SEQUENCIAMENTO DE DNA

Eletroforese utiliza um laser para ativar os

É a identificação da ordem exata das bases
ddNTPs fluorescentes e um detector
em um segmento de DNA
distingue as cores
 A, T, G e C

O sequenciador executa a eletroforese em

SEQUENCIAMENTO DE SANGER géis capilares ultrafinos

Análise de fragmentos que chegam a cerca

de 800pb, sendo mais indicado para a
Modelos que fazem uso da técnica:
análise de regiões complexas
 Mega Bace
 Abi prism 3700
Etapa 1 - Amplificação Tipo-PCR  Abi prism 3100
 O modelo moderno é semi
 DNA polimerase
automarizado
 Primer
 Tampão
 3 dNTPs (desoxinucleotídeo)
Utilização:
 1 ddNTPs (didesoxinucleotídeo)
 Sequência de fragmentos de DNA
(clonados em plasmídeos, produtos
Etapa 2 - Eletroforese de PCR)
 Diagnóstico, pesquisa,
 Separa os fragmentos de diferentes biotecnologia
tamanhos  Sequência completa de
 Fragmentos maiores ficam mais em cromossomos e genomas
cima e fragmentos menores ficam  Sequências de transcritos de RNA
mais em baixo (correm mais) (via cDNA)

DNA polimerase (Primer + DNA

SEQUENCIAMENTO NGS
unifilamentar usado como molde) →
Mistura de reação → Eletroforese em gel →  Genomas completos
Filme de raios X → Sequência do filamento  Menor custo
novo (primer) → Converte em sequência  Maior rapidez que o método de
molde Sanger

Incorporação dos ddNTPs é aleatória PIROSEQUENCIAMENTO

Detecta a atividade da DNA polimerase
com uma outra enzima que produz
Eletroinjeção da amostra em capilares
quimiluminescência

Passa por um laser e é visto através do

Utiliza beads
cromatograma
Amplificação em PCR de emulsão

4. Sequenciamento

Os nucleotídeos incorporados podem ser

sequencialmente identificados pela
detecção de luz resultante da liberação do
ILUMINA
pirofosfato

1. Preparo da biblioteca
Apenas um DNA é ligado em cada grânulo

2. Amplificação da biblioteca de DNA

1. Construção das bibliotecas:
 Fragmentação do DNA genômico
por nebulização
 Ligação a adaptadores (A e B)
 Bioanalyzer DNAChip
 Ciclos de amplificação
 Amplificação dos clusters
3. Sequenciamento da biblioteca de DNA

 Nucleotídeos marcados
fluorescentemente (detecção do
2. PCR em emulsão - em PCR sinal)
 O adaptador permite que o DNA se
ligue em grânulos minúsculos
4. Alinhamento das sequências de DNA e
análise dos dados

ION TORRENT

O DNA é submetido à PCR de emulsão

Depois de amplificados, há a incorporação

de dNTPs e liberação de prótons (H+) no
íon chip
 Os grânulos são envolvidos em
gotas de óleo que contêm todos os
reagentes necessários para
amplificar o DNA
 Cada gota contendo o grânulo é
mantida isolada para evitar
contaminação e consegue produzir
10 milhões de cópias numa reação

3. Carregar as amostras em lâmina