Biologia Molecular

PCR
Reação em cadeia polimerase - polymerase chain reaction
 Reação em cadeia polimerase - PCR
(polymerase chain reaction)

Década de 1980

Baseado na amplificação de um fragmento de DNA pela

extensão de dois oligonucleotídeos (primers ou
iniciadores) que hibridam com as fitas complementares de
uma sequência molde (alvo ou template)
Amplificação, in vitro, de milhares ou milhões de vezes de moléculas de DNA

Rápida
Simples
Sensível

Possibilita a amplificação de DNA a partir de uma quantidade mínima de

amostra.
• Pesquisa básica
• Pesquisa aplicada
• testes de identificação genética
• medicina forense
• diagnóstico de doenças infecciosas
• controle de qualidade industrial
 PCR
Repetidos ciclos de variação da temperatura que permitem:

 Desnaturação do DNA molde

 Hibridização dos primers às suas sequências complementares

 Extensão dos primers hibridizados pela DNA polimerase

1. Dois iniciadores oligonucleotídicos, que flanqueiam o
DNA-alvo são adicionados em grande excesso ao DNA-
-molde que é desnaturado termicamente.

2. À medida que a mistura é resfriada, o excesso de

iniciadores complementares ao DNA-molde garante que
a maioria das fitas-molde irá parear-se com um
iniciador, em lugar de parearem-se umas com as outras.

3. A DNA-polimerase então promove a extensão dos

iniciadores, utilizando o DNA original como molde
4. Após um período de incubação adequado, a mistura é
novamente aquecida para separar as fitas. A mistura é
então resfriada, para permitir a hibridização dos
iniciadores nas regiões complementares dos DNA
recém-sintetizados, sendo todo o processo repetido

https://www.youtube.com/watch?v=JYY8TLu3hjU
 A PCR utiliza ciclos repetidos de separação,
hibridização e síntese das fitas para amplificar o DNA

Acúmulo exponencial de um fragmento específico cujas

extremidades são definidas pelos primers
PCR convencional
 PCR convencional

Oligonucleotídeos iniciadores de uma PCR

direcionam
PCR convencional
Etapa 1: Desnaturação
Etapa 2: Anelamento
Etapa 3: Extensão
 SEPARAÇÃO DO DNA

ELETROFORESE EM GEL
ELETROFORESE EM GEL

 O gel (seja de agarose ou de poliacrilamida)

forma uma malha

 Voltagem – corrida de moléculas carregadas

 Quanto menor a molécula, maior a distância

percorrida

 Aplica-se um padrão com tamanhos

conhecidos
 Eletroforese em gel, seja de agarose ou de poliacrilamida, contém uma rede
microscópica de poros
 Os fragmentos de DNA são separados de acordo com o tamanho - aqueles fragmentos
maiores migram mais lentamente
 Variações no procedimento de PCR foram desenvolvidas

Gerar DNA a partir de um molde de RNA

Monitorar, por exemplo, se um gene é Diagnóstico de vírus de RNA

expresso ou para produzir um gene
eucarioto sem íntrons que pode ser
expresso em bactérias
A PCR pode ser utilizada para detectar a presença de um
genoma de vírus em uma amostra de sangue
 q-PCR ou PCR em tempo real
 Método de detecção e quantificação confiável dos produtos
gerados durante cada ciclo de amplificação

 Um único equipamento tem a capacidade de amplificar e detectar

o material analisado
Aparelho utilizado: termociclador + detector de
fluorescência

https://www.youtube.com/watch?v=pRwoOBuk00c
q-PCR ou PCR em tempo real
 Fluorescência mínima (eixo y) da fase exponencial de
amplificação gênica corresponde ao threshold,
ou cut-off, que é traçado horizontalmente no gráfico,
e é utilizado para calcular o limite de ciclo (CT) de
cada amostra.
 CT corresponde ao número de ciclos de PCR
necessários para o início da visualização da
amplificação, ou seja, o momento em que a
fluorescência emitida ultrapassa a linha do limite.
 O CT tem relação inversamente proporcional à
quantidade de sequência alvo presente na amostra.
  O ponto em que o “threshold” cruza com a linha de amplificação da amostra, permite determinar o número
de ciclos necessários para o início da amplificação da sequência gênica-alvo presente no DNA de cada
amostra.
 Este valor é denominado Ct (“Cycle Threshold”) e permite a quantificação relativa do DNA de cada uma das
amostras, após ser corrigido pelos Ct dos genes-controle endógenos e das amostras-controle.
Disponível em: https://www.igenomix.com.br/blog/o-que-e-a-tecnica-de-rt-qpcr-para-deteccao-dos-casos-de-covid-19/
 Platô

 O Ct é proporcional ao logaritmo da quantidade inicial de expressão do gene-alvo em uma

determinada amostra, quanto menor for o número inicial do Ct obtido do gene-alvo na
amostra, é porque houve maior amplificação do gene-alvo e, consequentemente, ele
apresenta maior expressão.

Disponível em: https://www.igenomix.com.br/blog/o-que-e-a-tecnica-de-rt-qpcr-para-deteccao-dos-casos-de-covid-19/