20/11/2011

Curso PCR em Tempo Real Replicação do DNA

Dr. Júlio Carlyle M. Rodrigues (Cenargen)

Introdução: Reação em Cadeia da Polimerase

• Mecanismo de replicação;

• Histórico;

• Princípios;

• Aplicações.

Replicação do DNA PCR: histórico

Mecanismo de reação da DNA polimerase • 1953 – Watson & Crick: estrutura (1962)

• 1957 – Arthur Kornberg: replicação e descoberta da DNA polimerase (1959)

• 1959 – Gobind Khorana: código genético, síntese de oligonucleotídeos (1968)

• ataque nucleofílico –OH/PO4;
• cofatores: metais divalentes (Mg+2);
• energia: quebra de pirofosfato;
• pareamento posiciona dNTP corretamente
• 1969 – Thomas D. Brock: isolamento da bactéria Thermus aquaticus
• 1970 – Isolamento do fragmento Klenow
• 1971 - "... one would hope to obtain two structures, each containing the full length
of the template strand appropriately complexed with the primer. DNA polymerase
will be added to complete the process of repair replication. Two molecules of the
original duplex should result. The whole cycle could be repeated, there being added
every time a fresh dose of the enzyme."

PCR: histórico Polymerase Chain Reaction

• 1976 – Isolamento de DNA polimerase de T. aquaticus

• 1977 – Frederick Sanger – Sequenciamento (1980)

•Pesquisa em diagnóstico – Cetus Corporation, California

•Kary B. Mullis (1983) – reação cíclica para detecção da mutação de anemia

falciforme (usou princípio de Sanger e teve a idéia de colocar o 2nd primer);

• Cetus – aplicou para patente em Março, 1985, aprovada em 1987;

• Cetus – purificação e utilização da Taq polimerase, patente Junho 1987,

aprovada em 1990;

• 1985 – joint venture Cetus- Perkin Elmer: instrumentação;

• Kary B. Mullis – Nobel 1993

• Roche compra patente por US$ 300.000.000,00

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Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction

• simplicidade;

• custo;

• diversidade de aplicações;

• material biológico limitante.

PCR: cuidados PCR: otimização

• Contaminação!!!!
• MgCl2 - altas concentrações facilitam inespecificidade, típico 1,5 mM;
Bancada, primers, reagentes, pipetas

• preparar controles negativos/positivos; • dNTP – alta concentração aumenta erro, típico 0,2 mM;

• sempre uma boa idéia sequenciar produtos;

• desenho de primers fundamental: evitar ‘hairpins’, complementariedade
(formação de dímeros). Programas:
primer3 (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm);
• concentração do molde: muito pode favorecer inespecifidade;
• temperatura de anelamento do primer: ponto mais crítico, quanto mais
alta mais específico. Testar usando gradiente;

• tempo do ciclo: extensão - de acordo com tamanho do fragmento a ser

amplificado (aprox. 1Kb/min)

Aplicações: Clonagem de genes Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)

• Identificação de sequências homólogas de outros organismos;

• alinhamento e identificação de domínios conservados;

• análise de expressão gênica;
• primers específicos OU primers degenerados:
• isolamento de RNA (total ou poli-A+);
N=A,C,G,T; V=G,A,C; B=G,T,C; H=A,T,C; D=G,A,T; K=G,T; S=G,C
W=A,T; M=A,C; Y=C,T; R=A,G
• síntese de cDNA (transcriptase
reversa);
• amplificação, clonagem e sequenciamento – adição de sítios de
restrição na extremidade 5’ de primers;
• PCR com primers específicos
• expressão: usar enzimas de alta fidelidade
Vent (5x), Phusion (50x) (NewEngland Biolabs),
Pfu (10x), Pfx (50x) (Invitrogen)

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Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription) Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)

Genes de Referência
Considerações importantes
• controle de quantidade inicial de molde (evitar diferenças de
• Qualidade do RNA (padronizar protocolo); amplificação sejam devido à quantidades iniciais diferentes):
Normalização
• Remoção de DNA;

• Quantificação precisa (Nanodrop + gel); • mesmo número de cópias em todas as células;

• Genes de referência: constitutivos/housekeeping; • expressão em todas as células;

• Controle negativo: sem template/reações de cDNA sem TR; • Exemplos: gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase; actina; tubulina;
ubiquitina, genes ribossomais, etc.;
• Controle positivo: gDNA
• Pode variar de acordo com tecido: TEM QUE TESTAR!!

Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription) Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)

Semi-quantitativo

• análise na fase exponencial do PCR;

• usar mesma quantidade de molde;

• montar vários tubos da mesma reação;

• variar qtde de ciclos de cada reação;

• softwares de análise de imagem

(Image J)

Aplicações: RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) Aplicações: RAPD (Random Amplification of
Polymorphic DNA)

• obtenção de cDNA full length;

•kits (Clontech/Invitrogen);
• detecta polimorfismos;
• extração de RNA total;
• utilização de primers
• sintese de cDNA (oligo-dT); randômicos (6nt);

• adição de adaptadores nas pontas; • gera marcadores

moleculares;
• PCR usando primers gene-
específicos e primers específicos aos • pode gerar SCAR
adaptadores; (Sequence Characerized
Amplified Region)
• derivação: genome walking –
elementos regulatórios (promotores)

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Aplicações: PCR-based diagnostic assays Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)

US$ 5,4 bilhões (2008)
Quantitativo

• uma variação do PCR comum;

• instrumentação e detecção;

• sensibilidade

Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)

Quantitativo