APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NO

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

NATÁLIA GINDRI FIORENZA

MARIA PAULA SAMPAIO

UNIDADE 02
 UNIDADE 2 | INTRODUÇÃO

Técnicas como extração de material

genético, eletroforese, hibridização,
clonagem e DNA recombinante
fazem parte da Biologia Molecular. E
todas elas possuem importância no
diagnóstico laboratorial e em áreas
de genética e ciências forenses.

Figura 1:
Pixabay
 OBJETIVOS
1. Entender os princípios do funcionamento da técnica de eletroforese em gel de
agarose e de poliacrilamida, assim como as diferenças existentes nos géis e nos
reagentes utilizados.
2. Compreender as técnicas de amplificação do DNA e RNA, os reagentes utilizados e
suas funções, os diferentes tipos de técnica e sua importância no diagnóstico
laboratorial.
3. Aprender sobre a técnica de DNA recombinante, os princípios da técnica e a sua
utilização e importância no tratamento da diabetes.
4. Ressaltar os princípios da hibridização de cadeias oligonucleotídicas a partir do
princípio da interação Watson:Crick e as técnicas em Biologia Molecular que
utilizam sondas como forma de diagnóstico.
PRINCÍPIOS DA ELETROFORESE

A técnica da eletroforese veio no

ano de 1964, quando um grupo de
cientistas decidiram estudar a
mobilidade do DNA quando
submetido a uma voltagem
elétrica.

Figura 2:
Flaticon
ELETROFORESE EM GEL
• A técnica consiste em fazer com que as amostras “corram” em um gel, podendo
ser de acrilamida ou de agarose, de um polo ao outro (no caso do DNA, do
negativo ao positivo).
• Entretanto, não será somente a característica elétrica da molécula que irá
influenciar na corrida da amostra.
• Ao aplicar a mudança da orientação do campo elétrico, as moléculas maiores de
DNA serão forçadas a se reorientarem de forma paralela ao campo elétrico de
nova orientação, antes de migrarem em direção ao polo positivo.
• As moléculas maiores se reorientam de forma mais devagar em relação as
moléculas mais leves.
• Essa técnica é chamada de eletroforese em gel de campo pulsado, utilizada para
separar DNAs genômicos.
GEL DE AGAROSE

• A agarose é realizada ao solubilizar o pó

de agarose em um tampão, o
Tris-borato-EDTA (TBE) ou o
Tris-acetato-EDTA (TAE), e muitas vezes
misturar com o corante, que pode ser o
brometo de etídio ou o SYBR.
• Após misturar, esquentar a solução em
um micro-ondas até que a agarose
tenha um aspecto mais denso.
Figura 3:
Flaticon
EQUIPAMENTOS E REAGENTES NECESSÁRIOS
• O primeiro material é a agarose, que é vendida em forma liofilizada (em pó)
para que seja misturada aos tampões que serão utilizados tanto na etapa de
fabricação do gel, quanto na etapa da corrida propriamente dita.
• Os tampões podem ser o Tris-borato-EDTA (TBE) ou o Tris-acetato-EDTA (TAE).
O TBE é uma solução composta por uma mistura de base (Tris) ácido bórico e
EDTA.
• As cubas serão imersas no tampão de corrida (TBE ou TAE) e os eletrodos
serão ligados, iniciando a corrida. No fim da corrida, uma câmara de raios UV
irá irradiar o gel para que as bandas de DNA sejam reveladas, se o corante
utilizado for o brometo de etídio.
TAXA DE MIGRAÇÃO DO DNA ATRAVÉS DO GEL
DE AGAROSE
A concentração da agarose utilizada determinará
o tamanho do DNA a ser investigado.
•Quanto maior a concentração de agarose, menor
serão os poros formados, impactando no
tamanho de pares de bases que o DNA a ser
investigado poderá ter para se adequar àquela
eletroforese.
•Outro fator que poderá influenciar na taxa de
migração do DNA é a forma do DNA.
Figura 4: Flaticon
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
• Esse gel é formado por poliacrilamidas unidas por ligações
altamente cruzadas, como uma matriz inerte, que é onde as
proteínas passam.
• Entretanto, o gel de poliacrilamida também pode ser utilizado
para a separação de DNA de uma forma mais progressiva, já
que é capaz de separar moléculas de DNA com 1 par de base
de diferença.
• Além do mais, consegue acomodar uma quantidade muito
maior de DNA do que a do gel de agarose e o DNA corrido
nesse gel é extremamente puro e pode ser utilizado para
muitas demandas.
SDS PAGE
As proteínas podem ter cargas
diferentes a depender da organização
dos aminoácidos.
Para resolver essa situação, um
detergente é aplicado afim de ligar-se a
regiões hidrofóbicas das proteínas.
O Sodium Dodecyl Sulfate afeta o
desdobramento proteico, gerando
cadeias polipeptídicas estendidas, as
moléculas proteicas individuais são
liberadas de suas associações com
outras proteínas ou moléculas lipídicas
tornando-se completamente solúveis na
solução detergente.
Quando uma proteína se liga ao SDS, a
carga negativa desse detergente supera
a própria carga intrínseca da proteína,
fazendo com que essa proteína migre do
polo negativo ao polo positivo da cuba
vertical eletroforética.
As proteínas de mesmo tamanho
molecular tendem a migrar em
velocidade equiparadas, já que suas
estruturas estão desnaturadas e
lineares, podendo ser proteínas
diferentes, mas possuem o mesmo peso
molecular, portanto, a mesma
velocidade de migração.
SDS PAGE
• Proteínas de diferentes pesos seguirão a
regra do maior peso migrar de forma mais
lenta e o menor peso migrar de forma mais
rápida, gerando um mix de bandas
proteicas no gel.
• As proteínas majoritárias facilmente são
detectadas corando-se as proteínas do gel
com um corante como o azul de
Coomassie.
Figura 5:
Flaticon
BLOTTING COM ANTICORPO

• Após a eletroforese em poliacrilamida, é comum utilizar um

anticorpo, ligado a um cromóforo, como o DAB, ou a um
radioisótopo, para se ligar ao epítopo da proteína de interesse, assim
identificando-a.
• O Western blotting (WB) é capaz de fazer essa identificação ao
transferir as proteínas separadas pelo gel para um papel de
nitrocelulose, a partir de um campo elétrico forte.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
•Após a descoberta da molécula da hereditariedade, foram desenvolvidas técnicas de
análise para facilitar o estudo dessa molécula, tendo grande importância para a ciência e
para os profissionais que trabalham com isso.
•A técnica de PCR foi desenvolvida por Kary Mullis e colaboradores, em 1983, dando a
Mullis o prêmio Nobel de Química, em 1993.
•Essa técnica possui uma grande importância e vem sendo aplicada em amplas áreas
como na identificação de polimorfismo, genotipagem, doenças genéticas e detecção de
microorganismos.
•Ela é utilizada para análise de ácidos nucleicos que se encontram em baixas quantidades
na maioria dos tecidos vivos.
•É um método eficaz para amplificação de segmentos específicos de DNA, realizado
inteiramente de forma in vitro.
REAGENTES NECESSÁRIOS PARA A REAÇÃO
• A reação se inicia a partir de um DNA molde, seja • Os dNTPs são utilizados para a síntese das
extraído convenientemente da amostra ou de fitas-filhas.
uma amostra de RNA, convertida para DNA
complementar (cDNA). • O termociclador gera alterações de
temperaturas que levam a desnaturação
• A DNA polimerase mais utilizada é a Taq que da molécula de DNA ou cDNA, ao
deve ser utilizada juntamente a uma anelamento dos primers, e ao
solução-tampão composta por íons e também alongamento das novas cadeias de DNA.
pode ser utilizada com detergentes.
• O MgCl2 é muito importante para a reação pois é
um cofator essencial para a atividade da enzima.

• Os primers são pequenas sequências de DNA que

delimitam a área que vão ser ligados os dNTPs na
fita-mãe.

Figura 6:
Unilago
PCR
• Pelo menos um par de primer irá
identificar o local do material a ser
amplificado.
• Os dNTPs irão sintetizar as novas
cópias do material genético a ser
amplificado.
• A Taq irá sintetizar as novas
cadeias de DNA ou de cDNA.
• O MgCl2 junto com o tampão irão
auxiliar a atividade da polimerase.
• Após o MIX ser feito com todos os
reagentes, irá para
termociclador.
• Os ciclos de desnaturação,
anelamento e síntese do DNA
irão produzir segmentos de
DNA que correspondem ao
intervalo da sequência que foi
delimitado pelos primers.
• O resultado da amplificação
pode ser visualizado através da
eletroforese
o
RT-PCR
Esta reação pode ser dividida em
duas partes: a transcrição reversa e
a amplificação. O que diferencia
essa reação é que ela não inicia
através de um molde de DNA
diretamente extraído da amostra,
ou seja, a amostra fornece o RNA,
que é convertido em cDNA.
Figura 7:
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PCR EM TEMPO REAL
• Essa técnica é uma variação da técnica
de PCR, que permite monitorar o
processo de amplificação em tempo
real e quantificar os ácidos nucleicos
através da emissão e captação de
fluorescência durante todo o processo.
• O resultado é visualizado em tempo
real durante a amplificação da
sequência de interesse, gerando
resultados quantitativos com maior Figura 7:
SlidePlayer
precisão.
MULTIPLEX PCR
• Em uma única reação, mais de um
segmento é amplificado, cada um com
um par de primer específico. Essa
técnica é muito útil na simplificação de
alguns experimentos, como em testes
de paternidade, que deve-se analisar
vários marcadores genômicos.

Figura 8: abmgood
NESTED PCR

A PCR “aninhada” é utilizada para aumentar a especificidade da

amplificação, reduzindo a ocorrência de amplificação não específica do
DNA. A técnica utiliza dois pares de primers (pares externo e interno)
para um único locus e dois PCRs sucessivos.
OUTROS TIPOS DE PCR
PCR assimétrica
• Esse tipo de reação amplifica
preferencialmente uma fita de
DNA em um molde de DNA de
fita dupla. O processo é
semelhante ao do PCR, porém
utiliza-se uma quantidade de
primer para a fita alvo muito
maior que pra fita não alvo.
PCR de montagem (Polymerase
cycling assembly – PCA)
• O conjunto de ciclagem de
polimerase ou PCR de montagem é
um método utilizado para
montagem de grandes
oligonucleotídeos de DNA a partir
de fragmentos mais curtos.
• Esse método utiliza a mesma
técnica de PCR, porém utiliza a
hibridização e o anelamento do
DNA, assim como a DNA
polimerase para amplificar uma
sequência de DNA
OUTROS TIPOS DE PCR
PCR “touchdown”
• O termo “touchdown” diz respeito
aos ciclos de PCR anteriores, onde a
temperatura do anelamento é alta,
abaixo da temperatura de fusão dos
pares de primers. Após isso, a
temperatura de anelamento é
reduzida. O princípio dessa técnica é
que a temperatura do anelamento
durante a reação do PCR determine
a especificidade do anelamento do
primer. O resultado dessa técnica
aumenta bastante a qualidade da
PCR.
PCR digital
• Essa técnica é uma nova abordagem
para quantificação absoluta de
ácidos nucleicos, onde uma amostra
de DNA ou cDNA é separada em um
grande número de partições em
poços e as reações de PCR são
realizadas em cada partição. Os
poços podem ter a molécula alvo
(positiva) ou não (negativos), tendo
reações de PCR positivas e negativas
 DNA RECOMBINANTE E PRODUÇÃO DE
MATERIAL GENÉTICO QUIMÉRICO
A clonagem pode ser dividida em duas categorias:
a. A primeira categoria é a multiplicação via
amplificação do material genético, produzindo
várias cópias idênticas de uma molécula de DNA,
um processo realizado a partir da técnica
recém-discutida de PCR.
b. A segunda forma de clonagem é capaz de
multiplicar essa mesma molécula de DNA, mas não
a partir de técnicas de amplificação da molécula,
mas sim pelo isolamento dessa molécula em uma Figura 9:
célula que seja capaz de se replicar e replicar a fita Pixabay

de DNA de interesse.
CLONAGEM

Em 1972, um bioquímico chamado Paul

Berg teve a ideia de utilizar o Vírus Símio
40 (SV 40) para introduzir um gene de
interesse em uma célula, permitindo que
a célula hospedeira conseguisse
multiplicar o material genético de
interesse e, também, produzir a proteína
desejada.
Figura 10: Science Photo
Library
CLONAGEM

Foi a partir daí que Paul teve a ideia de introduzir um gene bacteriano
diretamente no genoma viral para que esse vírus infecte a célula-alvo
e leve junto o seu DNA de interesse, assim a informação hereditária
dessa célula seria alterada, podendo produzir uma proteína que
antes não produzia.
BIBLIOTECA DE DNA
•Para isolar um gene específico pela técnica de clonagem, é
necessária a construção de uma biblioteca de DNA, que é uma
coleção abrangente de DNA clonado em uma célula, que
normalmente é a Escherichia coli.

•Essa biblioteca inclui, no mínimo, um fragmento do gene de

interesse do pesquisador em todas as moléculas de DNAs
clonados.
VETOR PLASMIDEAL
• Os plasmídeos são DNAs circulares que fazem parte do genoma da
célula bacteriana.
• Os plasmídeos utilizados para a tecnologia de DNA recombinante são
muito menores do que os bacterianos.
• Para que esses plasmídeos comportem os genes de interesse,
primeiro ambos precisam passar por um tratamento com enzima de
restrição para abrir o DNA circular e formar pontas coesivas capazes
de interagirem umas com as outras (plasmídeo e DNA de interesse).
VETOR PLASMIDEAL
Os plasmídeos podem ser classificados também quanto às suas funções:
a. Plasmídeo de Fertilidade (F): Contém apenas transgenes, tendo a função
de iniciar a conjugação bacteriana;
b. Plasmídeo de Resistência (R): Contém genes de resistências capazes de
codificar fatores de resistência a antibióticos;
c. Col-Plasmídeos: Contém genes capazes de produzir colicinas, proteínas
capazes de matar outras bactérias;
d. Plasmídeos degradativos: Contém genes que permitem a digestão de
moléculas pouco habituais, como o ácido salicílico;
e. Plasmídeo de virulência: Consegue transformar a bactéria num agente
patogênico.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Enzimas Origem Sequências de restrição

BamHI Bacillus -G-G-A-T-C-C-

amyloliquefaciens
Enzimas especializadas em cortar o EcoRI Escherichia coli
-C-C-T-A-G-G-

-G-A-A-T-T-C-
DNA em segmentos específicos são -C-T-T-A-A-G-
convocadas para cortar tanto o gene HindIII Haemophilus influenzae -A-A-G-C-T-T-

de interesse quanto o DNA -T-T-C-G-A-A-

plasmideal, afim de formar Kpnl Klebsiella pneumoniae -G-G-T-A-C-C-

-C-C-A-T-G-G-
terminações concisas e equivalentes, PsfI Providencia stuartii -C-T-G-C-A-G-

permitindo a recombinação do gene -G-A-C-G-T-C-

de interesse com o plasmídeo. SalI Streptomyces albus -G-T-C-G-A-C-

-C-A-G-C-T-G-

SmaI Serratia marcescens -C-C-C-G-G-G-

-G-G-G-C-C-C-
TRANSFECÇÃO
• Com o DNA plasmideal montado,
precisava haver a transfecção desse
DNA circular na célula hospedeira.
• A transformação é a passagem de um
material genético para uma bactéria,
transformando-a capaz de codificar
uma proteína com uma função.

Figura 11:
Flaticon
PROTEÍNA RECOMBINANTE
• Quaisquer proteínas pertencentes
de quaisquer células estão em
pequenas concentrações em seus Replicação Cópias idênticas de DNA parental
respectivos meios.
Transcrição Parte da mensagem genética copiada
• Sendo assim, o seu processo de em RNA

extração se torna bastante difícil, Tradução Mensagem genética traduzida a

proteína
envolvendo uma produção maciça
de células para a extração de
pequenas quantidades de
proteínas.
DETECÇÃO DE DNA

Após a descoberta do DNA, várias técnicas de manipulação do DNA

de diferentes aspectos estão disponíveis. Uma delas utiliza as
características dos pareamentos de fitas anticomplementares para
identificar moléculas de DNA e RNA em uma amostra biológica. O
nome desse processo se chama hibridização.
CLASSIFICAÇÃO DAS SONDAS
• A hibridização é realizada ao submeter
uma sonda de DNA ou RNA que seja
capaz de se parear a uma cadeia
polinucleotídica contendo 100% de
complementariedade.
• Essa sonda será marcada com alguma
molécula capaz de gerar imagem, seja
ela fluorescente, quimioluminescente
ou um radioisótopo.
• A sequência alvo será imobilizada em
uma membrana para que a ação da
sonda seja facilitada.
As sondas podem ser de diversas
formas:
• Podem ser sondas feitas de DNA de
fita dupla, requerendo assim um
processo de desnaturação em seus
constituintes de fita simples;
• Sondas de DNA genômico e sondas de
DNA complementar de cadeia simples
(cDNA), sintetizados a partir de mRNA
submetido ao processo de transcrição
reversa pela RT-PCR.
CONDIÇÕES QUE INFLUENCIAM A
HIBRIDIZAÇÃO
A utilização de sondas de RNA se
torna uma ótima vantagem
quando se quer obter sondas Os mismatchings são
pareamentos indevidos
capazes de parear de forma da sonda em uma
muito mais estável a sequência cadeia polinucleotídica
não totalmente
alvo. Entretanto, alguns fatores complementar.
externos também precisam ser
levados em conta no momento
do experimento.
 CONDIÇÕES QUE INFLUENCIAM A
HIBRIDIZAÇÃO
• Temperatura: Cada molécula • pH: A concentração de íons H+ no meio
polinucleotídica em dupla fita possui pode interferir na cinética da
uma temperatura de fusão, ou melting hibridização por motivos semelhantes ao
temperature (Tm). dos sais monovalentes.
• Força iônica: A rigorosidade do • Tamanho e concentração da sonda: O
meio é extremamente influenciada tamanho da sonda está intimamente
pela concentração da força iônica, interligada com a temperatura e a
concentração de bases G e C.
representada pela concentração de
sais monovalentes no meio. • Formamida e Ureia
MARCADORES

Toda sonda é conjugada a um marcador com função de identificar ou

reportar a presença da sonda, caso esteja ligada à sequência alvo. O
primeiro marcador utilizado era um radioisótopo que se ligava ao
arcabouço da cadeia polinucleotídica.
SÍNTESE DE SONDAS
Além dos variados métodos para marcação descritos, há várias
metodologias que permitem a formação das sondas.

• Reação em Cadeia da Polimerase: • Nick Translation: É uma das técnicas

PCR é um excelente método para
síntese de sondas, visto que ele é
capaz de amplificar/duplicar o
material genético, adicionando
novos nucleotídeos que podem ser
marcados de formas diferentes.
mais antigas de criação de sondas.
Em uma molécula de DNA, haverá
mini cortes em seu arcabouço pela
proteína DNase I. Esses minis cortes
servirão de moldes para a
substituição da cadeia perdida.
SÍNTESE DE SONDAS
Além dos variados métodos para marcação descritos, há várias
metodologias que permitem a formação das sondas.

• 5’ End-Labeling: Adição de • 3’ End-Labeling: Essa técnica é

fosfatos marcados na cadeia realizada através da adição de
da sonda, em sua extremidade um nucleotídeo marcado à
5’. Essa reação é um excelente extremidade 3’ de um
método para marcar uma nucleotídeo. Essa reação é
sonda curta. catalisada por uma transferase
terminal.
RNA ANTI-SENSO
GENE ENEG
Durante a etapa da preparação
das sondas de RNA, há a
transcrição de fita senso e da Transcription
antisenso. A fita de RNA
antisenso é complementar ao Antisense RNA
Messenger RNA
mRNA, sendo assim, capaz de
Duplex Formation
parear com ele. Esse RNA pode
ser utilizado para o estudo
transcricional de um gene.
Obrigada!