MÓDULO III

PCR
Reacção em
Cadeia da Polimerase: fotocopiadora molecular

Laboratório Virtual de Biotecnologia

Introdução O que é a técnica de PCR?

O desenvolvimento da Reacção em A PCR explora de uma forma
Cadeia da Polimerase (Polymerase espantosa a função natural de um
Chain Reaction – PCR), em meados grupo de enzimas denominadas
dos anos oitenta, pode considerar-se polimerases. Estas enzimas
como uma revolução dentro de outra. encontram-se presentes em todos os
Esta técnica veio possibilitar novas seres vivos e têm como função copiar
estratégias de análise de genes no o material genético (além de
âmbito da tecnologia de DNA corrigirem os erros que podem
recombinante, iniciada nos anos ocorrer durante o processo de cópia).
setenta. Esta técnica permite a Uma reacção de PCR necessita
análise de quantidades ínfimas de essencialmente da presença da
material genético o que possibilita um sequência de DNA que se pretende
melhoramento das técnicas utilizadas amplificar, de um par de sequências
no diagnóstico genético, investigação nucleotídicas iniciadoras (que
forense, sistemática, etc. normalmente são denominadas
De acordo com Mark Hughes, primers), de nucleótidos (A, T, G e C)
Director do National Center for Human e de uma polimerase. Os primers são
Genome Research at the National pequenas sequências de DNA de
Institutes of Health, a técnica de PCR cadeia simples, desenhadas em
“é a tecnologia mais importante dos laboratório (ou encomendadas a
últimos anos”. A revista Science empresas de Biotecnologia
refere ainda que, por ser muito mais especializadas), que são
simples e menos dispendiosa que complementares às extremidades 3’
todas as técnicas anteriormente do segmento de DNA relevante.
utilizadas na duplicação de DNA, esta Assim, durante a reacção de PCR, os
técnica democratizou a investigação primers irão flanquear a sequência
genética, colocando-a ao alcance de que queremos amplificar. Deste
todos os biólogos. modo, é necessário obter alguma
informação sobre a sequência de
DNA, ou sobre as sequências
flanqueantes, para levar a cabo uma

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reacção de PCR. Os primers são ciclo demora apenas alguns minutos
misturados em excesso com a e, por isso, todo o processo é muito
amostra de DNA e a enzima rápido (Fig.1).
polimerase. Adiciona-se ainda
magnésio (cofactor da polimerase) e Desnaturação da amostra
os nucleótidos. para separar as cadeias de
DNA (95 ºC, 5 min.)
A reacção de PCR consiste numa série
de ciclos, cada um dos quais
envolvendo três passos efectuados a
Emparelhamento
diferentes temperaturas: dos primers
(55 ºC, 30 s)
A desnaturação (Passo 1) consiste na
incubação do DNA a uma temperatura
de 95 ºC para separar as cadeias
simples. Segue-se o emparelhamento Desnaturação Síntese de DNA
(95 ºC, 30 s) (72 ºC, 2 min.)
dos primers (Passo 2) que flanqueiam
o DNA, diminuindo gradualmente a Figura 1 – Um ciclo de PCR.
temperatura para cerca de 55 ºC.
O resultado final é a amplificação
Esta temperatura varia dependendo
das sequências de DNA delimitadas
da composição do primer e da sua
pelos dois primers utilizados na
complementaridade com o DNA alvo.
reacção. Na prática obtém-se uma
Durante este passo, as duas cadeias
quantidade enorme de um DNA alvo
complementares do DNA alvo
partindo de uma mistura complexa
permanecem desnaturadas porque
em que esta molécula pode estar
estão em concentração baixa e não se
presente como cópia única. Esta
encontram para emparelhar. Como
quantidade é suficiente para que o
estão presentes em concentração
DNA possa ser directamente
muito alta, os primers emparelham
visualizado num gel de agarose.
com as regiões flanqueantes do DNA
As temperaturas elevadas que se
alvo. Finalmente, para completar o
utilizam durante cada ciclo de PCR
ciclo, é feita a síntese de DNA pela
requeriam o uso de uma polimerase
DNA polimerase a uma temperatura
estável, ou seja, de uma enzima que
de 72 ºC (Passo 3). Esta enzima faz a
não desnaturasse cada vez que fosse
extensão dos primers, utilizando como
exposta a temperaturas altas. No final
molde a cadeia a que cada primer
da década de 80 foi isolada a primeira
está emparelhado.
enzima termoestável a partir da
O ciclo de desnaturação (95 ºC),
bactéria Thermus aquaticus. Esta
emparelhamento (55 ºC) e síntese
bactéria vive junto a fontes
(72 ºC) é repetido várias vezes. Cada
hidrotermais (cuja temperatura ronda

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os 80 ºC) e a sua polimerase, O aparecimento da Taq DNA
designada Taq DNA polimerase, polimerase e dos termocicladores
mantém-se activa, mesmo quando permitiu a proliferação desta técnica
exposta repetidamente a de tal modo que, actualmente, está
temperaturas de 95 ºC, fazendo com ao alcance de virtualmente todos os
que seja ideal para ser utilizada na cientistas e estudantes.
PCR.
Quando esta técnica começou a Aplicações da técnica de PCR
ser utilizada, os ciclos de temperatura A PCR tem tido uma diversidade
eram obtidos através da transferência de aplicações crescente. É utilizada
manual dos tubos da reacção entre actualmente para amplificar DNA:
diferentes recipientes postos em para ser directamente sequenciado ou
banhos-maria a temperaturas clonado; para mapeamento de genes;
específicas. Esta actividade era para diagnóstico de doenças
entediante para os cientistas e podia hereditárias e doenças infecciosas;
provocar o aparecimento de erros, para estudos forenses; e, entre
uma vez que era difícil manter os outros, para estudos moleculares de
banhos à temperatura ideal e evolução. Uma das capacidades mais
controlar bem os tempos de cada surpreendentes desta técnica é a
banho. Este problema foi ultrapassado capacidade de amplificar DNA de
quando se inventaram os organismo extintos, alguns há vários
termocicladores automatizados. milhões de anos.
Nestes, os tempos e as temperaturas
de cada fase do ciclo são introduzidos PCR: a fotocopiadora molecular
no computador e são executadas A técnica de PCR está a fazer com
precisamente sem ser necessário o material genético o que a invenção
transferir os tubos da reacção de da prensa fez com o material escrito:
recipiente em recipiente (Fig.2). está a tornar acessíveis inúmeras
cópias de material genético de um
modo rápido e barato. Em princípio
esta técnica pode reproduzir o
material genético de qualquer
organismo em quantidades ilimitadas.
Deste modo, podemos analisar de um
modo simples o material genético de
qualquer organismo, incluindo o
Homem. Facilmente vemos as
inúmeras vantagens que esta técnica
Figura 2 – Termociclador automatizado.

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trouxe à Biotecnologia, tendo quase
imediatamente ocupado um lugar de
destaque em inúmeras áreas da
investigação.

Questões de análise
No Laboratório Virtual de
Biotecnologia encontrará uma
animação que ilustra e explica cada
etapa da técnica de PCR (canal 1 da
LVBtv).

1 – Descreva o que ocorre durante

um ciclo da técnica de PCR.

2 – Enumere as principais vantagens

desta técnica relativamente a outras
utilizadas anteriormente para
amplificar moléculas de DNA.

3 – Faça uma lista do material

necessário para realizar uma
experiência utilizando esta técnica.

4 – Indique as principais áreas onde

se pode aplicar esta técnica.

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 ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA

Todos os pares de primers

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Teoria: amplificam do mesmo modo a Conclusões:

mesma molécula de DNA?

Princípios:
ƒ

ƒ
Registos/Observações:
Pista 1 Pista 2
ƒ

Conceitos:
Desenho experimental:

Pista Pista
Material biológico
1 2
DNA alfa-C5
DNA beta-A7
Par de primers 1
Par de primers 2
 ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA

Um par de primers

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Teoria: apresenta sempre o mesmo Conclusões:

resultado,

Princípios: independentemente da

ƒ molécula de DNA a
amplificar?

ƒ
Registos/Observações:
Pista 1 Pista 2
ƒ

Conceitos:
Desenho experimental:

Pista Pista
Material biológico
1 2
DNA alfa-C5
DNA beta-A7
Par de primers 1
Par de primers 2
 ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA
A quantidade de DNA
amplificado está

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Teoria: Conclusões:
dependente do número
de ciclos de temperatura
Princípios:
que se efectua?
ƒ

ƒ
Registos/Observações:
Pista 1 Pista 2
ƒ

Conceitos:
Desenho experimental:

Pista Pista
Material biológico
1 2
DNA alfa-C5
DNA beta-A7
Par de primers 1
Par de primers 2