Biologia Molecular

ÁCIDOS
NUCLEICOS

✓ DNA, RNA

✓ Armazenamento
da informação
genética

✓ Polímeros de
nucleotídeos
 DNA E RNA
 Polímeros de
nucleotídeos

 Esqueleto de
ribose-fosfato ligado
às bases nitrogenadas
Técnicas e Biotecnologia do
Ácido Nucléico
 Técnicas de biologia molecular
• São as que utilizam o acido nucléico (DNA ou
RNA) provenientes de amostras biológicas
como matéria-prima para a realização dos
mais variados procedimentos. O material
genético esta disperso no citoplasma, como
nos procariotos ou no núcleo e em organelas,
como nos eucariotos. É necessário a
separação do acido nucléico do restante dos
constituintes celulares, usando técnicas de
extração.
 Purificação de ácidos nucléicos
• Amostras: punção de vasos sanguíneos, biópsias,
esfregaços, cultivos de microrganismo ou fragmento de
tecidos; envolvem pequenas quantidades de material;
estabilizar a amostra (RNA DEGRADA RAPIDAMENTE) -
nitrogênio líquido ou conservantes químicos; a amostra
liquida é centrifugada e a sólida fragmentada, para
favorecer a extração.
• Extração da molécula: é preciso lisar a célula e separar a o
ácido nucléico de uma mistura de moléculas; envolve
tratamento com solução tampão (Tris: tris-hidroxi metil
amino-metano para manter o pH de 7,8 e evitar
degradação por dexosirribonucleases) contendo
detergentes (SDS-dodecilsulfatode sódio, tween-20,
tritonX-100) para romper membranas por interagir com
lipídeos; sais (NaCl) para desnaturar proteínas e agregar o
DNA; EDTA (acido etileno diamino tetra-acético) para
quelar Cálcio e Mg, inibindo mais as Dnases.
Separação dos constituintes celulares: usa-se solventes orgânicos
fenol ou clorofórmio) que separa as proteína do ácido nucléico,
por precipitação.
• Preciptação do DNA: na presença de baixa temperatura, alta
concentração salina e álcool (etanol absoluto, isopropanol) o
DNA forma um aglomerado de filamentos esbranquiçados,
que podem ser pescados por bastão de vidro; também
membranas filtrantes com alta afinidade pelo DNA em alta
concentração salina e baixa afinidade em baixa concentração
salina.

• Lavagem: com etanol 70% (remoção de sais, detergentes, e

impurezas), secagem por evaporação e dissolução em tampão
TE(Tris-HCl e EDTA) ou água ultrapura
Concentração e qualidade do DNA
• POR Espectrofotometria: medir a luz
absorvida pelo DNA em comprimento de onda
de 260nm; quanto maior a absorbância, maior
a concentração do DNA. 1,0 Absorbância
corresponde a 50 ug de DNA(fita dupla) / mL.
– Conc DNA (ng/uL) = A260nm X FD X 50
• FD = fator de diluição
• Qualidade DNA
PUREZA DNA = A260nm/A280nm.
1,4 a 2,0 pureza adequada DNA; abaixo presença de proteínas e outros contaminantes
Por Eletroforese: separa moléculas com carga (DNA, RNA, proteínas),
pela passagem de corrente elétrica.
Ácidos nucléicos tem carga elétrica negativa e migram para o polo positivo;
quanto menor a molécula, maior a migração; moléculas com mesma carga
migram igual e se localizam na mesma banda.
Suporte: aplica a amostra agarose, gel de poliacrilamida (PAGE)
Tampão: mantém o pH
Amostra: com açúcar para dar densidade e corante
para acompanhar a migração; padrão
Detecção: pela marcação radioativa das amostras
- por luminescência, por brometo de etídio (que se
“empilha” entre as bases da molécula de DNA,
conferindo cor laranja ao ser iluminado com UV),
nitrato de prata em PAGE
 Processos bioquímicos
envolvendo os ácidos nucléicos
 REPLICAÇÃO
Processo de Replicação: duplicação do DNA
com extrema precisão, antes de cada divisão
celular.
Deve-se gerar uma nova molécula de DNA, com a
mesma sequência de bases existentes na
original, perpetuando as funções que executam
na descendência.
As fitas parentais servem como molde; o novo
DNA tem uma fita parental e uma fita recém-
sintetizada, sendo SEMICONSERVATIVA
 REPLICAÇÃO DO DNA
✓ O DNA é composto por uma
dupla-hélice;

✓A Replicação é semi-
conservativa: as bases
presentes em uma das fitas
contém toda a informação
necessária para a síntese da
nova fita

✓A complementaridade das
bases A = T, G = C

✓ As duas fitas do DNA são

antiparalelas
• ENZIMAS ENVOLVIDAS NA
REPLICAÇÃO
 DNA topoisomerase I : se associa a cadeia
parental (antes da ação da helicase) e rompe
ligação fosfadiester;

DNA helicase: desenrola as fitas, quebra as pontes de

hidrogênio entre as bases das duas fitas;
Ligação de proteínas de fita simples (SSB) nas fitas
simples, para manter desenrolada;

RNA primase – fabrica e coloca o primer - pequeno

filamento de nucleotídeos ao qual se adiciona o
nucleotídeos seguintes;

DNA polimerase – catalisam a adição de nucleotídeos

no filamento em crescimento, da extremidade 5´ para
a 3´, após a ligação do PRIMER (os quatro tipos de
nucleotídeos na presença de Mg2+).

DNA polimerase III – com 10 subunidades, responsável

pela polimerização 5´→3´ da fita de DNA recém-formada
(e tbtem atividade de revisão e reparo).
DNA polimerase I – repara e remenda o DNA danificado;
também remove fragmentos de RNA (primer)
posteriormente

DNA ligase – reconstitui a nova fita, refazendo ligações fosfodiester

dos fragmentos.
• Uma das fitas é formada continuamente de
5´→ 3´ (fita líder) e outra de maneira
descontínua no sentido inverso, para que seja
mantida a direção 5´→ 3´ (fita retardatária) –
replicação é feita pelos Fragmentos de
OKASAKI (1000 a 2000 nucleotídeos).
• Replicação se inicia em um ponto específico
(origem de replicação) e prossegue em
direções opostas gerando forquilhas de
replicação.
• Surgem várias forquilhas nos eucariotos.
Transcrição E TRADUÇÃO
1 - Transcrição

2 - Tradução
 Clonagem
• Moléculas de DNA contendo segmentos
ligados covalentemente e derivados de duas
ou mais fontes, são denominados DNA
RECOMBINANTE (ou quimérico).
• Só foi possível graças a endonucleases de
restrição.
• Depende da presença de “extremidades
adesivas”.
Ferramentas para estudo de Ácidos nucléicos
• Endonucleases de restrição (ou tesouras
moleculares): isoladas de fagos,
existem mais de 800 dessas enzimas com mais de
100 seqüências reconhecidas;
– Produzem fragmentos de DNA de tamanho
manuzeável e de tamanha adequado.
– Hidrolisam ligações fosfodiester de ambas as fitas de
DNA, em sítios extremamente específicos;
– São úteis no seqüenciamento do DNA.
• Cada endonuclease de restrição hidrolisa
somente uma ligação específica do DNA –
chamado sítios de ação. Estes sítio são lidos
de forma idêntica tanto da esquerda para a
direita como da direita para a esquerda –
PALINDROMO.

• 22 02 2022
Todos tem sequência Palindromo
• Ex.:
– EcoRI (E.coli) age no sítio 5’-GAATTC-3’ em uma fita e
na outra fita complementar 3’-CTTAAG-5’;
– LIGAÇÃO HIDROLISADA ENTRE G e A.
• A mesma clivagem ocorre nas duas fitas do DNA;
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’

3’- CTTAA G-5’

5’- G AATTC-3’

– os quatro resíduos de nucleotídeos - duas adeninas e

duas timinas existem em cada uma das fita opostas
entre as duas clivagens; geram as EXTREMIDADES
ADESIVAS.
– Após tratamento com EcoRI, ligeiro aquecimento ou
movimento rompe as ligações das bases, havendo
separação.
Extremidades
adesivas
• Algumas enzimas podem gerar
EXTREMIDADE CEGA, como a HaeIII, que
não tem utilidade na Biologia Molecular.
• 5’-GGCC-3’ ‘5-GG CC-3’
HaeIII

• 3’-CCGG-5’ 3’-CC GG-5’

(CORTE DE EXTREMIDDE CEGA)
Construindo o DNA recombinante
• Se o DNA de dois organismos diferentes
possuir sítios de reconhecimento para a
mesma endonuclease de restrição, os dois
DNAs terão o mesmo tipo de extremidades
adesivas (quando forem tratadas com essas
enzimas) e irão se ‘fundir” se forem
misturadas após a digestão com a enzima.
• A “fusão” será feita com a DNA ligase.
• Para aumentar o rendimento do processo, um
dos DNAs envolvidos é de um
microorganismo (plasmídeo de bactéria ou
bacteriófago de vírus), que se multiplica com
rapidez, para que o número de cópias de DNA
clonado obtido seja suficiente.
• Clone: população geneticamente idêntica de
organismos, células, vírus, moléculas de DNA.
Produzindo vetor 1 - VÍRUS: tratar o DNA
humano e o do vírus com a
mesma endonuclease de
restrição; misturar os dois
para que as extremidades
adesivas se anelem e tratar
com DNA ligase, produzindo o
DNA recombinante.
O DNA clonado será
recoberto pelas proteínas de
revestimento viral, permitindo
que o vírus se forme.
Semear o vírus (bacteriófago)
sobre colônia de bactérias; o
segmento clonado em cada
placa de lise (onde o
bacteriófago cresce e mata a
bactéria) poderá ser
identificado por uma
característica inserida junto
com o gene humano.
O Bacteriófago é chamado de
VETOR.
2 – Plasmídio: DNA bacteriano, que não faz parte do cromossomo circular principal
do DNA da bactéria e replica de forma independente do DNA, podendo ser
transferido de uma cepa bacteriana para outra por contato célula a célula.
O gene exógeno éinserido por ação de endonucleases de restrição e DNA ligase.
Ao transferir o plasmídeo modificado, o gene exógeno vai junto....
Para a transformação de uma bactéria (fazer com que ela incorpore um
plasmídeo) é preciso:
Choque térmico a 42◦C, seguido pelo banho de gelo;
Eletroporação, por colocar a bactéria em um campo elétrico.
 Seleção das bactérias transformadas
• Os plasmídeos selecionados devem ter algum
tipo de marcador selecionável (geralmente
resistência a algum antibiótico); crescer as
bactérias em meio contendo o antibiótico – desse
modo só as bactérias contendo o plasmídeo e
portanto RESISTENTES crescerão.
• Ex.: pBR322 plasmídeo de E.coli, que confere
resistência a tetraciclina e ampicilina.
• A bactéria contendo o DNA modificado, é
cultivada em tanques de fermentação, onde elas
se dividam rapidamente, amplificando o gene
inserido em muitos milhares a mais (clonagem).
 Amplificação de DNA pela reação em
cadeia da DNA polimerase (PCR)
• Técnica de multiplicação de moléculas de DNA em laboratório, baseada no
processo celular de multiplicação de moléculas.
• Etapas
– Desnaturação: temperatura acima de 90º C, com rompimento das pontes de
hidrogênio entre as BN das duas fitas complementares
– Anelamento: temperatura a 45-65º C, com pareamento dos primers nas
extremidades 3’ e 5’
– Extensão (ou polimerização): na temperatura de 72º C a DNA polimerase irá
adicionar nucleotídeos, conforme a fita molde.
• Etapas são repetidas de 20 a 30 ciclos, e em cada ciclo, a molécula de
DNA é duplicada in vitro no TERMOCICLADOR (onde há tubos com: água,
DNA molde, desoxirribonucleotídeos, primers, TaqDNA polimerase que
não desnatura a temperaturas elevadas e cloreto magnésio)
• RT-PCR: para fazer cópias do DNA a partir do RNAm;
utiliza-se a transcriptase reversa;
• PCR em tempo real: além do primer, é adicionado
uma sonda complementar à região do DNA
localizada entre os dois primers, contendo uma
molécula fluorescente em uma extremidade e um
inibidor na outra extremidade; essa sonda só emitirá
fluorescência quando degradada pela atividade de
5’-3’ exonuclease da enzima Taq polimerase. Assim a
fluorescência será medida a cada ciclo por um
computador acoplado ao termociclador e será
proporcional a quantidade de DNA sintetizado.
 Sequenciamento de ácidos
nucléicos
• A informação contida no DNA ou RNA possibilita identificar o organismo
ao qual pertence, diagnosticar uma doença genética e diferenciar cepas
de organismos patogênicos.
– Método de Sanger e colaboradores (1970): técnica para a
determinação da sequência nucleotídica; produz fragmentos de DNA
com tamanhos diferentes que diferem em um nucleotídeo; utiliza-se
como molde uma fita simples de DNA e um primer, que sinaliza qual
sequencia deve ser produzida; há uma mistura de dos 4 tipos de
desoxinucleotídeos normais e dos quatro tipos de
didesoxiribonucleotídeos* (marcados) em pequenas quantidades;
quando o didesoxiribonucleotídeo é incorporado, a síntese da
molécula de DNA é interrompida. Assim, geram-se fragmentos
diferentes do DNA, e pela comparação desses fragmentos se define a
sequencia final.