RT-PCR (transcrição reversa) e

PCR em tempo real

Alana Machado Costa

Biologia Molecular - Profª. Denise Fernandes

HISTÓRIA
➔ Desenvolvida por Kary Mullis na década de 80
◆ Prêmio Nobel de Química (1993).
➔ Publicação em revista de pouco impacto
◆ Methods in Enzymology
➔ 1° melhoria na técnica: Taq-polimerase (Thermus
aquaticus)
◆ máx. 117°C
◆ ativa até 95°C
◆ Temp. ótima em 72°C
➔ 2° melhoria: DNA Thermal Cycler (termiciclador
automático)
HISTÓRIA
➔ Perkin-Elmer Cetus: US$ 10.000,00
➔ Roche Molecular Systems: US$300.000.000,00
➔ Vantagens:
◆ baixo custo
◆ alta sensibilidade
◆ fácil realização
➔ Gold Standart (Padrão de Ouro)

➔ Método imonológico para detecção de HIV: 4 meses a

1 ano
➔ PCR para detecção de HIV: 40 a 70 dias
OBJETIVO E USOS
OBJETIVO USO

AMPLIFICAÇÃO DE GENES Sequenciamento de genomas

(Projeto Genoma Humano)

Concentração mínima: 5𝜇g/ml Determinação de paternidade

(0,000005g)
Diagnóstico de doenças virais (Covid-19)
(10-12 mol de DNA)
Expressão de genes

Medicina forense

…
O PROCESSO DE PCR CONVENCIONAL
⇢ EXTRAÇÃO DA AMOSTRA DE DNA + PCR + ELETROFORESE ⇠

EXTRAÇÃO DA AMOSTRA DE DNA

➢ Garantir a integridade do material extraído

1. Coleta, separação e lise do material: expor o conteúdo citoplasmático;

2. Separação da solução em fases: solventes + centrifugação;
3. Precipitação e lavagem: purificação.
O PROCESSO DE PCR CONVENCIONAL
PCR - Componentes
➢ Amplificação de segmentos específicos de DNA

1. DNA polimerase: é a enzima responsável por fazer uma cópia de uma

fita de DNA (fita-molde)
2. DNA-molde: é o DNA obtido na extração (etapa anterior), que contém o
gene que eu quero fazer várias cópias;
3. Cofatores: é uma molécula ou um íons do qual a enzima é dependente
para realizar a sua função
4. dNTP’s: desoxinucleotídeos que formaram as novas fitas de DNA
5. Primers: usados para delimitar a sequência a ser amplificada
 PCR CONVENCIONAL

RESULTADO QUALITATIVO

95°C

REPETE DE 20 A 40 VEZES
55°C

ELETROFORESE
72°C
PCR com transcrição reversa
➪ Estudo de expressão gênica (detecção
de quais proteínas estão realmente
sendo expressas)
● AMV (Avian Myeloblastosis Virus)
● M-MuLV (Moloney Murine
Laeukemia Virus)
➢ dNTP’s
➢ Primers
➢ Cofatores
➢ Inibidores de RNAses

PCR CONVENCIONAL
 PCR em tempo real
➔ SYBR GREEN - intercalados com DNA
➔ Sondas TaqMan de sequência
específica

95°C
RESULTADO QUANTITATIVO

55°C
➪ EX. Quantificação da carga viral
72°C
Pesq. agropec. bras., Brasília, v.48, n.1, p.73-79, jan. 2013
DOI: 10.1590/S0100-204X2013000100010
INTRODUÇÃO
● Malária - doença endêmica (Plasmodium falciparum)
● Vacina da alta é de alto custo ⇥ método alternativo
● A proteína PfCP-2.9 é forte candidato a vacina contra a malária
● Vacinas comestíveis ⇥ Tomate

Objetivo: obter plantas transgênicas de tomateiro expressando a

proteína PfCP‑2.9
MATERAIS E MÉTODOS
➔ Tomate variedade Summers;
➔ DNA PfCP-2.9 foi introduzido via Agrobacterium, utilizando a cepa
Agrobacterium LBA 4404 por meio de eletroporação;
◆ Obtida 2 colônias: por PCR, apenas uma apresentou os 2 genes (PfCP‑2.9 e nptII)
➔ Cotilédones de tomate de 7 dias ⇒ incubados por 20 minutos em
temperatura ambiente (Agrobacterium + acetoseringona);
➔ Meio sem acetoseringona, incubados em câmara escura de crescimento
a 23°C por 72 horas;
➔ Meio de seleção contendo 300 mg/L de ticarcilina e 50 mg/L canamicina, 4
semanas;
➔ Meio de seleção contendo 400 mg/L de ticarcilina e 100 mg/L canamicina,
8 semanas.
MATERAIS E MÉTODOS

➔ Análise de PCR: 3 plantas transformadas produziram frutos;

◆ 7 frutos da planta 1;
◆ 36 frutos da planta 2;
◆ 9 frutos da palnta 3.
➔ Extração de DNA dos frutos;
➔ Germinação das sementes;
◆ DNA dos cotilédones foi isolado pelo método CTAB;
➔ PCR Convencional: verificar a presença do gene de interesse
◆ Eletroforese em gel de agarose
MATERAIS E MÉTODOS
➔ Etapas do PCR: 30 vezes
◆ Inicialização a 94°C por 4 min;
◆ Desnaturação a 94°C por 1 min;
◆ Anelamento a 50°C por 1 min;
◆ Alongamento a 72°C por 1 min;
◆ Extensão final a 72°C por 10 min.
➔ PCR com transcrição reversa: Sementes das plantas 1, 2 e 3 da geração T0
foram germinadas e foi extraído RNA das folhas das plântulas jovens.
➔ Síntese de cDNA:
◆ 5 min a 15°C;
◆ 30 min a 42°C;
◆ 5 min a 85°C.
➔ PCR: 30 repetições
RESULTADOS E DISCUSSÃO
gene PfCP-2.9

GERAÇÃO T0 gene nptII

gene nptII
RESULTADOS E DISCUSSÃO

gene PfCP-2.9
GERAÇÃO T1 gene nptII
RESULTADOS E DISCUSSÃO

gene PfCP-2.9
GERAÇÃO T1
PCR com transcrição reversa
CONCLUSÕES

➔ As plantas de tomate transformadas com o gene PfCP‑2.9 expressam o gene do antígeno da

malária em frutos de tomate.

➔ O gene PfCP‑2.9 é transferido para a próxima geração de tomateiros.

REFERÊNCIAS
VIEIRA, D. P. Aula 1 - PCR: Princípios e tipos de Reação. Laboratório de Biologia Molecular-IPEN. (Material de aula).
Disponível em: https://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf. Acesso em: 15 mai 2022.

VIEIRA, D. P. Aula 2 - Características das Reações e Padronização. Laboratório de Biologia Molecular-IPEN. (Material de
aula). Disponível em: https://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/proto/protocolos/aula2.pdf . Acesso em: 15 mai 2022.

GARIBYAN, L. AVASHIA, N. Polymerase Chain Reaction. Journal of Investigative Dermatology, vol 133, 2013. DOI:
10.1038/jid.2013.1. Disponível em: https://www.jidonline.org/article/S0022-202X(15)36139-X/fulltext. Acesso em: 16 mai
2022.

BUSTIN, S. A. BENES, V. NOLAN, T. PFAFFL, M. W. Quantitative real-time RT-PCR – a perspective. Journal of Molecular
Endocrinology, vol 34, pg 597 - 601, 2005. DOI: https://doi.org/10.1677/jme.1.01755. Disponível em:
https://jme.bioscientifica.com/view/journals/jme/34/3/0340597.xml?rskey=heVYWc&result=20. Acesso em: 16 mai 2022.

Kantor, M. Sestras, R. Chowdhury, K. Transgenic tomato plants expressing the antigen gene PfCP-2.9 of Plasmodium
falciparum. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v 48, n 1, pg 73 - 79, jan 2013. DOI: 10.1590/S0100-204X2013000100010.
Disponível em: https://www.scielo.br/j/pab/a/wTLNJBJQdtmjThGjkZWh6kn/?lang=en#. Acesso em: 29 mai 2022.