada uma continha uma das
fitas originais e uma nova fita
o A replicação conservadora deixaria as duas fitas de DNA originais juntas em uma dupla
hélice e produziria uma cópia composta por duas novas fitas contendo todos os novos
pares de bases de DNA

Conheça enzimas e enzimas restritivas

 Enzimas são proteínas que catalisam (aumentam as taxas de) reações químicas
o Nas reações enzimáticas, as moléculas no início do processo são chamadas de
substratos, e a enzima as converte em diferentes moléculas, chamadas de produtos
 o As enzimas atuam como catalisador e atuam diminuindo a energia de ativação de uma
reação, aumentando assim a taxa da reação
o A atividade enzimática pode ser afetada por outras moléculas
 Inibidores são moléculas que diminuem a atividade enzimática, ativadores são
moléculas que aumentam a atividade enzimática
 Drogas e venenos são inibidores de enzimas
 A atividade é afetada pela temperatura, ambiente químico e concentração de
substrato
o As enzimas são muito específicas quanto às reações que catalisam e os substratos que
estão envolvidos nessas reações
 Tamanho complementar, carga e características hidrofílicas/hidrofóbicas de
enzimas e substratos são responsáveis por essa especificidade
 Cofatores são componentes de enzimas que algumas enzimas necessitam. Essas moléculas não
proteicas estão ligadas a algumas enzimas para atividade
 Coenzimas são pequenas moléculas orgânicas que transportam grupos químicos de uma enzima
para outra
 Enzimas de restrição, ou endonuclease de restrição, é uma enzima que corta DNA de fita dupla
ou simples em sequências específicas de nucleotídeos de reconhecimento conhecidas como
sítios de restrição

Conheça a hibridização
 A Hibridização de DNA está coletando duas amostras de DNA para serem comparadas. Eles são
completamente desnaturados pelo aquecimento. Então, quando duas soluções se misturaram e
esfriaram lentamente, as fitas de DNA de cada amostra se associam ao seu parceiro
complementar normal e ao recozimento para formar duplexes. Se os dois DNAs têm
similaridade de sequência significativa, eles também tendem a formar duplexes parciais ou
híbridos um com o outro. Quanto maior a similaridade de sequência entre os dois DNAs, maior o
número de híbridos formados
Conheça as proteínas e suas interações
 Proteínas são compostos orgânicos feitos de aminoácidos dispostos em uma cadeia linear e
dobrados em uma forma globular
 Os aminoácidos em um polímero são unidos pelas ligações peptídicas entre os grupos carboxila
e amino de resíduos de aminoácidos adjacentes
 A sequência de aminoácidos em uma proteína é definida pela sequência de um gene, que é
codificada no código genético
 As interações proteína-proteína envolvem não apenas a associação de contato direto de
moléculas proteicas, mas também interações de longo alcance através do eletrólito, meio de
solução aquosa ao redor de proteínas hidratadas vizinhas
o As interações entre proteínas são importantes para a maioria das funções biológicas

Saber pH, pI, pK

 pH (potencial para concentração de íons hidrogênio) é uma medida da acidez ou basicidade de
uma solução
 pI (ponto isoelétrico, pH isoelétrico) é o pH característico que a carga elétrica líquida é 0
 pK (constante de dissociação ácida) é uma medida quantitativa da força de um ácido em
solução. É a constante de equilíbrio para uma reação química conhecida como dissociação no
contexto de reações ácido-base
Hemoglobina versus Mioglobina
 A hemoglobina é a proteína transportadora de oxigênio dos eritrócitos (glóbulos vermelhos)
o A capacidade de transporte de oxigênio é dependente de quatro íons de ferro
 A mioglobina é uma proteína ligadora de oxigênio encontrada no tecido muscular
 É a porção heme do ferro que dá aos glóbulos vermelhos e ao músculo vermelho sua cor
 No sangue, é a hemoglobina que contém ferro, e nas células musculares, a mioglobina contém o
ferro
 Os glóbulos vermelhos contêm hemoglobina, não mioglobina, e por isso é a hemoglobina que dá
aos glóbulos vermelhos a sua cor

Conheça as forças intermoleculares

 Forças intermoleculares são forças que atuam entre moléculas estáveis ou entre grupos
funcionais de macromoléculas
o inclui atrações momentâneas entre moléculas, elementos livres diatômicos e átomos
individuais
o essas forças, notavelmente forças de dispersão de Londres, interações dipolo-dipolo e
ligação de hidrogênio, são significativamente mais fracas do que a ligação iônica ou
covalente, mas ainda têm um efeito químico perceptível
o forças intermoleculares são devidas a diferenças na densidade de carga nas moléculas

Conheça as cadeias laterais de aminoácidos

 Os aminoácidos são moléculas que contêm um grupo amina, um grupo ácido carboxílico e uma
cadeia lateral que varia entre diferentes aminoácidos
o Essas cadeias laterais podem variar em tamanho de apenas um átomo de hidrogênio em
glicina, a um grupo metilo em alanina, até um grande grupo heterocíclico em triptofano
o Os aminoácidos são geralmente classificados pelas propriedades de suas cadeias laterais
em quatro grupos
 A cadeia lateral pode fazer de um aminoácido um ácido fraco, ou uma base
fraca, e um hidrófilo se a cadeia lateral for polar, ou um hidrófobo se for apolar

Conheça as técnicas de separação de proteínas

 A cromatografia em coluna aproveita as diferenças na carga da proteína, tamanho, afinidade de
ligação e outras propriedades
 Cromatografia de troca catiônica, a matriz sólida tem grupos carregados negativamente. Na
fase móvel, proteínas com carga positiva líquida migram através da matriz lentamente do que
aquelas com carga negativa líquida, pois a migração da primeira é retardada mais pela interação
com a fase estacionária
 A cromatografia de exclusão de tamanho separa as proteínas de acordo com o tamanho. Nesse
método, proteínas grandes emergem da coluna mais cedo do que as pequenas – um resultado
um tanto contraintuitivo
o A fase sólida consiste em contas com poros ou cavidades projetadas de um tamanho
particular
o Grandes proteínas não podem entrar nas cavidades e, portanto, tomar um caminho
curto e rápido através da coluna, ao redor das contas
o Pequenas proteínas entram nas cavidades e migram pela coluna mais lentamente
 A cromatografia de afinidade é baseada na afinidade de ligação de uma proteína. As esferas na
coluna têm um grupo químico covalentemente ligado. Uma proteína com afinidade por este
 grupo químico específico liga-se às esferas na coluna, e sua migração será retardada como
resultado
 A HLPC (cromatografia líquida de alta eficiência) faz uso de bombas de alta pressão que
aceleram o movimento das moléculas de proteína pela coluna descendo a coluna, bem como
materiais cromatográficos de alta qualidade que podem suportar a força de esmagamento do
fluxo pressurizado
o HLPC pode limitar a difusão de bandas de proteínas e, assim, melhorar muito a
resolução

Conheça a RMN
 A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é um método para determinar as estruturas
tridimensionais de macromoléculas
o É a propriedade que os núcleos magnéticos têm em um campo magnético que aplica
pulsos eletromagnéticos ou pulsos, que fazem com que os núcleos absorvam energia do
pulso EM e irradiem essa energia de volta para fora
o A energia irradiada de volta para fora está em uma frequência de ressonância específica
que depende da força do campo magnético e outros fatores

Conheça o espectrômetro de massa

 A espectrometria de massas é uma técnica analítica para a determinação da composição
elementar de uma amostra ou molécula
o O princípio MS consiste em compostos químicos ionizantes para gerar moléculas
carregadas ou fragmentos de moléculas e medir suas relações massa-carga

Conheça a cristalografia de raios X

 A cristalografia de raios X é um método de determinar o arranjo dos átomos dentro de um
cristal, no qual um feixe de raios X atinge um cristal e difrata em muitas direções específicas
o A partir dos ângulos e intensidades desses feixes difratados, um cristalógrafo pode
produzir uma imagem tridimensional da densidade de elétrons dentro do cristal
o A partir dessa densidade eletrônica, pode-se determinar as posições médias dos átomos
no cristal, bem como suas ligações químicas, sua desordem e várias outras informações

Destino do piruvato
 O piruvato é uma molécula que é uma intersecção chave em várias vias metabólicas
o Pode ser produzido a partir da glicose através da glicólise, fornece energia às células
vivas no ciclo do ácido cítrico, e também pode ser convertido em carboidratos via
gliconeogênese, em ácidos graxos ou energia através do acetil-CoA, no aminoácido
alanina e no etanol

Saiba o que são condições anaeróbias e aeróbias

 Condições anaeróbias são virtualmente desprovidas de oxigênio, e microrganismos adaptados a
esses ambientes obtêm energia transferindo elétrons para nitrato (formando N2), sulfato
(formando H2S) ou CO2 (formando CH4)
 Condições aeróbicas têm um suprimento abundante de oxigênio, e alguns organismos
residentes derivam energia da transferência de elétrons das moléculas de combustível para o
oxigênio
Conhecer a regulação da gliconeogênese
 Enquanto a maioria das etapas da gliconeogênese é o inverso daquelas encontradas na glicólise,
três reações reguladas e fortemente exergônicas são substituídas por reações mais
cineticamente favoráveis
o As enzimas hexoquinase/glicoquinase, fosfofrutoquinase e piruvato quinase da glicólise
são substituídas por glicose-6-fosfato, frutose 1,6-bifosfatase e PEP carboxiquinase
o A maioria das enzimas responsáveis pela gliconeogênese encontra-se no citoplasma
o A taxa de gliconeogênese é controlada pela ação de uma enzima-chave, a frutose 1,6-
bifosfatase, que também é regulada através da transdução de sinal por AMPc e sua
fosforilação
o Acetil CoA e citrato ativam enzimas de gliconeogênese (piruvato carboxilase e frutose
1,6-bifosfatase, respectivamente)
 Devido ao controle recíproco do ciclo, acetil-CoA e citrato também têm papéis
inibitórios na atividade da piruvato quinase
Conheça a regulação do ciclo do ácido cítrico
 A regulação do ciclo do TCA é determinada em grande parte pela disponibilidade de substrato e
inibição do produto
 NADH, um produto de todos os desidrogenatos no ciclo do TCA (exceção: succinato
desidrogenase) inibe piruvato desidrogenase, isocitrato desidrogenase, α-cetoglutarato
desidrogenase, e também citrato sintase
 Acetil CoA inibe piruvato desidrogenase
 Succinil-CoA inibe succinil CoAsynthease e citrato sintase
  ATP inibe citrato sintase e a-cetoglutarato desidrogenase
 O cálcio é usado como regulador e ativa a piruvato desidrogenase, isocitrato desidrogenase e a-
cetoglutarato desidrogenase
 O citrato é usado para inibição por retroalimentação, pois inibe a fospofrutoquinase, uma
enzima envolvida na glicólise, que catalisa a formação de frutose 1,6-bifosfato, um precursor do
piruvato

Conhecer regulação da glicólise

 A glicólise é regulada desacelerando ou acelerando certas etapas na via da glicólise
o Isto é conseguido inibindo ou ativando as enzimas que estão envolvidas
 o Qualquer passo com uma energia livre perto de 0 não está sendo regulado
o Presume-se que um passo com uma grande variação negativa na energia livre seja
regulado

Conheça o complexo piruvato desidrogenase

 O complexo piruvato desidrogenase é um complexo de três enzimas que transformam o
piruvato em acetil-CoA por um processo chamado descarboxilação do piruvato
o O acetil-CoA pode então ser usado no ciclo do ácido cítrico para realizar a respiração
celular, e este complexo liga a via metabólica da glicólise ao ciclo do ácido cítrico
 A descarboxilação do piruvato também é conhecida como a "reação da piruvato desidrogenase"
porque também envolve a oxidação do piruvato

Conheça a transdução de sinais

 Transdução de sinal é a conversão de informação em uma mudança química
o O sinal representa informações que são detectadas por receptores específicos e
convertidas em uma resposta celular, que sempre envolve um processo químico

Conheça mensageiros secundários

 Os segundos mensageiros são moléculas que transmitem sinais de receptores na superfície
celular para moléculas alvo dentro da célula, no citoplasma ou no núcleo
o Eles transmitem os sinais de hormônios, fatores de crescimento e outros, e causam
algum tipo de mudança na atividade da célula
o Eles amplificam muito a força do sinal
o Mensageiros secundários são um componente das cascatas de transdução de sinal

Conhecer a função do receptor tirosina quinase (RTK)

 Receptor tirosina quinases (RTK) são os receptores de superfície celular de alta afinidade para
muitos fatores de crescimento polipeptídico, citocinas e hormônios
o Mostrados não só para ser reguladores chave de processos celulares normais, mas
também têm um papel crítico no desenvolvimento e progressão de muitos tipos de
câncer

Conheça a via das pentoses fosfato

 A via das pentoses fosfato leva à oxidação da glicose 6-fosfato em pentoses fosfatos
o É um processo que gera NADPH e pentoses
o Há duas fases distintas no caminho
 A primeira é a fase oxidativa, na qual o NADPH é gerado, e a segunda é a síntese
não oxidativa de açúcares de 5 carbonos
 Esta via é uma alternativa à glicólise
Reconhecer enzimas do ciclo do ácido cítrico
 Veja o diagrama acima

Saiba a diferença entre vias catabólicas e anabólicas

 As vias catabólicas degradam nutrientes orgânicos em produtos finais simples, a fim de extrair
energia química e convertê-la em uma forma útil para a célula
 As vias anabólicas começam com pequenas moléculas precursoras e as convertem em
progressivamente maiores e mais complexas

Conhecer análogos do estado de transição

 Análogos do estado de transição são compostos químicos com uma estrutura química que se
assemelha ao estado de transição de uma molécula de substrato em uma reação química
catalisada por enzimas
o Os análogos do estado de transição não sofrem uma reação química e podem atuar
como inibidores enzimáticos, bloqueando seu sítio ativo

Conheça as serinoproteases
 Serinoproteases são proteases (enzimas que cortam ligações peptídicas em proteínas) em que
um dos aminoácidos no sítio ativo é a serina

Saiba o que é quimotripsina

 A quimotripsina é uma enzima digestiva que pode realizar proteólise (degradação/digestão
dirigida de proteínas por enzimas celulares chamadas proteases ou por digestão intramolecular)
 o Preferencialmente cliva ligações amidas peptídicas onde o lado carboxila da ligação
amida é uma tirosina, triptofano ou fenilalanina
 Eles contêm um anel aromático em sua cadeia lateral que se encaixa em uma
bolsa hidrofóbica da enzima

O que é uma solução de buffer?

 Uma solução tampão é uma solução aquosa constituída por uma mistura de um ácido fraco e
sua base conjugada ou uma base fraca e seu ácido conjugado

O que é equilíbrio?
 Quando um sistema está em equilíbrio, a taxa de formação do produto é exatamente igual à
taxa na qual o produto é convertido em reagente
o Não há variação líquida na concentração de reagentes e produtos; um estado
estacionário é alcançado

O que é fosforilação?
 A fosforilação envolve a transferência de grupos fosforílicos
 O objetivo disso tem a ver com a mudança conformacional
 Fosforilação é a adição de um grupo fosfato a uma proteína ou outra molécula orgânica
o A fosforilação ativa ou desativa muitas enzimas proteicas

O que é a cadeia de transporte de elétrons?

 Uma cadeia de transporte de elétrons acopla uma reação química entre um doador de elétrons
(como NADH) e um aceitador de elétrons (como O2) à transferência de íons H através de uma
membrana, através de um conjunto de reações bioquímicas mediadoras
o Os íons H são usados para produzir trifosfato de adenosina (ATP), o principal
intermediário em organismos vivos à medida que se movem de volta através da
membrana
o ETC são usados para extrair energia da luz solar (fotossíntese) e de reações redox, como
a oxidação de açúcares (respiração)