Alunas:

 FLAVIANE SÂMELA DUTRA DE SOUSA

 GRAZIELLA CRISTINA SANTOS RODRIGUES

 JACKELINE SILVA RIBEIRO DE DEUS

 NATACHE DAMÁSIO DA SILVA SOUZA SOARES

 SAMARA MATOS LOURES

 SILONITA SANTOS BARRETO

Técnicas de Biologia Molecular
utilizadas na rotina diagnostica de
Doenças Infecciosas.
Introdução
Doenças Infecciosas

Infecção é a penetração,
multiplicação ou desenvolvimento
de um agente infeccioso em
determinado hospedeiro.

Doença infecciosa são as

consequências das lesões
causadas pelo agente e pela
resposta do hospedeiro
manifestada por sintomas e sinais e
por alterações fisiológicas,
bioquímicas e histopatológicas
Introdução

QUAIS AS TÉCNICAS ?

Técnicas de separação de moléculas

Eletroforese
 
Técnicas de detecção de moléculas
Western blot
Southern blot
Northern blot
 
Técnicas de amplificação de DNA
PCR convencional
PCR em tempo real
QUAIS SÃO USADAS NA ROTINA
DE DIAGNÓSTICOS?

 PCR em tempo real

 RT-PCR
 Multiplex PCR
 Nested PCR
Em que tipo de materiais são aplicadas as técnicas de
diagnósticos da biologia molecular?

sangue periférico;
fluidos corporais;
urina;
materiais obtidos por punção;
tecidos frescos;
tecidos embebidos em parafina.
 Métodos Moleculares

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

 Os métodos moleculares
evidenciam a molécula do DNA na
amostra do paciente diferente dos
métodos imunológicos, nos quais
se identifica a doença por meio dos
anticorpos dirigidos aos
microrganismos. A revolucionária
reação em cadeia da polimerase
(PCR) reproduz in vitro a
replicação da molécula de DNA
em grande escala e, de todas as
técnicas moleculares, esta é
considerada a mais desenvolvida.
Princípios da reação de PCR
 A técnica de PCR é quando
moléculas de DNA são amplificadas
em milhares ou milhões de novas
cópias.
 Amplificação do DNA
 Síntese de cópias idênticas de
sequências específicas de DNA.
 A cada ciclo ,o fragmento dará origem
a uma nova molécula com sequência
complementar.
 duplicação de uma dupla-fita, as duas
fitas de DNA poderão dar origem a
novas fitas complementares.
 Reação em cadeia.
 DNA com uma sequência-alvo
 DNA polimerase
 Oligonucleotídeos iniciadores
 Desoxirribonucleotídeos
 Tampão de reação
Estágios do ciclo de PCR

Desnaturação
Anelamento
Extensão

ÁUDIO DA FLAVIANE
 Variações na técnica de PCR
 PCR convencional
*Nas técnicas convencionais de PCR, a análise
dos produtos da amplificação ocorre ao final da
reação

*A solução pode ser submetida à eletroforese

* As bandas formadas podem ser analisadas

quanto ao seu tamanho e à intensidade das bandas

*Essa solução enriquecida pode ser utilizada para

sequenciamento, genotipagem e até mesmo
inserção de sequências exógenas em organismos
hospedeiros.
 PCR quantitativa (qPCR)

*A PCR quantitativa, também chamada de

PCR em tempo real, adota sistemas de
detecção dos produtos da reação a cada ciclo
de PCR e, com isso, permite a sua
quantificação. Esses sistemas de detecção
empregam marcadores fluorescentes das
cópias de

*Ele é o mais indicado em testes de detecção

de sequências presentes em baixíssimas
concentrações, como na detecção de genomas
virais em amostras biológicas
 PCR Qualitativo
A PCR qualitativa acontece nos
termocicladores convencionais e o resultado é
interpretado após uma etapa denominada pós-
PCR. Os resultados são expressos de forma
qualitativa: presença ou ausência, macho ou
fêmea, positivo ou negativo
 PCR com transcrição reversa (RT-PCR)
* Amplificação de uma sequência presente em moléculas de RNA.
É o caso de técnicas de análise de expressão de mRNA e de análise
de sequências de RNAs regulatórios, por exemplo. Nesses casos, é
realizada uma reação prévia de transcrição reversa

*Essa reação ocorre de forma bem similar à reação da PCR com a

DNA polimerase, mas adaptada às condições necessárias à síntese
de cDNA a partir de um molde de RNA pela transcriptase reversa.

*Envolve apenas um ciclo de amplificação

 Eletroforese em Gel

 Esse método é utilizado para separar

proteínas e os filamentos de DNA e
RNA, através da diferença entre
suas massas.
Southern Blot
 Por meio da autoradiografia ou
da autofluorescência, essa
técnica permite precisar a massa
molecular e verificar se
determinada sequência
encontra-se presente em um
filamento de DNA.
Northern Blot
 Essa técnica permite
analisar informações, como
a localização e a
quantidade do RNA
mensageiro, responsável
por enviar as informação
do DNA até a síntese de
proteínas nas células.
Western Blot

 Esse método é
utilizado para
análise das
proteínas e mescla
os princípios da
Southern Blot e
Northern Blot.
Conclusão