Ebook Da Unidade - Citogenética ClínicaCitogenética Clínica

Citogenética
no Diagnóstico
Laboratorial
Rosalina Guedes Donato Santos
Aula 04
Diretor Executivo
DAVID LIRA STEPHEN BARROS
Diretora Editorial
ANDRÉA CÉSAR PEDROSA
Projeto Gráfico
MANUELA CÉSAR ARRUDA
Autor
EDUARDO NASCIMENTO DE ARRUDA
Desenvolvedor
CAIO BENTO GOMES DOS SANTOS
Autor
Rosalina Guedes Donato Santos
Olá. Meu nome é Rosalina Guedes Donato Santos. Sou formada

em Biomedicina, com uma experiência técnico-profissional na área
de imunologia, hematologia, toxicologia, análises clínicas de mais
de 12 anos. Passei por empresas com a Faculdade de Ciências e
Tecnologia, UNIFACS, UNIRB, Laboratórios como o Hospital Roberto
Santos, Laboratório José Silveira e Universidade Federal da Bahia. Sou
apaixonado pelo que faço e adoro transmitir minha experiência de vida
àqueles que estão iniciando em suas profissões. Por isso fui convidada
pela Editora Telesapiens a integrar seu elenco de autores independentes.
Estou muito feliz em poder ajudar você nesta fase de muito estudo e
trabalho. Conte comigo!
Iconográficos
Olá. Meu nome é Manuela César de Arruda. Sou a responsável pelo pro-
jeto gráfico de seu material. Esses ícones irão aparecer em sua trilha de
aprendizagem toda vez que:
INTRODUÇÃO: para DEFINIÇÃO: houver

o início do desen- necessidade de
volvimento de uma se apresentar um
nova competência; novo conceito;
NOTA: quando forem IMPORTANTE: as

necessários obser- observações escritas
vações ou comple- tiveram que ser prio-
mentações para o rizadas para você;
seu conhecimento;
EXPLICANDO ME- VOCÊ SABIA? curio-
LHOR: algo precisa sidades e indaga-
ser melhor explica- ções lúdicas sobre o
do ou detalhado; tema em estudo, se
forem necessárias;
SAIBA MAIS: textos, REFLITA: se houver a
referências biblio- necessidade de cha-
gráficas e links para mar a atenção sobre
aprofundamento do algo a ser refletido
seu conhecimento; ou discutido sobre;
ACESSE: se for RESUMINDO:
preciso acessar um quando for preciso
ou mais sites para se fazer um resumo
fazer download, acumulativo das
assistir vídeos, ler últimas abordagens;
textos, ouvir podcast;
ATIVIDADES: quando TESTANDO: quando
alguma atividade o desenvolvimento
de autoaprendiza- de uma compe-
gem for aplicada; tência for conclu-
ído e questões
forem explicadas;
SUMÁRIO
Princípios da citogenética clínica 10
Papel da genética no metabolismo bioquímico 10
Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) 14
Genômica e proteômica 15
Identificação dos genes de doenças humanas

e fatores de suscetibilidade 22
Genética das doenças complexas 26
Testes genéticos utilizados no diagnóstico

das doenças genéticas 32
Metilação do DNA 34
Outros métodos de investigação 35

Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 7
04
UNIDADE
8 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial
INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas cresceram os interesses a cerca da biologia
molecular por partes profissionais da saúde, principalmente pela
possibilidade de um diagnóstico mais assertivo nas doenças genéticas.
O avanço nas técnicas moleculares, sobretudo na possibilidade de avaliar
o DNA advindos de materiais biológicos como tecidos, aminiocentese,
biópsia de vilosidades coriônica aumentaram a chance de prever e
diagnosticar as doenças genéticas. Além disso, ferramentas diagnósticas
como a reação de cadeia em polimerase (PCR) despontaram como uma
ajuda no diagnóstico laboratorial, porque essa técnica utiliza quantidade
amostras mínimas, além de ser altamente sensível, específica e possui
alta reprodutibilidade. Essas características foram fundamentais para os
diagnósticos genéticos quanto aos aspectos éticos e legais, uma vez que
o diagnóstico se tornou quase que irrefutável dada a precisão das técnicas
moleculares. Dessa maneira os laboratórios conseguiram uma garantia na
qualidade dos serviços possibilitando que o número de erros laboratoriais
tendesse a zero e os laudos emitidos eram de fácil compreensão para os
indivíduos envolvidos no processo. Entendeu? Ao longo desta unidade
letiva você vai mergulhar neste universo!
OBJETIVOS
Olá. Seja muito bem-vindo à Unidade 4. Nosso objetivo é auxiliar
você no desenvolvimento das seguintes competências profissionais até
o término desta etapa de estudos:
1. Analisar o papel da genética no metabolismo bioquímico.
2. Reconhecer as principais doenças genéticas e suas caracte-
rísticas.
3. Correlacionar as técnicas utilizadas com o diagnóstico das
principais doenças genéticas.
4. Associar as técnicas de Biologia Molecular com o diagnóstico
de doenças genéticas.
Então? Preparado para uma viagem sem volta rumo ao conhecimento?
Ao trabalho!
Princípios da citogenética clínica

INTRODUÇÃO:
Ao término deste capítulo você será capaz de entender
como ocorrem os erros inatos do metabolismo e quais são as
consequências e qual o papel do laboratório nessa análise,
além disso entenderá como a genômica e a proteômica
podem auxiliar na descoberta dos genes e na avaliação
da função das proteínas, além de analisar as principais
vantagens e desvantagens dos testes usados na genética
como auxílio no diagnóstico laboratorial. E então? Motivado
para desenvolver esta competência? Então vamos lá. Avante!
Papel da genética no metabolismo

bioquímico
Os erros inatos do metabolismo (EIM) são distúrbios de natureza
genética que geralmente correspondem a um defeito enzimático capaz
de acarretar a interrupção de uma via metabólica.
Os erros inatos do metabolismo ocorrem por defeitos na falha
de síntese, degradação, armazenamento ou transporte de moléculas
no organismo. Esses erros causam Doenças Metabólicas Hereditárias
(DMH) em que a ausência de um produto esperado, ou ainda acúmulo
de substrato da etapa anterior que foi interrompida ou surgimento de
uma nova rota metabólica alternativa o que leva ao comprometimento
de processos celulares.
As enzimas são catalisadores proteicos que aceleram as reações
químicas e atuam reduzindo a energia de ativação necessária para que
uma reação química ocorra. Para que a enzima possa funcionar de
maneira correta é necessária a presença de sum substrato. Se uma via
metabólica exige a ação sequencial de diversas enzimas, uma mutação
de perda de função em qualquer um dos genes codificadores dessas
enzimas causará um bloqueio metabólico. O substrato irá acumular- se
antes do bloqueio, e depois desse haverá falta do produto.
Figura 1: Erros metabólicos
Fonte: A autora
Em uma via biossintética, o efeito será a ausência do produto final.

A exemplo temos a tirosina, uma enzima crucial para a biossíntese da
melanina, que quando afuncional em homozigose, causa o albinismo.
Em uma via de degradação, usualmente ocorre acúmulo do
substrato. Um exemplo clássico, são as doenças de armazenamento
lisossômico. Os lisossomos são vesículas que contém cerca de 40
enzimas hidrolíticas diferentes, as quais tem por função a digestão. A
deficiência de uma ou outra enzima lisossômica causa a degradação
parcial ou a não degradação do material no interior do lisossomo, o
que pode acarrear na morte celular. Os pacientes ao nascerem são
normais, mas depois apresentam inúmeros problemas em função da
não degradação. A exemplo, temos as mucopolissacaridoses como as
síndromes de Hunter e Hurler, a falta de uma ou outra enzima necessária
para a decomposição dos glicosaminoglicanos (mucopolissacarídeos)
acarreta no armazenamento de material de alto peso molecular não-
degradável e inexportável.
A alta concentração de substrato antes de um bloqueio, em uma
via de degradação ou sintética, também pode levar à produção de
metabólitos anormais. Por exemplo, a fenilcetonúria cujo bloqueio na
via catabólica normal da fenilalanina causa o acúmulo de fenilalanina no
sangue e em outros tecidos.
Ainda pode-se ter a ausência do produto final, acarretando
na ausência do controle do mecanismo retroinibitório. A exemplo, a
síndrome de Lesch-Nyhan, a qual é caracterizada como uma herança
recessiva ligada ao X, que ocorre por uma superprodução de purinas e
excreção excessiva de ácido úrico. A deficiência da enzima hipoxantina-
guanina fosforribosiltransferase 1 (HPRT1), cujo gene está localizado no
cromossomo Xq26-q27.2 resulta em níveis elevados de 5’-fosforribosil-
1-pirofosfato (substância que em quantidades normais exerce o controle

da síntese de purinas), acarretando hiperuricemia e hiperuricosúria (altos
níveis de ácido úrico no sangue e na urina, respectivamente).
A hiperuricemia, frequentemente, resulta na formação de cálculos
de ácido úrico nos rins e deposição de cristais de urato nas articulações
(artrite gotosa) e nos tecidos moles, também podem aparecer hematúria,
cálculos renais de ácido úrico e nefropatia obstrutiva e quando não
tratada geralmente é a causa de morte mais comum durante a infância.
O tratamento é feito com drogas como o alopurinol, para reduzir os níveis
de ácido úrico e evitar a formação de cálculos de ácido úrico e outras
complicações, mas nenhuma delas reduz os efeitos prejudiciais ao SNC.
Nessa síndrome o comportamento compulsivo autodestrutivo é visto
entre 2 e os 4 anos de idade, quando os pacientes começam a morder a
mucosa oral, lábios e dedos, sem qualquer perda da sensibilidade.
Figura 2: Síndrome de Lesch-Nyhan
Fonte: http://bit.ly/36Jwbed
Além disso, nos erros inatos do metabolismo ainda podem conter

situações em que são encontrados o acúmulo do substrato pode acarretar
acúmulo do precursor, no qual são produzidos metabólitos tóxicos ou
ainda o próprio acúmulo de substrato se torna prejudicial às células.
A exemplo do acúmulo do substrato, têm-se a galactosemia, é uma
herança autossômica recessiva, determinada por um gene localizado no
cromossomo 9p13, a qual resulta da deficiência da enzima galactose-
1-fosfato-uridiltransferase, que normalmente converte a galactose-1-
fosfato em glicose-1-fosfato. Nos homozigotos, essa etapa metabólica

está bloqueada, acumulando-se galactose nas células sanguíneas, no
fígado, no cérebro e nos rins. Ao nascerem, os bebês parecem normais,
mas na segunda semana de vida começam a apresentar vômitos, diarreia,
desidratação, icterícia, desnutrição e atraso no desenvolvimento. Na
ausência do tratamento adequado, podem sofrer complicações como
cirrose, hepatoesplenomegalia, galactosúria, catarata e deficiência
mental. Assim, o tratamento consiste na substituição permanente do
leite da dieta por produtos que não contenham galactose nem lactose
(açúcar do leite, que pode ser convertido em galactose), evitando, assim,
a maioria dos efeitos prejudiciais da deficiência enzimática.
Um exemplo clássico para a produção de metabólitos tóxicos é a
fenilcetonúria (PKU), na qual o bloqueio enzimático é causado pela falta da
enzima fenilalanina-hidroxilase, que tem por função converter a fenilalanina
em tirosina, no fígado. Na ausência dessa enzima, a fenilalanina acumula-
se no sangue e é degradada, por uma via secundária, em fenilpiruvato,
fenilactato e fenilacetato, que podem ser tóxicos. O bloqueio enzimático
acarreta também deficiência de tirosina, com a consequente redução na
formação de melanina, motivo pelo qual os afetados tendem a ter pele,
cabelos e olhos claros. Além disso, as áreas cerebrais pigmentadas,
como a substância negra, também carecem de pigmento. No Brasil a
prevalência é de 1/25.000. As crianças que tem a doença são normais ao
nascer, porém se tornam progressivamente deficientes (QI<20) e se tornam
hiperativas, irritáveis, espásticas e podem ter convulsões. Algumas crianças
apresentam sinais de agressividade e apresentam comportamento
psicótico, incapacidade motora, incontinência esfincteriana, odor de mofo
por conta da excreção urinária de fenilcetonas e dermatite constante. Hoje
o diagnóstico é feito por meio do teste do pezinho no pré-natal. Uma das
recomendações nesse paciente é a dieta alimentar, os alimentos proibidos
na fenilcetonúria são os que têm alto teor de fenilalanina. Entre eles, estão
carnes e derivados, feijão, ervilha, soja, grão-de-bico, lentilha, amendoim,
leite e derivados, achocolatados, ovos, nozes, gelatinas, bolos, farinha de
trigo, alimentos industrializados com altos teores de fenilalanina, pães em
geral, biscoitos e qualquer alimento que contenha aspartame, uma vez que
o aspartame sempre está associado com a fenilalanina para adocicar os
produtos da linha DIET.
Ademais, a falta de um produto final ou excesso de um substrato

pode interferir nos mecanismos reguladores, gerando vários tipos de
doenças. Exemplificando tem-se a hipercolesterolemia familiar, uma
doença autossômica dominante caracterizada pela elevação a nível
plasmático de colesterol. É uma doença genética do metabolismo das
lipoproteínas, principalmente por defeito do gene LDLR que codifica o
receptor de LDL.
Lipoproteínas de baixa densidade (LDL)

LDL é a sigla de Low Density Lipoproteins, que significa lipopro-
teínas de baixa densidade.
As mutações nesse gene podem ser agrupadas em pelo menos
cinco classes de alterações funcionais dos receptores de LDL:
1. Redução ou ausência de síntese;
2. Redução ou defeito no transporte do receptor entre o retículo
endoplasmático e o complexo de Golgi;
3. Ligação deficiente entre o receptor e a LDL;
4. Internalização anormal da LDL pelo receptor;
5. O receptor não consegue liberar a LDL nos lisossomos e
retornar para a superfície celular (ausência de reciclagem), sendo
degradado o complexo LDL-receptor.
A mutação também pode ser secundária a defeitos no gene
APOB que codifica a apolipoproteína B100, ou por mutações com ganho
de função no gene pró-proteína convertase subutilisina/kexina tipo 9
(PCSK-9).
Nos pacientes com Hipercolesteerolemia Familiar heterozigótica
ocorre a circulação de LDL por mais tempo no plasma e por isso há mais
oxidação e transformações químicas, que resultam na alta captação de
LDL pelos r macrófagos, deflagrando mecanismos pró-aterogênicos,
tendo como consequência aterosclerose, doença arterial coronariana
e doença arterial periférica. Para esses pacientes a dieta alimentar
também é importante, sendo vetada o consumo de alimentos ricos
em colesterol e ácidos graxos saturados e recomenda-se a utilização
de medicamentos hipolipimiantes e a prática de exercícios físicos. O
diagnóstico da hipercolesterolemia familiar é estabelecido segundo
os critérios clínicos e laboratoriais devendo sempre ser hipótese

diagnostica em pacientes com níveis de colesterol da lipoproteína de
baixa densidade (LDLc) superiores a 190mg/dL e pode ser confirmado
por testes genéticos que determinam a mutação.
Ainda existem as doenças que são decorrentes do metabolismo
das porfirinas. As porfirinas são compostos nitrogenados que se
ligam facilmente a íons metálicos e fazem parte do grupamento da
hemoglobina, mioglobina, citocromos e outras proteínas. Essas doenças
acontecem por deficiência de enzimas na biossíntese do grupamento
heme, sendo assim classificadas em porfirinas hepáticas ou porfirinas
eritropoiéticas, de acordo com o maior número de acúmulos se no
fígado ou no sistema eritropoiético.
No caso das porfirinas hepáticas, as manifestações clínicas
são fotossensibilidade, erupções avermelhadas, mudança de cor da
urina para vermelho escuro ou marrom. As porfirias eritropoiéticas são
caracterizadas por erupções e vesículas na pele no início da infância,
sendo complicadas por cirrose colestática hepática e insuficiência
hepática progressiva.
Genômica e proteômica
A genômica se refere ao estudo do genoma e para isso são
usadas técnicas que possam caracterizar os genes e a proteômica avalia
a expressão de proteínas em materiais como fluidos corporais, tecidos
em condições/e ou momentos distintos.
A genômica estrutural estuda a organização e a sequência de
informação genética contida em um genoma. Para tanto devem ser
analisados mapas genéticos e físicos dos cromossomos. O mapa é
importante porque ele identifica as localizações dos genes, marcadores
moleculares e segmentos cromossômicos para identificar a posição dos
segmentos cromossomos e alinha trechos de DNA sequenciado em
uma sequência do genoma inteiro.
Os mapas genéticos (também conhecidos como mapas de
ligação) fornecem uma estimativa das localizações dos genes em relação
a localizações de outros genes conhecidos. Estes mapas baseiam-se
na função genética da recombinação. Em resumo, organismos com
genótipo conhecido são cruzados e a frequência de recombinação entre

os loci é determinada pelo exame dos descendentes. Se a frequência
de recombinação entre os loci for 50%, então os loci estão em diferentes
cromossomos ou distantes no mesmo cromossomo. Se a frequência de
recombinação for menor que 50%, os loci estão próximos no mesmo
cromossomo (eles pertencem ao mesmo grupo de ligação). Para genes
ligados, a taxa de recombinação é proporcional à distância física entre os
loci. As distâncias nos mapas genéticos são medidas em porcentagem
de recombinação (centimorgans, cM) ou unidades de mapa. Os dados
de cruzamentos múltiplos de dois ou três pontos podem ser integrados
em mapas de ligação para cromossomos inteiros.
Figura 3: Mapa genético
Fonte: wikimedia commons
Os mapas genéticos têm muitas limitações, a primeira delas

é a resolução ou o detalhe. O genoma humano inclui 3,2 bilhões de
pares de bases de DNA e tem uma distância genética total de 4.000
cM, uma média de 800.000 pb/cM. Mesmo que exista um marcador a
cada centimorgan (o que não é uma expectativa realista), a resolução
em relação à estrutura física do DNA ainda seria muito baixa, em outras
palavras, os detalhes do mapa seriam muito limitados.
Um segundo problema dos mapas genéticos é que nem sempre
eles correspondem exatamente às distâncias físicas entre os genes. Os
mapas genéticos baseiam-se nas taxas de crossing over, que variam de
uma parte de um cromossomo para outro, portanto, as distâncias em
um mapa genético são apenas aproximações das distâncias físicas reais
ao longo de um cromossomo. Existem algumas discrepâncias entre

as distâncias e até entre as posições de alguns genes. Apesar destas
limitações, os mapas genéticos são críticos para o desenvolvimento dos
mapas físicos e o sequenciamento dos genomas inteiros.
Um outro recurso que pode ser usado em consonância com o
mapa genético é o mapa físico, no qual analisam diretamente o DNA
e os genes são colocados em relação às distâncias medidas em um
número de pares de bases, quilobases ou megabases. Para a criação
desse mapa são utilizadas técnicas como mapeamento de restrição,
que determina a posição dos sítios de restrição do DNA. Isso são feitas
por etapas. A primeira etapa consiste na avaliação do segmento de DNA
na eletroforese em gel, para determinar o número de sítios de restrição
ao DNA e as distâncias entre elas, as quais podem ser avaliadas pelas
posições das bandas no gel. A segunda etapa é o encontro da ordem ou
da localização exata dos sítios de restrição.
Para mapear os sítios de restrição, uma amostra de DNA é
cortada com uma enzima de restrição e outra amostra é cortada com
uma enzima de restrição diferente. Uma terceira amostra é cortada
com ambas as enzimas de restrição juntas (uma dupla digestão). Os
fragmentos de DNA produzidos por estas digestões de restrição são
separados por eletroforese em gel e seus tamanhos são comparados. A
sobreposição no tamanho dos fragmentos produzidos pelas digestões
pode ser usada para posicionar os sítios de restrição na molécula de
DNA original. Assim, são feitos mais mapeamento de restrição com
várias enzimas de restrição, usadas sozinhas ou em várias combinações,
produzindo muitos fragmentos de restrição.
Com segmentos longos de DNA (maiores que 30 kb), programas
de computador são usados para determinar os mapas de restrição e o
mapeamento de restrição pode ser facilitado ao se marcar uma extremidade
de um grande fragmento de DNA com radioatividade ou ao identificar a
extremidade com o uso de uma sonda. Os mapas físicos, como os mapas
de restrição de fragmentos de DNA ou até de cromossomos inteiros,
são criados para análise genômica. Estes mapas compridos são criados
ao combinar os mapas de fragmentos genômicos curtos e sobrepostos.
Existem várias técnicas adicionais para criar mapas físicos, incluindo:
mapeamento de sítio de sequência marcada (STS), que localiza as posições

de sequências curtas únicas de DNA em um cromossomo, hibridização
in situ, na qual os marcadores podem ser mapeados visualmente nas
localizações nos cromossomos e sequenciamento de DNA.
No entanto, para melhorar a análise dos genes e ideal seria
o sequenciamento do genoma inteiro, no entanto, isso exigiria que o
DNA fosse rompido em milhares de fragmentos menores para a análise.
Entretanto, a dificuldade está em posicionar essas pequenas sequências
de volta na ordem correta. Assim, para montar esses pequenos
fragmentos podem ser usados o mapa e o sequenciamento Shotgun
(método de sequenciamento) do genoma completo.
No caso do sequenciamento baseado no mapa, os fragmentos
curtos sequenciados são montados em uma sequência de genoma
inteiro criando primeiro os mapas genéticos e físicos detalhados do
genoma, que fornecem localizações conhecidas dos marcadores
genéticos (sítios de restrição, outros genes ou sequências de DNA
conhecidas) em intervalos regulares ao longo de cada cromossomo.
Estes marcadores são usados posteriormente para ajudar a alinhar os
fragmentos curtos sequenciados na sua ordem correta.
Figura 4: Sequenciamento do mapa
Fonte: http://bit.ly/39YCwEI
Após essa etapa, os cromossomos ou os fragmentos maiores são

separados por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) ou citometria
de fluxo. A eletroforese convencional não é usada porque não consegue
separar segmentos muito grandes de DNA, como cromossomos
inteiros, mas a PFGE consegue separar grandes moléculas de DNA ou
cromossomo inteiro em um gel, pois altera periodicamente a orientação
de um campo elétrico. E na citometria de fluxo, os cromossomos são
classificados opticamente pelo tamanho.
Cada cromossomo (ou às vezes, o genoma inteiro) é então
cortado por digestão parcial com enzimas de restrição. A digestão parcial
significa que as enzimas de restrição atuam por um tempo limitado de
modo que nem todos os sítios de restrição em cada molécula de DNA
sejam cortados. A digestão parcial produz um conjunto de grandes
fragmentos de DNA sobrepostos, que são clonados com o uso de
cosmídios, cromossomos artificiais de levedura (YACS) ou cromossomos
bacterianos artificiais.
Quando os grandes clones de inserção são montados na ordem
correta no cromossomo, um subconjunto de clones sobrepostos que
cobrem eficientemente o cromossomo inteiro pode ser selecionado para
o sequenciamento cujo objetivo é selecionar o número mínimo de clones
necessários para representar o cromossomo. Cada um dos grandes clones
de inserção selecionados é clivado em fragmentos sobrepostos menores
que são clonados. Estes clones menores (chamados de pequenos clones
de inserção) são sequenciados e examinadas quanto à sobreposição, o
que permite que sejam corretamente montadas para originar a sequência
dos grandes clones de inserção. Uma quantidade suficiente de pequenos
clones de inserção sobrepostos é sequenciada para garantir que o genoma
inteiro seja sequenciado várias vezes. Finalmente, o genoma inteiro é
montado ao colocar as sequências de todos os contigs sobrepostos.
Mesmo assim, os espaços no mapa do genoma ainda existem e precisam
ser preenchidos ao usar outros métodos.
No sequenciamento Shotgun do genoma completo, pequenos
clones de inserção são preparados diretamente a partir do DNA
genômico e sequenciados. A utilização de softwares auxilia na montagem
do genoma inteiro por meio de exame da sobreposição dos pequenos
clones de inserção. Uma vantagem deste tipo de sequenciamento é que

os pequenos clones de inserção podem ser colocados em plasmídeos,
que são simples e fáceis de manipular. A exigência de sobreposição
significa que a maior parte do genoma será sequenciada múltiplas vezes
(de 10 a 15 vezes). O número médio de vezes que um nucleotídeo no
genoma é sequenciado é chamado de cobertura de sequenciamento.
Figura 5: Sequenciamento Shotgun do genoma completo
Fonte: http://bit.ly/39YCwEI
SAIBA MAIS:
Um suporte nas análises desses dados tem sido o campo
da Bioinformática. Essa ferramenta se concentra no
desenvolvimento de bancos de dados, algoritmos de
pesquisa em computador, programa de previsão gênica e
outras ferramentas analíticas usadas para dar sentido aos
dados de sequência de DNA, RNA e proteínas.
Assim, após determinar a sequência de genes é importante

detectar a função dos genes, por meio da genômica funcional. Os
objetivos da genômica funcional incluem a identificação de todas as
moléculas do RNA transcritas a partir de um genoma, o qual chamamos
de transcriptoma e das proteínas, a qual chamamos de proteoma, e o
estudo do proteoma é proteômica.
Para a análise proteômica, é necessário a separação das proteínas,

identificação e quantificação. Uma técnica usada para esse fim é a de
eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE), no
qual as proteínas são separadas em uma dimensão pela carga elétrica,
separadas em uma segunda dimensão pela massa e então coradas. O
princípio da técnica é a separação das diferentes proteínas em manchas,
com o tamanho de cada mancha proporcional à quantidade de proteína
presente. Um típico gel 2D-PAGE pode ter muitas centenas a milhares
de manchas. Ver figura 09.
Figura 6: Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida
(2D-PAGE) pode ser usada para separar as proteínas celulares
Fonte: http://bit.ly/2NeSjWm
Para melhorar a identificação de proteínas, ainda podem ser

usadas outras técnicas como a cromatografia líquida e a espectrometria
de massa. A cromatografia líquida, ocorre a partir de uma mistura de
moléculas a qual são dissolvidas em um líquido e passada por uma
coluna preenchida com partículas sólidas. As diferentes afinidades para
as fases líquida e sólida fazem com que alguns componentes da mistura
viajem pela coluna mais lentamente do que outros, resultando na
separação dos componentes da mistura, já na espectrometria de massa,
uma molécula é ionizada e é determinada sua taxa de migração em um
campo elétrico. Como pequenas moléculas migram mais rapidamente
do que as maiores, a taxa de migração consegue determinar com
exatidão a massa da molécula. Ver figura 10.
Figura 7: Análise da espectrometria de massa
Fonte: wikipedia
Assim, para a análise genética são necessárias diversas ferramentas

moleculares e proteicas para identificar o gene bem como a sua função.
Identificação dos genes de doenças

humanas e fatores de suscetibilidade
Na clonagem posicional, um gene de doença é identificado a partir
apenas do conhecimento de sua localização cromossômica aproximada.
O gene candidato pode ser identificado pelo conhecimento prévio de
um homólogo em outras espécies, por um paciente que possui tanto um
fenótipo de interesse como uma anormalidade cromossômica estrutural,
ou pela análise de ligação. O sucesso depende de uma interação entre
o trabalho clínico, a bancada de laboratório e a análise de bancos de
dados, sendo esta última etapa uma das mais importantes, devido ao
acúmulo de informações sobre os genomas.
Para que ocorra a clonagem posicional devem ser cumpridos
04 etapas: definição da região candidata, obtenção dos clones de DNA
para toda a região, identificação de todos os genes na região, triagem de
mutações e teste de genes candidatos na identificação das mutações
na população afetada. No caso de doenças mendelianas, é necessário
verificar o número de meioses disponíveis para a análise da ligação. A
resolução será alcançada quando o último recombinante for mapeado
entre os marcadores intimamente espaçados.
Para realizar a identificação de todos os genes, hoje em dia pode-se

usar como ferramenta um navegador genômico o Ensembl (http://www.
ensembl.org/) ou o Santa Cruz (http://genome.cse.ucsc.edu/) para mostrar
todos os genes definidos e possíveis de uma região candidata. Para a
identificação de mutações devem ser usadas amostras de uma coleção
de pessoas afetadas não relacionadas sequenciadas. Para isso deve ser
feita a análise de todos os éxon, e cada éxon deste gene é individualmente
amplificado por PCR e então sequenciado. Na escolha dos genes para
sequenciamento, faz sentido começar com os mais promissores, embora a
facilidade de análise seja também um dos fatores a considerar.
A escolha do gene tem a ver com o nível de expressão, ou seja,
deve possuir um padrão de expressão consistente com o fenótipo da
doença. Essa expressão não precisa estar limitada ao tecido afetado, mas
o gene candidato deve, ao menos, ser expresso no local onde a doença
é observada e no período, ou antes do período, no qual a patologia
doença se tornou evidente. As técnicas usadas para analisar a expressão
do gene podem ser a reação de cadeia em polimerase em tempo real
(RT-PCR), nothern blotting ou por análise em série da expressão gênica
(SAGE), uma técnica que avalia a expressão de RNA mensageiro. Outras
técnicas como hibridização in situ ou imuno-histoquímica podem avaliar
padrões de expressão.
Após essa análise, é necessário identificar a função do gene. Para
um gene novo, análises de sequência fornecerão indícios de sua função
por meio do reconhecimento de motivos de sequência comuns tais como
domínios transmembrana ou motivos de tirosina quinases. Estes podem
ser suficientes para priorizar um gene como candidato, considerando-se
a patologia da doença.
Anormalidades cromossômicas podem, algumas vezes, fornecer um
método alternativo para a localização de um gene de doença, em substituição
à análise de ligação. Para condições que são normalmente esporádicas,
como muitas doenças dominantes graves, aberrações cromossômicas
podem proporcionar o único método de se chegar a um gene candidato.
Uma quebra cromossômica pode causar a perda de função de
um gene se esta interrompe a sequência codificadora daquele gene
ou se separa a sequência codificadora de uma região regulatória que
age em cis. Alternativamente, ela pode causar um ganho de função, por

exemplo, aproximando éxons de dois genes para criar um novo gene
quimérico. Em ambos os casos, os pontos de quebra fornecem uma
pista valiosa da localização física exata do gene da doença. A posição
do ponto de quebra é mais facilmente definida utilizando a técnica de
hibridização in situ (FISH).
Entretanto, para a avaliação de microdeleções e de microdupli-
caçoes deve-se usar a técnica de hibridização genômica comparativa
(CGH, do inglês comparative genomic hybridization). Para realizar essa
técnica de CGH, as amostras de DNA de um paciente e de um controle
não afetado são marcadas com dois fluorocromos diferentes. Quantidades
equivalentes das duas amostras de DNA são misturadas e hibridizadas a
um microarranjo de clones de um indivíduo normal. Após a lavagem da
sonda não ligada, a fluorescência é medida nos dois comprimentos de
onda, e a proporção vermelho-verde é calculada para cada clone.
Independentemente da técnica utilizada, é importante confirmar
os resultados por FISH. Anormalidades balanceadas podem não ser
detectadas, e os resultados para duplicação ou amplificação podem ser
incapazes de distinguir repetições em tandem de repetições dispersas. A
principal limitação destas técnicas está na interpretação dos resultados.
Além disso, um gene de doença pode ser identificado por meio do
conhecimento de seu produto gênico devido à degeneração do código
genético, a sequência gênica predita é também degenerada. Uma sonda
utilizada para varrer uma biblioteca de cDNA deve conter um coquetel de
todas as sequências possíveis que poderiam codificar aqueles aminoácidos.
Considerando que apenas uma sonda da mistura corresponderá à sequência
autêntica, é importante manter o número de diferentes oligonucleotídeos
baixo para aumentar a probabilidade de identificar o alvo correto.
SAIBA MAIS:
Para entender melhor a influência da genética leia o artigo
Avaliação genética, triagem familiar e exercício, disponível
em https://bit.ly/2m06EuZ
RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu mesmo
tudinho? Agora, só para termos certeza de que você
realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo,
vamos resumir tudo o que vimos. Você deve ter aprendido
que os erros metabólicos hereditários são distúrbios
bioquímicos determinados geneticamente, nos quais
um defeito enzimático especifico produz um bloqueio
metabólico que pode originar uma doença. Alguns erros
metabólicos são assintomáticos e não acarretam doenças,
como, por exemplo, a redução da sensibilidade gustativa à
feniltiocarbamida; outros são assintomáticos até que sejam
evidenciados pela ingestão de certas substâncias, como
a deficiência da enzima glicose-6-fosfatodesidrogenase
(G6PD). Por outro lado, certa fração dos erros metabólicos
é sintomática, mas não causa grandes problemas clínicos
(p. ex., alcaptonúria). A maioria deles, no entanto, manifesta-
se com sintomas agudos, e só são compatíveis com a
sobrevivência normalmente se sua causa for eliminada (p.
ex., galactosemia). Assim, surge a genômica e proteômica
para a análise do gene e das proteínas. Para essa análise
inicial são feitos mapas genéticos que posicionam os
genes em relação a outros genes ao determinar as taxas
de recombinação. O sequenciamento de um genoma
inteiro exige a clivagem dele em pequenos fragmentos
sobrepostos cujas sequências de DNA podem ser
determinadas em reações de sequenciamento. As
sequências individuais podem ser ordenadas em uma
sequência de genoma inteiro usando uma abordagem
baseada no mapa, na qual os fragmentos são montados
em ordem ao usar mapas genéticos e físicos previamente
criados ou com o uso de uma abordagem do genoma
completo pela estratégia Shotgun, no qual é usada a
sobreposição entre os fragmentos para montá-los em uma
sequência de genoma inteiro. Hoje em dia, praticamente
todos os genomas são sequenciados usando o método
Shotgun do genoma completo. E a proteômica determina
o conteúdo de proteína de uma célula e as funções
destas proteínas, as proteínas intracelulares podem ser
separadas e identificadas com o uso de espectrometria de
massa, cromatografia líquida ou ainda citometria de fluxo.
RESUMINDO:
A proteômica estrutural tenta determinar a forma
tridimensional das proteínas. Assim, existem várias maneiras
pelas quais um gene para doença pode ser identificado. Isso
pode ser feito a partir do conhecimento do produto proteico
ou de um gene relacionado (em humanos ou em outras
espécies) para a correta identificação do gene. De maneira
mais frequente, primeiro a localização cromossômica do
gene é definida e a seguir é feita uma busca nesta região
para um gene que contenha mutações em pacientes,
mas não em controles (clonagem posicional). Algumas
vezes, anormalidades cromossômicas podem sugerir uma
localização. Translocações, inversões ou deleções podem
causar problemas clínicos pela interrupção ou deleção de
genes. Se dois pacientes não relacionados compartilham
um ponto de quebra cromossômico e também uma
característica clínica específica, talvez um gene responsável
por esta característica esteja localizado naquele ponto de
quebra ou próximo a ele. Mais frequentemente, entretanto,
genes de doenças são localizados por análise de ligação em
um conjunto de famílias onde a doença está segregando.
Genética das doenças complexas

As principais doenças complexas genéticas são artrite
reumatoide, diabetes mellitus, diabetes mellitus insulinodependente,
doenças cardiovasculares, doenças cardíacas congênitas, doença
arterial coronariana, hipertensão, doença de Hirschsprung, obesidade,
osteoporose e febre reumática. A suscetibilidade genética pode
ocorrer devido à herança monogênica de um produto gênico anormal
envolvido num padrão metabólico determinado, como a doença arterial
coronariana precoce devida à hipercolesterolemia familiar ou hereditária.
No diabetes mellitus tipo 2, o pâncreas não produz insulina
suficiente ou o organismo não consegue usar corretamente a insulina,
resistindo à sua ação; por isso, quantidades pequenas de insulina
conseguem entrar dentro da célula. A prevalência dessa doença é na
meia-idade e no idoso, mas, geralmente, é menos grave do que o tipo 1. A
chance de risco maior são em pacientes acima de 45 anos, com histórico
familiar de diabetes, excesso de peso associado ao sedentarismo, baixos

níveis de colesterol do tipo HDL ou altos níveis de triglicerídeos, mulheres
que tiveram diabetes gestacional e crianças que não dependem de
insulina para o controle glicêmico. O diagnóstico é baseado em três fases
clínicas como a normalidade da glicemia apesar da resistência à insulina,
hiperglicemia pós-prandial e diminuição dos níveis de insulina em estado
de hiperglicemia. Em adição à hiperglicemia, ocorre a desregulação
metabólica resultante da disfunção das células das ilhotas de Langerhans
e a resistência à insulina causam aterosclerose, neuropatia periférica,
doença renal, cataratas e retinopatia.
Estudos tem mostrado a detecção do polimorfismo de compri-
mento de fragmento de restrição na extremidade 5’ do gene da insulina,
mapeado no braço curto do cromossomo 11. Um dos alelos desse
polimorfismo está associado com o diabetes mellitus não insulino
dependente, pode estar associado na regulação da síntese da insulina.
Assim, os fatores genéticos revelam herança multifatorial, os quais estão
intimamente relacionados com os fatores ambientais como idade, sexo,
etnia, condicionamento físico, obesidade, dieta e uso de fumo, bem
como o efeito da distribuição de gordura e a sensibilidade à insulina
bem como a excreção.
O diabetes mellitus insulino dependente é um distúrbio autoimune
da hemostasia da glicose, o qual é caracterizado pela deficiência de
insulina causada pela destruição das células beta e pela suscetibilidade a
cetoacidose na ausência de reposição da insulina. Os sinais clássicos são
polidipsia, polifagia e poliúria, que resultam da diurese osmótica e da sede
secundária, induzida pelo processo da hiperglicemia. Existem pelo menos
seis alelos (HLA-B8, HLA-B15, HLA-B18, HLA-C3, HLA-DR3 e HLA-DR4)
desse sistema que conferem ao seu portador um risco aumentado de vir
a apresentar diabetes do tipo 1, bem como três alelos (HLA-B7, HLA-B12
e HLA-DR2) que, ao contrário, protegem seu portador contra esse risco.
A artrite reumatoide (AR) é caracterizada pela presença
de inflamações frequentes nas articulações, que podem levar à
incapacidade funcional dos pacientes, com um complexo componente
genético. É uma doença que acomete as pequenas articulações, o que
leva a deformidades pela erosão da cartilagem e do osso. Essa doença
afeta muitos órgãos e tecidos, sobretudo nas articulações como os

punhos, mãos, cotovelos, ombros e pescoço, levando à deformidades.
O principal sinal da doença é muita dor nas articulações afetadas, dor,
calor, inchaço, simetria das articulações, movimentos limitados, rigidez
matinal, fraqueza e fadiga.
A fisiopatologia ocorre pela ação das células T e B autorreativas,
que levam ao quadro de sinovite, à infiltração celular e a um processo
desorganizado de destruição e remodelação óssea. A membrana
sinovial é a principal fonte de citocinas pró-inflamatórias e proteases
e, em conjunto com osteoclastos e condrócitos, promove a destruição
articular. Múltiplos fatores genéticos, incluindo o sistema HLA (HLA-
DRB1; 142857), influenciam a suscetibilidade à AR, a associação mais
citada de AR e sistema HLA é o lócus HLA-DR4. O diagnóstico da
AR é feito por meio da associação de dados clínicos, laboratoriais e
radiográficos. Os exames laboratoriais incluem a determinação do
fator reumatoide, porém os resultados devem ser analisados de forma
criteriosa. E além disso, pode-se dosar os anticorpos anti-CCP o qual
possui elevada especificidade e sensibilidade semelhante ao FR, o que
torna a determinação do anti-CCP uma ferramenta de grande utilidade
para o diagnóstico da AR.
As doenças cardiovasculares são o resultado de um estilo de vida
inadequado, fatores psicológicos, sedentarismo, ausência de atividade
física, dieta mal balanceada e tabagismo. A idade bem como o histórico
familiar são importantes porque podem aumentar a chance de risco de
doença cardiovascular. As doenças cardíacas congênitas podem ser
devido a agentes teratogênicos como drogas, elementos ambientais
e infecções. As principais alterações cromossômicas observadas são
numéricas e correspondem à presença adicional ou à falta de um
cromossomo. Dentre elas, temos a trissomia livre do cromossomo 21 (+21),
a principal constituição cromossômica observada em indivíduos com
síndrome de Down, trissomia livre do cromossomo 18 (+18), responsável
pela síndrome de Edwards. Anormalidades recorrentes, mas menos
frequentes, consistiram da trissomia livre do cromossomo 13 (síndrome
de Patau), da monossomia do cromossomo X (síndrome de Turner), da
síndrome de Klinefelter e da triploidia.
As doenças arteriais coronarianas tem como fatores de risco o gênero

do sexo masculino, idade, histórico familiar da doença, hiperlipidemia,
hipercolesterolemia, hipertensão, diabetes, obesidade, baixos níveis de
lipoproteínas de alta densidade (HDL) e altos níveis de LDL, polimorfismos
lipoproteicos, como altos níveis de apolipoproteína B, apolipoproteína A1
(apo A1), lipoproteína a – Lp(a) – e a enzima conversora da angiotensina I,
além de associação coma hipercolesterolemia familiar. Outros associados
são os genéticos e ambientais, como vida sedentária, dieta rica em
colesterol, tabagismo, caracterizado por ansiedade. A análise laboratorial é
feita a partir da análise do polimorfismo genético da apolipoproteína E ou
apo E (codificada por um gene do lócus, no cromossomo 19q13.2; OMIM
107741), o qual está relacionado com os níveis lipídicos. Essa lipoproteína
plasmática está envolvida no transporte e no metabolismo dos lipídeos,
sendo a principal lipoproteína associada ao aumento dos riscos de DAC. A
apo E liga-se aos receptores de LDL nas superfícies celulares, os quais são
responsáveis pela captação de colesterol pela célula.
A hipertensão arterial é um fator de risco das doenças cardiovascu-
lares é a causa mais importante de insuficiências cardíaca e renal, bem
como de morte súbita. As pessoas com hipertensão enquadram-se
em dois grupos: no primeiro grupo, a manifestação da hipertensão se
dá, geralmente, no início da vida adulta é uma consequência de outro
distúrbio, por exemplo, doença renal ou anomalias de algumas glândulas
endócrinas, o que é chamado de hipertensão secundária; no segundo
grupo, o mais comum, a hipertensão começa na meia-idade, sem
causa reconhecida, sendo denominada hipertensão essencial. O gene
associado é o C3 além da associação de vários lócus como o gene HYT1
(OMIM 603918), localizado no cromossomo 17q, HYT2 (OMIM 604329), no
cromossomo 15q, e HYT3 (OMIM 607329), no cromossomo 2p.
A obesidade é uma síndrome plurimetabólica que pode ser
definida tecnicamente de acordo com o IMC, que é o peso corporal em
relação à altura e que é dado pela medida do peso dividido pela altura
ao quadrado (peso/altura2). Mutações heterozigotas no gene do receptor
da melanocortina 4 (MC4R; OMIM 155541) causam obesidade como uma
característica isolada. Distúrbios autossômicos recessivos, cuja principal
característica è a obesidade, incluem deficiência de leptina (OMIM
164160), deficiência do receptor de leptina (OMIM 601007), deficiência

do pró-hormônio convertase 1 (OMIM 162150) e deficiência da pró-
opiomelanocortina (OMIM 609734). Associados a esses distúrbios, estão o
hipogonadismo hipogonadotrófico, o hipoadrenalismo e a baixa estatura.
E por fim, a osteoporose é caracterizada como diminuição da
densidade óssea e é uma das doenças mais comuns em mulheres
pós menopausa. Há uma possível interação entre o gene VDR (OMIM
601769), do receptor da vitamina D, e o gene ESR1 (OMIM 133430), do
receptor de estrogênio 1, associada diretamente com a densidade óssea.
O estrogênio influencia o metabolismo e o crescimento ósseo, e esse
efeito é dependente de receptores nucleares. Outro gene associado
com a determinação da densidade mineral óssea é CALCR (OMIM
114131), do receptor da calcitonina e o gene do colágeno tipo I alfa 1
(COLIA1; OMIM 120150) está associado à massa óssea e à predisposição
a fraturas. Outro gene envolvido no processo da osteoporose é o da
apolipoproteína E (APOE; OMIM 107741), que pode atuar no aparecimento
de fraturas, alterando a absorção de vitamina K. Assim, a pesquisa em
genética pode contribuir na elucidação das doenças complexas por
utilizar metodologias capazes de identificar os genes.
RESUMINDO:
Há doenças que não apresentam um erro metabólico
específico identificado, nem um tipo de herança definido,
mas sua agregação familiar indica que estão sob a influência
de alguns fatores genéticos. Essas doenças compõem o
grupo das doenças complexas. As doenças mais comuns da
espécie humana não estão relacionadas a mutações em um
ou dois genes, mas são devidas a polimorfismos genéticos
combinados com a ação de fatores ambientais. Um novo
paradigma para a investigação dessas doenças são o
mapeamento de da variação genética, útil na descoberta
de genes relacionados às doenças complexas. Suas
principais aplicações são comparar padrões de SNPs de
indivíduos afetados com os padrões de indivíduos normais,
identificar as variações espalhadas no genoma e descobrir
abordagens para lidar com as doenças no nível genético,
desenvolvendo terapêuticas mais adequadas e eficientes.
RESUMINDO:
As diferentes doenças podem ser consideradas dentro
de um espectro relacionado com os papéis relativos
da herança e do ambiente em sua etiologia. Esse
espectro vai desde as doenças que ocorrem somente
em indivíduos com uma determinada constituição
genética, independentemente das condições ambientais
– acondroplasia, hemofilia, fenilcetonúria – passando
pelo grupo das doenças complexas que não apresentam
padrão simples de herança e mostram a contribuição de
múltiplos fatores genéticos que interagem entre si e com
fatores ambientais de um modo complexo, e atingindo
outro extremo, onde estão agrupadas as doenças que
dependem quase exclusivamente de fatores ambientais (p.
ex., traumatismo, rubéola e tuberculose). A suscetibilidade
genética para uma dada doença complexa pode ocorrer
por meio da herança monogênica de um produto gênico
anormal envolvido em um padrão metabólico determinado,
como a doença arterial coronariana precoce devida à
hipercolesterolemia familiar. Em um indivíduo com uma
mutação no gene dessa doença, a suscetibilidade genética
é o principal determinante do desenvolvimento da doença
arterial coronariana, mas isso pode ser modificado por
alterações ambientais, como a redução da ingestão de
colesterol e a prevenção de outros fatores de risco, como
obesidade, falta de exercícios e tabagismo. A herança
monogênica da suscetibilidade a uma determinada
doença não acarreta, necessariamente, o desenvolvimento
dessa doença. Em alguns casos, a exposição a fatores
ambientais específicos será o principal determinante desse
desenvolvimento. Para entender a genética das doenças
complexas, o investigador pode abordar o problema de
diversas maneiras: comparar sua prevalência e incidência
em vários grupos populacionais diferentes; estudar os
efeitos da migração; investigar a ocorrência da doença entre
parentes; comparar a frequência em gêmeos idênticos e
fraternos; determinar o efeito de alterações ambientais em
estudos de adoção; estudar a associação dessas doenças
com diversas características, como os grupos sanguíneos,
sistema CHP e os polimorfismos bioquímicos e de DNA.
Testes genéticos utilizados no diagnóstico

das doenças genéticas
Os testes podem ser realizados com DNA ou com RNA. O RNA
deve ser obtido a partir de um tecido no qual o gene em questão é
expresso, e estas amostras precisam ser manipuladas com muito mais
cuidado do que amostras de DNA. Entretanto, análises de RNA podem
ser mais econômicas para um gene que possui vários éxons pequenos e
podem revelar splicings anormais que não aparecem em testes de DNA.
A amostra de DNA quando chega ao laboratório precisam ser
feitas algumas perguntas, tais como o paciente possui alguma mutação
em algum gene que possa explicar a doença? Essa pergunta deve
ter sido responda previamente pelo médico, uma vez que os testes
genéticos precisam ser direcionados, pois existem milhares de variações
específicas no DNA. Outra pergunta que dever feita é o paciente possui
alguma mutação neste gene específico que possa ser a causa da
doença? O paciente possui uma mutação específica neste gene em
particular, por exemplo, uma deleção de três bases no códon para
fenilalanina 508 no seu gene CFTR?
Com base nessas respostas, surge um outro questionamento, o
que testar e por que testar? O DNA pode ser obtido a partir a partir de
qualquer célula nucleada e o RNA pode ser avaliado quando se quer
saber a expressão de uma proteína, por exemplo.
Diversos materiais biológicos podem ser a fonte de DNA ou de
RNA. O sangue é a melhor fonte de DNA, a raspagem bucal pode ser
usada como fonte de DNA mas tem como limitação a quantidade e a
qualidade da amostra, pois pode vir com contaminantes. Tecidos como
pele e músculos são boa fonte de RNA, porém precisa ser o local onde
o gene está expresso e para isso é necessário uma biópsia, por isso tem
como desvantagem o fato de ser invasivo.
Raízes capilares, sêmen, pontas de cigarro podem ser usadas para
DNA especialmente para análises forenses ou toxicológicas, célula única
de um blastocisto pode ser usada para diagnósticos de pré-implantação
e a principal desvantagem é que requer um profissional bem treinado,
vilosidades coriônicas pode ser usada para fins diagnósticos no pré-
natal entre 9-14 semanas, fluido amniótico é uma fonte rica de DNA mas
só devem ser usadas para testes entre 15 e 20 semanas de gestação,
cartão de Guthrie papel absorvente usado para o teste do pezinho para
a triagem neonatal, caso os cartões fiquem ativados também servem de
fonte para DNA.
Se um gene precisa ser explorado para se obter informações
acerca de mutações desconhecidas, deve ser testado o RNA por PCR
com transcriptase reversa, uma vez que testar diretamente o DNA
envolve amplificar e testar cada éxon separadamente, e isso pode ser
um grande trabalho em um gene com muitos éxons, além de demora
na emissão do resultado. Contudo, alguns cuidados são necessários
quanto a análise do RNA, a saber, a manipulação deve ser feita com
cuidado e de forma rápida, pois, o DNA se degrada de uma maneira
muito rápida, o gene de interesse precisa estar expresso no tecido feita
a biópsia, além disso, podem ser detectados um número muito baixo
de transcritos ilegítimos, e além disso mutações truncadas geralmente
resultam em um mRNA instável devido ao decaimento mediado por
moléculas sem sentido, de maneira que o produto de RT-PCR de uma
pessoa heterozigota pode apresentar apenas o alelo normal.
Um gene é normalmente investigado para mutações por meio
de sequenciamento. Para o sequenciamento podem ser usados alguns
métodos como mobilidade de heterodúplices, que possui como
vantagem o fato de ser simples, barato e de uso simples e as desvanta-
gens são aplicabilidade em sequências inferiores a 200 pares de
bases, sensibilidade limitada e não revela a alteração, outra técnica é a
cromatografia líquida de alto desempenho desnaturante que possui como
vantagem ser rápida, alta eficiência e é quantitativa e como desvantagens
o equipamento é caro e também não revela a posição da alteração, ainda
tem o método de polimorfismo de conformação de fita simples que tem
como vantagem a alta sensibilidade e como desvantagem a plataforma é
exclusiva do aparelho Light-Cycler e por fim, têm-se o teste de truncagem
de proteínas que possui alta sensibilidade para análise de mutações de
término de síntese, indica a posição da alteração e como desvantagens
o fato de ser útil apenas na identificação de mutações de término de
síntese, metodologia cara e difícil e geralmente trabalha com RNA.
EXPLICANDO MELHOR:
Ensaios de heterodúplices são ensaios de hibridização
que envolvem, a ligação da amostra-teste à superfície de
um suporte sólido ou a fixação da população de sondas
a esse suporte. A ligação da população de moléculas ao
suporte sólido é feita de maneira a permitir que sequências
diferentes sejam fixadas em posições definidas na superfície
sólida, mas não necessariamente em apenas uma das
extremidades da superfície.
Os métodos de truncamento das proteínas são baseados na

tradução. É um teste específico para verificar alterações do quadro de leitura
(frameshifts), sítios de splice ou mutações sem sentido que criam um códon
de terminação prematura. É um método que pode ser utilizado para avaliar
determinadas mutações como polipose adenmatosa ou câncer de mama
associado ao BRCA1. Esse ensaio ignora substituições de bases silenciosas
ou sem sentido e revela a localização aproximada de qualquer mutação.
Além dessas técnicas, ainda pode-se detectar padrões de metilação do DNA.
Metilação do DNA
A metilação do DNA está associado ao controle de expressão
gênica. A análise da metilação é importante para algumas doenças,
como a síndrome do X frágil, porque a expansão da repetição do gene
FMR1 dispara a metilação do promotor e a metilação silencia o gene e
causa a síndrome, na síndrome de Prader–Willi, Angelman, Beckwith-
-Wiedemann e Russell–Silver também ocorrem padrões de metilação
genitor-específico em loci impritados e em tumores, uma vez que genes
supressores de tumor geralmente são silenciados por metilação.
Estudos de metilação no genoma inteiro utilizam a imunoprecipitação
da cromatina com um anticorpo contra o DNA metilado e o estado de
metilação de uma sequência individual é feito a partir de digestão com
enzima de restrição na qual a enzima HpaII cliva apenas a sequência
CCGG não metilada, enquanto a MspI cliva qualquer sequência CCGG,
estando ou não metilada. Assim, o DNA genômico metilado apresenta
diferentes padrões de fragmentos de restrição com essas duas enzimas.
Alternativamente, um molde de PCR contendo uma sequência CCGG pode

ser digerido com qualquer uma destas enzimas antes da amplificação. Se
a sequência CCGG estiver metilada, o molde não será clivado por HpaII,
e a PCR produzirá um produto e outro ensaio é a modificação bissulfito,
que quando ocorre o tratamento do DNA pelo bissulfito de sódio, a citosina
(exceto a 5-metilcitosina) é convertida em uracila.
Outros métodos de investigação

Ainda pode-se investigar uma alteração de sequência específica
especialmente nos casos de diagnóstico de doenças com heterogeneidade
alélica limitada, diagnóstico familiar, polimorfismo, genotipagem de SNPs.
Os métodos que podem ser utilizados para essa investigação
são PCR que pode ser utilizado quando a mutação cria ou elimina um
sítio de restrição natural, hibridização de DNA amplificado por PCR a
oligonucleotídeos núcleo específicos em um dot plot ou chip gênico o
qual avalia mutações de pontos específicos e conseguem avaliar grande
número de mutações ou SNPs, PCR com primers alelo-específicos é
usado para mutações de ponto únicas e nesse ensaio o desenho dos
primers é crítico para o sucesso do resultado, extensão de primer de
nucleotídeo único é usado para mutações de pontos específicos e a leitura
precisa ser realizada em um sequenciador de DNA, ensaio de ligação de
oligonucleotídeo (OLA) também avalia mutações de ponto específicas e
os testes precisam ser feitos em multiplex, pirossequenciamento é um
método de larga escala de poucos nucleotídeos em posições específicas
e o resultado é quantitativo, espectrometria de massa gera resultados
quantitativos e é rápido, PCR com primers localizados nas extremidades
de um ponto de translocação em uma amplificação bem sucedida
mostra a presença da deleção suspeita ou do rearranjo especificado.
A localização do primer comum pode ser escolhida para originar
produtos de diferentes tamanhos para diferentes mutações, de maneira
que os produtos de uma reação de PCR multiplex possam ser separados
por eletroforese. Os pares de primers específicos para a mutação também
podem ser projetados para originar produtos distinguíveis. Por exemplo,
eles podem ser marcados com fluorescências diferentes ou com outras
marcações, ou acrescidos de extensões 5 de diferentes tamanhos.
Geralmente, os íntrons são muito maiores do que os éxons

que flanqueiam, e por isso pontos de quebra aleatórios em um gene
têm maior probabilidade de estarem em um íntron. Desta maneira,
deleções ou duplicações parciais de uma sequência gênica em escala
de quilobases, se não estiverem inteiramente em um íntron, irão muito
provavelmente remover ou duplicar um ou mais éxons inteiros. Quando
o gene candidato já for conhecido, a técnica de escolha para detectar
deleções ou duplicações de éxons inteiros é a amplificação de sonda
dependente de ligação multiplex (MLPA).
Como ocorre no OLA, pares de oligonucleotídeos hibridizam em
regiões adjacentes no DNA teste, e a DNA-ligase sela a fenda entre eles
produzindo uma única molécula. No OLA a fenda é posicionada em um
nucleotídeo variante suspeito, e a ligação ocorrerá apenas se houver um
pareamento exato; no MLPA a fenda é posicionada em um nucleotídeo
(espera-se) não variante no DNA teste, de maneira que a ligação será
sempre feita se a sequência molde estiver presente. A ligação cria uma
molécula amplificável por A presença de um produto de PCR indica a
presença da sequência correspondente apropriada no DNA teste.
SAIBA MAIS:
Para entender a aplicação desses ensaios nas doenças
acesse o artigo Diagnostico citogenético de pacientes com
retardo mental idiopático, disponível em https://bit.ly/2kqFblz
RESUMINDO:
O sucesso da análise laboratorial das mutações depende
de fatores como o tipo de amostra utilizada bem como da
metodologia escolhida. Para isso, é necessário que a escolha
do teste genético seja capaz de investigar os casos bem
como identificar os genes sejam inteiros ou apenas parte dele.
A obtenção das amostras se DNA ou RNA depende em qual
tecido o gene em questão é expresso, e além disso, deve-
se prestar atenção na manipulação correta das amostras
para evitar a degradação ou a contaminação das mesmas.
A primeira parte da análise ocorre a partir da amplificação
de sequências relevantes por meio de PCR ou RT-PCR.
RESUMINDO:
Seu propósito é reduzir o volume de sequenciamento
necessário para detectar uma mutação, estes métodos
geralmente exploram diferenças nas propriedades de
heterodúplices de DNA ou a conformação de DNA de
fita simples sob condições não desnaturantes. O teste
de proteína truncada pode ser utilizado com o fim de
triar um gene para mutações que introduzem um códon
de terminação prematuro, novas alterações de sentido
trocado ou sinônimas identificadas durante a triagem de
um gene candidato para mutações patogênicas oferecem
grandes problemas de interpretação. Várias abordagens
são utilizadas para tentar decidir se a alteração é patogênica
ou não, mas se elas falham em fornecer uma resposta
definitiva, a alteração deve ser listada como uma variante
não classificada, eles geralmente envolvem a hibridização
alelo-específica, a ligação de DNA alelo-específico ou a
extensão de primer por meio do sítio em questão. Estes
métodos são utilizados também para a genotipagem de
polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Além dessas,
técnicas especiais para identificar deleções ou outras
alterações de número de cópia incluem a amplificação
múltipla de sonda dependente de ligação (MPLA; utilizada
para detectar a duplicação ou a deleção de um ou alguns
éxons) e a hibridização genômica comparada (CGH;
utilizada para detectar grandes alterações) e às vezes o
rastreamento gênico é utilizado em estudos familiares
para descobrir se alguém herdou um alelo patogênico,
em casos nos quais é impraticável ou indesejável buscar
diretamente a mutação. Assim, os genótipos de um número
limitado de microssatélites altamente polimórficos podem
ser utilizados para produzir um perfil de uma amostra
de DNA e esse perfil de DNA pode ser empregado para
determinar a zigosidade de gêmeos ou a paternidade de
uma criança, ou em investigações criminais para identificar
a fonte do DNA recuperado na cena de um crime.
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Read, Andrew & Donnai, Dian (2008) Genética Clínica: uma nova
abordagem. Artmed Editora S.A., Porto Alegre, RS, 425 pp.
Nussbaum, Robert L.; McInnes, Roderick R.; Willard, Huntington
F. (2008) Thompson & Thompson – Genética Médica. Sétima Edição.
Editora Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro, RJ, 525 pp. Disponível
em; http://bit.ly/2P2DINR. Acesso em 28 de agosto de 2019.

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Citogenética

Olá. Meu nome é Rosalina Guedes Donato Santos. Sou formada

INTRODUÇÃO: para DEFINIÇÃO: houver

NOTA: quando forem IMPORTANTE: as

Papel da genética no metabolismo bioquímico 10

Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) 14

Identificação dos genes de doenças humanas

Genética das doenças complexas 26

Testes genéticos utilizados no diagnóstico

Outros métodos de investigação 35

Princípios da citogenética clínica

Papel da genética no metabolismo

Figura 1: Erros metabólicos

Em uma via biossintética, o efeito será a ausência do produto final.

1-pirofosfato (substância que em quantidades normais exerce o controle

Além disso, nos erros inatos do metabolismo ainda podem conter

fosfato em glicose-1-fosfato. Nos homozigotos, essa etapa metabólica

Ademais, a falta de um produto final ou excesso de um substrato

Lipoproteínas de baixa densidade (LDL)

os critérios clínicos e laboratoriais devendo sempre ser hipótese

genótipo conhecido são cruzados e a frequência de recombinação entre

Fonte: wikimedia commons

Os mapas genéticos têm muitas limitações, a primeira delas

ao longo de um cromossomo. Existem algumas discrepâncias entre

mapeamento de sítio de sequência marcada (STS), que localiza as posições

Após essa etapa, os cromossomos ou os fragmentos maiores são

clones de inserção. Uma vantagem deste tipo de sequenciamento é que

Assim, após determinar a sequência de genes é importante

Para a análise proteômica, é necessário a separação das proteínas,

Para melhorar a identificação de proteínas, ainda podem ser

Figura 7: Análise da espectrometria de massa

Assim, para a análise genética são necessárias diversas ferramentas

Identificação dos genes de doenças

Para realizar a identificação de todos os genes, hoje em dia pode-se

age em cis. Alternativamente, ela pode causar um ganho de função, por

Genética das doenças complexas

familiar de diabetes, excesso de peso associado ao sedentarismo, baixos

afeta muitos órgãos e tecidos, sobretudo nas articulações como os

As doenças arteriais coronarianas tem como fatores de risco o gênero

164160), deficiência do receptor de leptina (OMIM 601007), deficiência

Testes genéticos utilizados no diagnóstico

Os métodos de truncamento das proteínas são baseados na

Alternativamente, um molde de PCR contendo uma sequência CCGG pode

Outros métodos de investigação

Geralmente, os íntrons são muito maiores do que os éxons

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