Enzimas de restrição: As tesouras moleculares

 A partir da década de 1970, ficou mais fácil analisar a molécula de DNA com o isolamento da
enzimas de restrição. Estas enzimas são endonucleases, ou seja, no interior (daí o prefixo endo-
dentro) das moléculas de DNA, cortando-as em locais bem definidos.

São enzimas produzidas normalmente por

bactérias e que possuem a propriedade de
defendê-las de vírus invasores. Essas
substâncias “picotam” a molécula de DNA
sempre em determinados pontos, levando a
produção de fragmentos contendo pontas
adesivas, que podem se ligar a outras
 
pontas de moléculas de DNA que tenham
sido cortadas com a mesma enzima.  Em
Engenharia Genética, a obtenção dos
fragmentos de DNA serve para criar, in
vitro (em tubo de ensaio ou no laboratório),
novas moléculas, recortando e colando
vários pedaços de informações.
Uma das primeiras enzimas de restrição a ser isolada foi a EcoRI, produzida pela
bactéria Escherichia coli. Essa enzima reconhece apenas a sequência GAATTC e atua sempre
entre o G e o primeiro A.

O local do “corte”, o local de uma enzima, é conhecido como sítio alvo. Você pode perguntar por
que essa enzima não atua no DNA da própria bactéria? Isso não ocorre devido à existência de
outras enzimas protetoras, que impedem a ação das enzimas de restrição no material genético da
bactéria.

As enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre sequências específicas de DNA,

catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a
determinadas bases. Os nucleotídeos entre os quais a enzima corta, ou seja, entre os
quais promove a hidrólise, encontram-se no interior dessas mesmas sequências específicas de
reconhecimento (ver imagem).

Cada molécula de DNA pode ser composta de várias repetições da sequência GAATTC ao longo de
toda sua extensão. Portanto ao contato com a ezima EcoRI a fita de DNA pode ser clivada
"cortada" em diversos lugares, gerando vários pedaços, de tamanhos diferentes.
 

E como se separa estes diferentes pedaços de DNA clivados?

A multiplicação dos fragmentos de DNA

Ocorrendo a fragmentação das moléculas de DNA, com o uso das enzimas de restrição, e o seu
reconhecimento pela técnica de eletroforese em gel, o próximo passo é multiplicar (clonar) o
fragmento obtido e submetê-los à tecnologia do DNA recombinante. A técnica de multiplicação
da fita de DNA é chamada de PCR (reação em cadeia da polimerase).

Na década de 1980, passou-se a utilizar a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um
único pedaço de DNA. Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns
compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima
que faz a replicação do DNA).
Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é
se ligam por complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar.  Quando
uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas
diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso,
precisamos de dois tipos de primers diferentes (veja a figura)

Técnica de PCR, passo a passo

Obtém-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana.

1. A amostra de DNA, a enzima que faz a

replicação (DNA polimerase), os
nucleotídeos de DNA e os primers
complementares a sequência de DNA são
colocados em um tubo de ensaio.
2. Coloca-se o tubo de ensaio em uma
máquina de PCR (máquina que aumenta e
  diminui a temperatura de acordo com um
programa). Os passos seguintes, de
aquecimento e resfriamento, acontecem
dentro da máquina controlados pelo
programa.
3. Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar
(separar a dupla fita) o DNA.

                
          4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas
cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas
fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase.

          5. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA

polimerase) para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os
nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova
fita dupla.

Separando fragmentos de DNA: eletroforese em gel

 

Como vimos no item anterior, os fragmentos de DNA formados com a ação das enzimas de
restrição possuem tamanhos diferentes. A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais
utilizada é a eletroforese através de géis de agarose. 

A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e então
gelifica quando esfria como a gelatina. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é
preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é
aplicada através do gel. Como oDNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo
positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de
agarose. 
Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente
que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migração de fragmentos de DNA lineares
através da agarose é inversamente proporcional a log10 de seus pesos moleculares.

É possível calcular o tamanho exato de um dado fragmento com base na sua razão de
migração. Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com
brometo de etídeo, que possui afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em
contato com a luz ultravioleta. Dessa forma pode-se localizar as bandas que correspondem ao
DNA. Os fragmentos de DNA podem, então, ser isolados e purificados a partir dos géis de agarose.

 
 
E agora? O que se faz com esses fragmentos de DNA?

Olhe a técnica do DNA recombinante

 
 A tecnologia do DNA recombinante

Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do resto do material genético, contém um ou
mais genes. Lembre-se que cada gene origina uma proteína, portanto ao estudarmos o gene
estamos estudando a proteína que ele codifica.

Mas o que devemos fazer para estudar o gene?

Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA) de um hospedeiro para que ocorra a
transcrição do gene, em mRNA, e a tradução em proteína.

O hospedeiro é um organismo que se multiplica (se reproduz) rapidamente, como por exemplo,
as bactérias. Quando as bactérias se reproduzem por bipartição elas transmitem ao seus “filhos” o
seu material genético, portanto se neste material conter o fragmento de DNA de estudo, em pouco
tempo teremos milhões de bactérias com o gene.

O plasmídio é o material genético circular não ligado ao cromossomo que fica espalhado pelo
hialoplasma das bactérias. Ele sofre o mesmo processo do DNA cromossomal de transcrição e
tradução, além de, se multiplicar a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula
“filha”.

O plasmídio é retirado das células bacterianas para que se possa inserir o gene de estudo, para
depois recolocá-lo na bactéria.

 
  

Para entendermos melhor vamos conhecer esse processo passo a passo (acompanhe na
figura):

1. Os pesquisadores querem estudar um gene humano que produz uma proteína que não se
sabe a função.

2. Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene

de interesse.

3. Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obtermos várias
cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).

4. A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizada para clivar o plasmídio
bacteriano. Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que
são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima.

5. A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo o gene) e

uma enzima chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o
chamado DNA recombinante. Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma
bactéria hospedeira.

6. A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que

possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. Após muitas gerações de
bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das
bactérias (são separadas das proteínas das bactérias).

 
  

Esse método produz uma grande quantidade de proteínas humanas possibilitando

assim, seu estudo.

PCR - Amplificação de DNA in vitro Básico

Publicado em 24/11/2005 

Fundamentos da Técnica de PCR

Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da
Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método que
permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado
fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular,
tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense
entre muitas outras para além da Investigação em Biologia.
A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reacção em cadeia pela polimerase) baseia-se no
processo de replicação de DNA que ocorre in vivo  . Durante o PCR são usadas elevadas
temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo
então a ligação de oligonucleótidos iniciadores (primers), também em cadeia simples e
geralmente constituídos por 15 a 30 nucleótidos, obtidos por síntese química. Para amplificar
uma determinada região são necessários dois iniciadores complementares das sequências que
flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a
actuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar, usando como molde
cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar (figura 1).

Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino
contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes
do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que
consistem em:
 Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a
separar as duas cadeias
 Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples.
Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a
temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC
da sequência a amplificar)
 Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia
molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC)
O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo
possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente (figura 2).
Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de
DNA aumentaria 225 vezes embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de
amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes.
Como na técnica de PCR se encontram envolvidos vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido
equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de
aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizável, as DNA polimerases utilizadas deverão
ser termoestáveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe
termofílicaThermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas
levando assim a um aumento da especificidade da reacção. De referir ainda que o produto de
PCR pode ser visualizado após electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado
por comparação com padrões lineares de DNA.