BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA

4. Análise de expressão de genes e de

proteínas
Razões para analisar mRNA

• Estudos de expressão: as funções celulares/tecidulares estão

sempre relacionadas com expressão génica  análise,
caracterização e quantificação do RNA

-Quais os genes expressos num tipo particular de células

de um organismo?

-Quais os genes expressos num dado momento?

-Qual a resposta dos genes à administração de uma

droga?

-Qual a diferença na expressão génica entre células

normais e doentes (ex: neoplásicas)?
2
Northern blotting- analisar RNA

Uma das formas de caracterizar um gene, é estudando a sua expressão

num dado tipo de células ou organismo: analisar o mRNA. O Northern
blot faz-se a partir do RNA total:
Etapas do Northern/Southern blot

As diferentes etapas desta técnica resumem- se a 3 passos:

1. Separação dos ácidos nucleicos presentes na amostra de acordo com o peso

molecular (eletroforese em gel de agarose)

2. Transferência (blotting) dos ácidos nucleicos do gel para uma membrana

(nylon ou nitrocelulose)

3. Deteção da sequencia de interesse recorrendo a sondas específicas para o

DNA/RNA em estudo
 BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA

Blotting
“Southern” “Northern”
blot (DNA é desnaturado)blot

Transferência de moléculas de DNA ou de RNA de um gel…

…para uma membrana sintética (nylon ou nitrocelulose)

…onde ficam imobilizados mas,

facilmente acessíveis a sondas
Ação capilar ou
vácuo

Agente bloqueante é usado para evitar ligações não

específicas

Ou campo eléctrico (electroblotting)

5
 BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA

Hibridação

Com sonda complementar à sequência alvo:

Incubação com excesso de sonda ex: DNA marcado

radioativamente

Lavagem da sonda não

ligada especificamente

6
 BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA

Deteção/quantificação das bandas nos blots

Exposição num filme de raios X
(autorradiografia)
Alternativa: Phosphorimaging Screen –absorve a
energia da radiação e emite luz a um comprimento
de onda característico, quando excitado por laser

Por densitometria, se a
imagem não estiver saturada,
pode quantificar- se o sinal
numa banda

7
 BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA
Northern blotting- analisar RNA
Ex: RNA total de reticulócitos:
O Northern permite:
• Detetar a presença de um mRNA específico

• Estimar a dimensão do mRNA, relativamente a

RNAs marcadores

• Estimar a quantidade relativa do mRNA (por

comparação do sinal com o de outros genes
expressos em níveis conhecidos- gene endógeno)

• Detetar a presença de transcritos diferentes de um

gene específico (splicing alternativo, promotores
alternativos)

Pre-mRNAs

8
mRNA
RT- PCR (Reverse Transcriptase – PCR)

Nota: não confundir com real time – PCR

Notas de terminologia:
- a abreviatura “RT” é historicamente utilizada para transcrição reversa pelo que
não deve ser usada para real time PCR
- faz-se PCR em tempo real a partir de um produto de transcrição reversa (cDNA):
“real time RT-PCR”
Análise da expressão génica ao nível do RNA- Síntese
de cDNA

Como alternativa, e como não se amplifica RNA,

faz-se:
A síntese de cDNA
(a partir de mRNA ou de RNA total isolado das
células em estudo)

O que é o cDNA?

10
cDNA= DNA complementar
O RNA purificado é usado como molde, para a transcritase reversa (RT),
originando o cDNA:

* 5‘-Cap
mRNA
AAA(A)n

(dT)12~18
primer
5‘-Cap
*
3‘ 5‘
AAA(A)n

dNTPs Transcritase reversa

5‘-Cap
5‘
PCR ou 11
AAA(A)n PCR em
híbrido cDNA:mRNA tempo real
 cDNA

• O cDNA pode então ser amplificado, por PCR, com ≠s fins:

•quantitativos (PCR em tempo real; micoarrays)

•qualitativos (sequenciação)
•clonagem num vetor para estudos posteriores,….

IMPORTANTE: a escolha dos primers para PCR/PCR em tempo real deve ser feita, se possível, em
exões diferentes para evitar a amplificação de possível DNA genómico contaminante
12
Transcritase reversa
- Polimerase codificada por retro-vírus

- sintetiza DNA a partir de RNA cDNA

- catalisa a polimerização de dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), na

direção 5’→3’, tendo como molde DNA ou RNA em cadeia
simples

- necessita de um primer com uma extremidade 3’OH livre:

13
Tipos de primer no RT-PCR
Primer Específico Random Primer Primer Oligo dT*
(hexamer mix)

5´
RNA 3´ RNA RNA
5´ 3´ 5´ AAAAA 3´
TTTTT

• Específico do gene a analisar • Inespecífico • Específico para mRNA

• Uma análise de cada vez • Múltiplas análises eucariótico
• Múltiplas análises

A RT retro-transcreve todo o RNA

A transcritase para cDNA
reversa (RT) faz
só o cDNA
* Cauda Poli-A : estrutura localizada na extremidade 3' da maioria
pretendido dos mRNA de eucariotas, sendo composta pela ligação de 80 a 250 resíduos
de Adenina
Transcritases reversas comerciais

As 2 disponíveis:

AMV- Transcritase reversa do vírus da mieloblastose aviária.

MMLV- Transcritase reversa do vírus da leucemia murina.

-têm a mesma função

-diferem nalgumas características como pH e temperatura ótimos

15
Amplificar cDNA com primers em exões diferentes

Desenhar primers em exões diferentes para PCR de cDNA, (ao

quantificar a expressão de genes: mRNA):

Exão 1 Exão 2 cDNA

• os primers amplificam o cDNA

Exão 1 Intrão Exão 2 Intrão DNA genómico

PORQUÊ???
Se houver contaminação com DNA genómico, este não é
amplificado pois os primers estão distantes e não há
complementaridade total ou tem tamanho  16
 Vantagens do RT-PCR

• Muito sensível, devido à possibilidade de amplificação do cDNA:

-Northern blot 5 ~ 10mg
-RT-PCR < 1ng (mesmo para células únicas)

• Pode-se olhar para múltiplos mRNAs simultaneamente, com

utilização múltiplos pares de primers

17
 Possíveis aplicações do RT-PCR

• Diagnóstico de vírus cujo material genético seja composto

por RNA (HIV, SarsCov2…) e determinação de carga viral

• Análise da expressão de genes específicos (mRNA)

• Quantificação de mRNAs (cDNAs; expressão de genes

específicos) em determinadas células/tecidos

- PCR em tempo real

18
PCR em tempo real de cDNA- Ex de aplicação

Tratamento de HIV

• A terapêutica da infeção HIV depende da monitorização

da carga viral

• O PCR em tempo real permite a quantidade de vírus de

RNA no paciente:
PCR em tempo real

• Monitoriza um sinal (fluorescência) emitido durante a reação de

PCR, em cada ciclo, em tempo real, como um indicador de
amplificação produzida.

Objetivo: Quantificação de DNAs (pode ser cDNA)

A fluorescência gerada, em tempo real, em cada ciclo de

amplificação é proporcional à quantidade de DNA produzida

20
Higushi et al., Biotechnology, 1992, 1993
PCR em tempo real

iCycler 7500
Applied Biosystems
BioRad

7900HT
Applied Biosystems

LightCycler
Roche

Mx3000P® QPCR
Stratagene

MarterCycler
Eppendorf

21
PCR em tempo real

-Uma das principais aplicações:

Análise de expressão génica:

(quantificação de mRNAs)

Realizado a partir de cDNAs

Nota: Não utiliza eletroforese

22
 PCR: amplificação exponencial

PCR- Polymerase chain reaction

Nf = No (2)n

Nf= o nº de cópias da sequência amplificada após n ciclos de amplificação

No= o nº inicial de cópias da sequência alvo no DNA molde
23
Cinética da reação de PCR

Fase exponencial
Máxima eficiência
Eficiência ~1

Ciclos de PCR
o produto final é
proporcional à
quantidade inicial
da amostra

24
PCR: amplificação exponencial

Como Nf= N0(2)n

a quantidade do produto de PCR formado (P) depende da

quantidade inicial de DNA (T)

25
PCR não é sempre 100% eficiente
Porque: o produto de PCR é limitado pela quantidade de primers,
dNTPs disponíveis, atividade da Taq polimerase, etc…

Nf= N0(2)n Nf = No(1+E)n

E= eficiência de amplificação por ciclo

Ex: 25

20
PCR product

15

10

0
0 10 20 30 40
Cycle

Amostras iniciadas com a mesma quantidade de DNA:

26
Resultados finais diferentes
Em que ciclo é iniciada a fase exponencial do PCR?
• No CT = início da fase exponencial, o ciclo onde é detetado o
1ºaumento significativo da fluorescência

Cycle

(Escala não logarítmica)

•  [DNA] iniciais de DNA baixo CT

27
 CT: PCR em tempo real
Escala logarítmica: o início da fase exponencial (CT) corresponde
ao ponto de inflexão da curva, representado pela interceção com
a reta:

28
Vantagens PCR em tempo real vs PCR tradicional
✓ Específico, sensível e reprodutível

✓ A amplificação é monitorizada em tempo real

✓ Não é necessário processar os produtos (menor contaminação, mais prático)

✓ Ciclos rápidos (30 minutos a 2 horas)

✓ Maior gama de deteção

✓Pequenas quantidades de RNA/ DNA (1000X menos que um Northern blot;

3 pg = equivalente a um genoma)

✓ Deteta variações ligeiras

✓Não muito mais caro (exceto pelo preço do equipamento)

29
PCR em tempo real

1. Métodos para detetar fluorescência

2. Desenho dos primers e sondas
3. Interpretação da reação de PCR em tempo Real
a) Conceitos
b) Quantificação
4. Validação dos resultados
5. Aplicações

30
 Métodos para detetar fluorescência

Como produzir fluorescência proporcional ao produto de PCR?

Van der Velden, Leukemia, 2003

Bustin, J Mol Endocrinol, 2000 e 2002
31
SYBR Green

- Molécula que intercala na cadeia dupla de DNA

- Não específico
- Emite fluorescência apenas quando intercalado
no DNA

2 3
Ciclos de PCR :
1

- A fluorescência emitida é proporcional à quantidade de produto

formado
Ponchel et al., 2003 BMC Biotechnology 32
SYBR Green
Vantagens:
-Barato
-Fácil  utilização de primers já existentes
-Útil para deteção

Desvantagens:
-Ligação inespecífica; dímeros de primers
-Fluorescência varia com o tamanho do produto de PCR
devem usar-se primers que originem fragmentos <s que
150pb
-Necessita validação pela análise das curvas de melting

33
Sondas Taqman (Sondas de hidrólise)
- Complementares a uma parte da sequência a amplificar
(específicas)

Repórter Quencher

Extremidade 3´ bloqueada

- Marcadas com um fluorocromo repórter (R) e um quencher (Q)

- Degradadas pela atividade exonucleásica 5’→3’ da Taq

polimerase
34
Sondas Taqman
Atividade exonucleásica 5'→3’ da Taq DNA polimerase, provoca:

Quencher absorve a fluorescência Não há emissão de

do repórter enquanto a sonda fluorescência
estiver intacta

Durante a amplificação,
a sonda é degradada pela
Emissão de
Taq DNA polimerase
fluorescência

Só há emissão de fluorescência quando:

• há amplificação específica a sonda encontrou
complementaridade
35
Sondas Taqman

Vantagens:
• Maior especificidade
• Pode ser utilizada para deteção de polimorfismos num só
nucleótido (SNPs)
• É fácil obter sondas/primers
■comercializadas ou feitas por encomenda

Desvantagens:
• Preço(uma sonda para cada gene a analisar; mais caro que Sybr green)
• têm tempo de vida (degradam-se)
36
Outros métodos para detetar fluorescência

Van der Velden, Leukemia, 2003

Bustin, J Mol Endocrinol, 2000 e 2002
37
PCR em tempo real

1. Métodos para detectar fluorescência

2. Desenho dos primers e sondas
3. Interpretação da reacção de PCR em tempo Real
a) Conceitos
b) Quantificação
4. Validação dos resultados
5. Aplicações

38
 PCR em tempo real - Desenho dos primers e sondas

• SYBR Green: seguir os cuidados a ter no PCR convencional.

• Sondas Taqman • Primers Taqman

* Tm maior que a dos *Amplicões pequenos 50-150 bp

primers *Tm idênticos (58-600 C)
* 15-30 nt de comprimento

• Primers para SyberGreen e Taqman: no caso de cDNA, devem

ser desenhados na junção entre exões ou em exões diferentes

para evitar amplificação de DNA genómico contaminante

http://www.mcb.uct.ac.za/pcroptim.htm 39
 PCR em tempo real - Desenho dos primers e sondas

•Desenhados através de Softwares adequados

Ex: Primer BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)- Gratuito
ABI Primer Express (http://www.appliedbiosystems.com/)
RealTimeDesign (http://www.biosearchtech.com/) Gratuito
Visual OMP 5.0 (http://www.dnasoftware.com/)- vários tipos de sondas

•Obtidos em Bases de dados de primers e sondas validados

EX: Real Time PCR Primer Sets (http://www.realtimeprimers.org/)

RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/)

•Comercializados validados por casas comerciais

Ex: Applied Biosystems (http://www.appliedbiosystems.com/)
Qiagen_Gene Globe (https://www1.qiagen.com/GeneGlobe/)
40
PCR em tempo real

1. Métodos para detetar fluorescência

2. Desenho dos primers e sondas
3. Interpretação da reação de PCR em tempo Real
a) Conceitos
b) Quantificação
4. Validação dos resultados
5. Aplicações

41
PCR em tempo real - Conceitos

Observação das curvas de amplificação:

Escala linear Escala logarítmica(Ct=ponto de

inflexão)

42
PCR em tempo real - CT

Escala logarítmica:

Threshold –
Rn fluorescência > background
(Delta Rn:
fluorescência
normalizada)

Cycle threshold ou CT*

=Ciclo onde é detetado o
primeiro aumento
significativo da
baseline fluorescência

* Valor usado para a quantificação!

43
PCR em tempo real

Exemplo de diluições sucessivas (2X) de uma amostra:

-quanto < a quantidade de DNA inicial > o CT
Porque: na fase exponencial o produto final é proporcional à quantidade
inicial da amostra
44
PCR em tempo real e diagnóstico de Covid 19
PCR em tempo real e diagnóstico de Covid 19
PCR em tempo real permite:
- detetar DNAs específicos (Ex: presença de um vírus)
- quantificar DNA de duas formas*

* • Quantificação absoluta: determina [ ]s DNA

ou

• Quantificação relativa: compara [ ]s DNA

(que podem ser níveis de
expressão/quantidades de mRNA)

53
Quantificação absoluta de DNA ou cDNA (RNA)

Baseada numa curva padrão:

-o DNA/cDNA é quantificado em número

absoluto (ex: número de cópias).

-Curva padrão é previamente

construída com :

•Plasmídeo
•Produto de PCR
•DNA
•Etc…

Ex. de aplicação: determinação de uma carga viral

54
http://absolute.gene-quantification.info/
 BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA

PCR em tempo real

Quantificação relativa de DNA ou cDNA (RNA)

Quantificação relativa de DNA ou cDNA(=RNA)

-Usa-se com frequência para determinar alterações da

expressão génica em diferentes amostras (quantificação
comparativa)

-Não necessita de curvas padrão

-A quantificação é comparativa  amostra calibradora

-As amostras são normalizadas para um gene endógeno

• Amostra calibradora:
com a qual queremos comparar a expressão génica (ex: expressão do
gene alvo em células tratadas com testosterona vs células não tratadas)
56
 Gene endógeno(=gene referência =housekeeping gene)
- Necessário para normalizar:

■ a quantidade de DNA(cDNA) das diferentes amostras

■ erros na transcrição reversa de RNA =>cDNA
■ variações da eficiência da reação

- Deve ter expressão constitutiva e abundante (exemplo: GAPDH;

β2-microglobulina; β-actina; 18S- não muito aconselhado…. )

- Deve refletir a quantidade de cDNA de uma amostra

- Em estudos do efeito de uma droga sobre a expressão de um gene:

escolher gene endógeno cuja expressão não seja influenciada por essa
droga

57
Radonic et al., BBRC 2004. ; Huggett et al., Genes and Immunity, 2005
 Gene endógeno

-Qual o mais adequado?

- Correr um teste de validação com vários:

A seleção pode ser feita recorrendo algoritmos, GeNorm
(http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/ )
-Vandesompele et al Genome Biology (2002)
-Szabo et al Genome Biology (2004)
-Andersen et al Cancer Research (2004)
- O ideal: usar 2 genes endógenos e calcular a média geométrica
GeNorm (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/ )

58
Como fazer a quantificação relativa?
Realizar 2 reações para cada cDNA (da amostra em análise e da
amostra calibradora):
-uma com os primers do gene alvo
-outra com os primers do gene endógeno

Gene alvo 1
Gene
endógeno 1
Rn

0 10 20 30 40
Ciclo 59
 Calcular expressão relativa (RQ): método Ct

-O que é a expressão relativa (RQ)?

Razão entre :

Expressão génica na amostra em análise =RQ

Expressão génica na amostra calibradora (controlo)

Método Ct (=Método de aproximação)

Se o gene endógeno e o gene alvo têm eficiência de 100%:

RQ = 2-Ct

60
(Livak KJ & Schmittgen TD. Methods 2001)
Método de Pfaffl: variação ao método Ct

• Para calcular a RQ

Considera a eficiência da reação

… (Pfaffl MW, Nucleic Acids Research, 2001)

Ex de aplicação do método Ct :

-Calcular a expressão relativa do gene HLA-DR (gene alvo), em células

HeLa, estimuladas com estradiol

-Gene endógeno:  actina

- +
Amostra calibradora Amostra estimulada
(com estradiol) 61
Expressão relativa (RQ): método Ct

• 1º passo: analisar as curvas de amplificação; estimar a

média dos CT, com base nos resultados dos triplicados:
Amostra calibradora β-actina cal

HLA-DR cal
Ct =19.93 t Ct=29.63

Amostra estimulada
β-actina est

HLA-DR est

Ct =18.03
Ct =19.80

62
Adaptado de http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm
2º passo: normalizar em relação ao gene endógeno(β-actina),
para cada uma das amostras (calcular o Ct )

Amostra calibradora
β-actina cal
Ct calib
Ct calib = alvo – endógeno =
HLA-DR cal
29,63 - 19.93
Ct =19.93 Ct =29.63 Ct calib = 9.70

Amostra estimulada
β-actina est Ct est = alvo – endógeno =
19,80 - 18.03
HLA-DR est
Ct est = 1.77
Ct est
Ct =18.03
Ct =19.80

63
3º passo: normalizar para a amostra calibradora (calcular o Ct)
=(Ctest – Ct calib = Ct)

Amostra calibradora
β-actina cal
Ct calib
Ct calib = 9.70
HLA-DR cal
Ct =19.93 Ct =29.63

Amostra estimulada
Ct est = 1.77
β-actina esti

HLA-DR exp
Ct est
Diferença =
Ct =18.03 Ctest – Ct calib
Ct =19.80 = Ct
= 1.77 - 9.70 = -7.93
64
4º passo: usar a fórmula da expressão relativa

RQ= 2-Ct

Ct calib = 9.70

RQ = 2-Ct = 27.93 =243 Ct est = 1.77

Ct =
Ctest – Ct calib = 1.77- 9.70
= -7.93

A amostra estimulada com estradiol tem uma expressão de HLA-DR

243 vezes maior que a amostra calibradora
65
Quantificação Relativa - Significado do valor RQ

RQ= 100
100 X mais expresso
RQ= 0,01
RQ =10
100 X menos expresso
1000
10 X mais expresso
RQ= 0,1
100 10 X menos
Expressão relativa

10 expresso
1
1 2 3 4
0,1

0,01

0,001

66
A quantificação Relativa não é indicada
para genes com expressão muito baixa
Quantificação Relativa

- Cálculos matemáticos

Complicado?

De um modo geral o software está incluído no equipamento de PCR em

tempo real e há softwares disponíveis on line :
-Determinação dos CTs (atenção aos cálculos automáticos do CT)
-Cálculo da expressão relativa pelo método Ct
-http://www.gene-quantification.de/download.html#rest

68
PCR em tempo real

1. Métodos para detectar fluorescência

2. Desenho dos primers e sondas
3. Interpretação da reacção de PCR em tempo Real
a) Conceitos
b) Quantificação
4. Validação dos resultados
5. Aplicações

69
 Como validar os ensaios?
•Testar primers e sondas, em várias concentrações
(50< [ ]s <900nM), com uma amostra conhecida

• Escolher a [primers ] que nos dá um maior Rn e menor CT

• Eletroforese em gel de agarose - amplificações não específicas

• Calcular a eficiência (método da série de diluições)

• Analisar as curvas de melting (só para Sybergreen)

70
http://www.gene-quantification.de/efficiency.html
Cálculo da eficiência: método série de diluições

Fazer curva padrão com várias diluições de uma amostra de

cDNA de concentração conhecida: log [cDNA ] vs CT

Eficiência =10(-1/declive) –1

Eficiências de PCR

33 Declive= - 3.36
31 y = -3,548x + 31,579
R2 = 0,9909
29
y = -3,6054x + 30,699
27 R2 = 0,9876
Eficiência= 98,44%
Ct

25
y = -4,001x + 29,004
23 R2 = 0,9963
y = -3,361x + 25,449
21 R2 = 0,997 •Coeficiente de
y = -3,3453x + 23,465
19 y = -3,2976x + 23,19
R2 = 0,9993
R2 = 0,9987
correlação(r2) = 0.997
17
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

Log [gene]
GAPDH Perforina GrB GrL Fas-L CTLA-4
71
Peirson, 2003, Nucleic Acids Research
Valores aceitáveis de eficiência

Um valor de declive aceitável está entre:

-3.2 e -3.5
e r2>0.98

•Calcular a eficiência para quê?

A eficiência, na fase exponencial, nem sempre é de 100% , porque:

- Condições e/ou componentes da reação

- Degradação da amostra
- Inibidores da reação (hemoglobina, heparina, ureia)
- Mau manuseamento
- Produtos inespecíficos
- Corantes
- Equipamento Real time
-…
Uma diferença de 10% na eficiência leva a diferenças de 5X nos resultados!
(Wong, 2005, BioTechniques) 72
Análise das curvas de melting: só para SYBR Green

-Realizadas no final da reação de PCR (a análise de melting pode

programar-se, no aparelho de real-time PCR, para o fim do programa)

-Permitem verificar se houve amplificação não específica e

se os primers formam dímeros

-Não é necessário fazer no caso de sondas Taqman

Ririe et al., 1997, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 73

Análise das curvas de melting: só para SYBR Green

Qualquer cadeia de DNA tem uma temperatura de melting (Tm):

Desnaturação de
Aumento da temperatura todo o DNA

As cadeias dissociam-se
quando a temperatura
atinge a Tm

Há uma diminuição
brusca da fluorescência

Tm

74
Análise das curvas de melting

Tm Tm

Intensidade da fluorescência vs temperatura Taxa da variação da fluorescência por

temperatura (-dF/dT) vs temperatura

Um só pico = um só tipo de moléculas de DNA

75
Análise das curvas de melting com contaminação

*
Exemplo de contaminação com dímeros de primers e
amplificação inespecífica (SYBR Green):
*

* *

Taxa da variação da fluorescência por

temperatura (-dF/dT) vs temperatura 76
Aplicações do PCR em tempo real

• Deteção de agentes patogénicos:

Mycobacterium, Streptococcus, Meningococcus, Legionella, Escherichia
coli, Sars cov2…

- Quantificação absoluta: carga viral, carga microbiana, oncogenes, % de

um GMO…

- Quantificação da Expressão génica (quantificação relativa):

Imunologia, Farmacologia, Alergologia, Neurologia, Oncologia,
Transplantação, Biologia Vegetal, etc..
ex: Confirmação de resultados de Microarrays transcriptómicos

77
 Aplicações do PCR em tempo real
• Genotipagem (Discriminação alelica):
-Trissomias (Zimmermann, 2002 )
-Microdeleções (Coupry, 2004)
-Haplotipos (Zhou, 2004)
-Diagnóstico Pré-natal – deteção de mutações(Bischoff, 2003 )
-Diagnóstico Oncológico

• Em transplantes:
-Monitorização de eventual resposta de rejeição (Sabek, 2002; Gibbs, 2003)

-Monitorização de quimerismo após transplante de medula óssea

(Harries, 2004)
• Outras aplicações:
-Single cell-PCR (Hahn et al. 2000, CMLS)
78
 Bibliografia recomendada
[1] Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. “Molecular Cell Biology”. 9th Ed (ou edições anteriores).
New York: W. H. Freeman, 2021(Chap 6)

[2] Alberts B., Bray D., Hopkin K. et al, “Fundamentos de Biologia Celular”,4th Ed. Artmed,
2017(Cap 10)

[3] Nolan et al, “Quantification of mRNA using real-time RT-PCR”; Nature Protocols,
1(3): 1559, 2006.

Sítios online
• http://highered.mheducation.com/sites/0072552980/student_view0/chapter10/animation_qui
z_4_.html

• http://www.gene-quantification.com/

Dicionário
• http://www.weihenstephan.de/%7Eschlind/genglos.html