Citogenética

no Diagnóstico
Laboratorial
Rosalina Guedes Donato Santos

Aula 01
 Diretor Executivo
DAVID LIRA STEPHEN BARROS
Diretora Editorial
ANDRÉA CÉSAR PEDROSA
Projeto Gráfico
MANUELA CÉSAR ARRUDA
Autor
EDUARDO NASCIMENTO DE ARRUDA
Desenvolvedor
CAIO BENTO GOMES DOS SANTOS
Autora
Rosalina Guedes Donato Santos

Olá. Meu nome é Rosalina Guedes Donato Santos. Sou formada

em Biomedicina, com uma experiência técnico-profissional na área
de imunologia, hematologia, toxicologia, análises clínicas de mais
de 12 anos. Passei por empresas com a Faculdade de Ciências e
Tecnologia, UNIFACS, UNIRB, Laboratórios como o Hospital Roberto
Santos, Laboratório José Silveira e Universidade Federal da Bahia. Sou
apaixonado pelo que faço e adoro transmitir minha experiência de vida
àqueles que estão iniciando em suas profissões. Por isso fui convidada
pela Editora Telesapiens a integrar seu elenco de autores independentes.
Estou muito feliz em poder ajudar você nesta fase de muito estudo e
trabalho. Conte comigo!
Iconográficos
Olá. Meu nome é Manuela César de Arruda. Sou a responsável pelo pro-
jeto gráfico de seu material. Esses ícones irão aparecer em sua trilha de
aprendizagem toda vez que:

INTRODUÇÃO: para DEFINIÇÃO: houver

o início do desen- necessidade de
volvimento de uma se apresentar um
nova competência; novo conceito;

NOTA: quando forem IMPORTANTE: as

necessários obser- observações escritas
vações ou comple- tiveram que ser prio-
mentações para o rizadas para você;
seu conhecimento;
EXPLICANDO ME- VOCÊ SABIA? curio-
LHOR: algo precisa sidades e indaga-
ser melhor explica- ções lúdicas sobre o
do ou detalhado; tema em estudo, se
forem necessárias;
SAIBA MAIS: textos, REFLITA: se houver a
referências biblio- necessidade de cha-
gráficas e links para mar a atenção sobre
aprofundamento do algo a ser refletido
seu conhecimento; ou discutido sobre;
ACESSE: se for RESUMINDO:
preciso acessar um quando for preciso
ou mais sites para se fazer um resumo
fazer download, acumulativo das
assistir vídeos, ler últimas abordagens;
textos, ouvir podcast;
ATIVIDADES: quando TESTANDO: quando
alguma atividade o desenvolvimento
de autoaprendiza- de uma compe-
gem for aplicada; tência for conclu-
ído e questões
forem explicadas;
 SUMÁRIO
Estrutura do cromossomo humano e organização molecular
da cromatina 10
Estrutura do DNA 10
Condensação do DNA 13
Centrômero 14
Telômeros 15
Características dos cromossomos humanos 16
Código genético 18
DNA repetitivo em tandem 19
DNA mitocondrial 21
Replicação do DNA 22
Ciclo celular 25
Reguladores do ciclo celular 27
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 7

01
UNIDADE
8 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

INTRODUÇÃO
A compreensão acerca da importância da genética para a medicina
exige uma compreensão do material hereditário, como ele atua no
genoma humano e como ele pode ser transmitido de uma célula para
outra durante o processo de divisão celular e de geração em geração
durante a reprodução. O genoma humano é composto pelo DNA (ácido
desoxirribonucleico) que contém na sua composição a informação genética
necessária para validar os processos relacionados com a embriogênese,
desenvolvimento, crescimento, metabolismo e reprodução. Cada célula
nucleada do corpo contém seu próprio genoma humano, o qual contém
cerca de 25.000 genes. Então, podemos definir gene como sendo a
unidade de informação genética, organizados em diversas organelas
em forma de bastão os quais chamamos de cromossomos. A influência
dos genes e da genética são cruciais para o entendimento de doenças
genéticas. A análise dos cromossomos, da sua estrutura e da sua
hereditariedade é denominado de citogenética. A citogenética contribui
para o diagnóstico clínico das doenças genéticas, mapeamento genético,
citogenética do câncer e diagnóstico pré-natal. Entendeu? Ao longo desta
unidade letiva você vai mergulhar neste universo!
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 9

OBJETIVOS
Seja muito bem-vindo à Unidade 1. Nosso objetivo é auxiliar você
no desenvolvimento das seguintes competências profissionais até o
término desta etapa de estudos:
1. Descrever a estrutura do DNA.
2. Analisar a estrutura e morfologia do cromossomo.
3. Apontar as fases do ciclo celular.
4. Analisar as proteínas reguladoras do ciclo celular.
Então? Preparado para uma viagem rumo ao conhecimento? Ao
trabalho!
10 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Estrutura do cromossomo humano e

organização molecular da cromatina
INTRODUÇÃO:
Ao término deste capítulo você será capaz de entender
como ocorre à organização do genoma humano. Isto será
fundamental para o exercício de sua profissão. As pessoas
que tentaram realizar as técnicas da citogenética sem a
devida base tiveram problemas na resolução e no diagnóstico
laboratorial das doenças genéticas. E então? Motivado para
desenvolver esta competência? Então vamos lá. Avante!

Estrutura do DNA
Os genes podem ser estudados a partir de três pontos diferentes: o
molecular, mendeliano e populacional. Do ponto de vista molecular, o gene é
a sequência e DNA que contém a informação necessária para sintetizar uma
molécula de RNA. Cada gene está localizado em sum sítio do cromossomo.
A informação genética contida nas moléculas de DNA está
localizada no núcleo da célula e a síntese proteica ocorre no citoplasma
conforme mostramos na figura 1. Assim, o RNA mensageiro copia a
informação presente no DNA e dirige-se até o citosol, no qual conduz a
síntese da proteína. Dessa forma, no núcleo o DNA determina a sequência
dos nucleotídeos do RNA mensageiro, e no citoplasma o RNA mensageiro
estabelece a sequência de aminoácidos e proteínas.
Figura 1: fluxo da informação genética em eucariotos

Fonte: http://bit.ly/2uD3AJx
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 11

O DNA é composto de monômeros chamados de nucleotídeos.

Cada nucleotídeo é composto por uma base nitrogenada, um açúcar
e um resíduo de ácido fosfórico ligados de maneira covalente. As
bases nitrogenadas podem ser de dois tipos: pirimidinas e purinas. As
pirimidinas são compostas pela citosina (C), timina (T) e uracila (U), com
a presença de um anel aromático e as purinas contém adenina (A) e
guanina (G) e apresentam dois anéis aromáticos.
O açúcar é uma pentose, a 2-desoxirribose que estabelece
uma ligação glicosídica entre o seu carbono C-1’ e o nitrogênio N-1
das pirimidinas ou o nitrogênio N-9 das purinas, portanto uma ligação
N-glicosídica e o ácidofosfórico se liga ao carbono C-5’ da pentose
através de uma ligação éster. Assim, quando existe uma ligação
apenas entre uma das bases nitrogenadas e a pentose, ligados de
forma covalente, temos o nucleosídeo. Essa composição das bases é
importante porque diferencia RNA e DNA em sua composiçãoquímica
quanto a dois aspectos: o RNA possui ribose, no lugar da desoxirribose,
e uracil, em vez de timina.
Figura 2: DNA com as bases e as ligações de pontes de hidrogênio

Fonte: http://bit.ly/2FEo4nf

Os ácidos nucleicos são produzidos a partir da polimerização de

nucleotídeos. A ligação ocorre entre os monômeros a partir de duas
ligações éster pelo ácido fosfórico com os grupos hidroxila dos carbonos
12 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

C3’ e C5’ de nucleotídeos adjacentes que é denominada ligação 3’, 5’-

fosfodiéster. A partir disso é formado o esqueleto açúcar-fosfato ou
hélice, o qual apresenta polaridade, com uma extremidade 5’ que possui
o grupo fosfato, e a outra extremidade 3’ que apresenta a hidroxila
livre. As bases nitrogenadas se posicionam em eixos perpendiculares
ao esqueleto açúcar-fosfato. Assim, o fator primordial na estrutura dos
ácidos nucleicos é a sequência de bases nitrogenadas.
A conformação que o DNA adota depende de vários fatores: nível
de hidratação, sequência de DNA, direção e grau do superenrolamento,
modificações químicas das bases, tipo e concentração de íons metálicos
e presença de poliaminas em solução. Em condições fisiológicas, a maior
parte do DNA de procariotos e eucariotos aparece com a forma desse
modelo: uma hélice com giro para a direita (dextrógira) e entre 10 e 10,5 bases
por giro, formando dois sulcos, um grande e profundo (sulco maior), outro
pequeno, estreito ou raso (sulco menor). Essa estrutura pode transformar-
-se no A-DNA, forma rara já conhecida quando surgiu o modelo de Watson
e Crick, também dextrógira, que existe somente em condições salinas altas
ou de desidratação, contendo 11 pares de bases por giro e diferindo do
B-DNA por uma rotação de 20° em relação ao eixo perpendicular da hélice,
o que causa mudança na aparência dos sulcos maior e menor.
Figura 3: Dupla hélice do DNA com o sulco maior e menor

Fonte: http://bit.ly/39VBPMn
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 13

Condensação do DNA
Podemos definir o termo “condensação do DNA” da seguinte
maneira: É um processo que ocorre quando a célula está próxima de se
dividir.
Nas células eucarióticas humanas os núcleos têm em média 10
μ de diâmetro e abrange mais de metros de DNA empacotados em 46
cromossomos. Pela razão do genoma ocupar quase todo o espaço, uma
célula precisa duplicar de maneira uniforme quase todo o DNA antes
de se dividir. Para que essa tarefa ocorra é necessário a compactação
da cromatina. O genoma humano é constituídos por aproximadamente
3,2 x 109 nucleotídeos que estão compactados e distribuídos nos 24
cromossomos (22 autossômicos e 2 sexuais).
Cada cromossomo é composto por uma única fita de DNA contínua
ligada por meio de proteínas chamadas de histonas e não histonas, e
esse complexo chamamos de cromatina. A unidade fundamental da
cromatina é o nucleossomo que é composto de aproximadamente
146 pares de bases de DNA enoveladas ao redor de octâmero central
das proteínas histonas. Há cerca de cinco tipos de HISTONAS que são
chamadas de H1, H2A, H2B, H3 e H4.
Figura 4: Organização de um nucleossomo formado
por um octâmenro de histonas, associado à histona H1

Fonte: http://bit.ly/36KnQa4

O equilíbrio dinâmico da cromatina abrande diversos mecanismos

entre os quais as modificações pós-traducionais das caudas N-terminal
das histonas. Estas modificações podem resultar em transcrição ou
14 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

silenciamento gênico através da ação de enzimas capazes de acetilar,

desacetilar ou transferir grupamentos metil. Assim, uma alteração na
expressão dessas enzimas pode levar à carcinogênese.

Centrômero

DEFINIÇÃO:
Centrômeros são regiões cromossômicas que têm a habili-
dade de mediar a ligação dos microtúbulos ao DNA, por
meio de uma estrutura proteica conhecida como cinetócoro.

A região centromérica contém um núcleo central para a montagem

do cinetócoro durante a divisão celular. Esse complexo vai garantir uma
distribuição igual de cromossomos para as células‐filhas. O DNA nesta
região é formado por sequências altamente repetitivas, que originam
uma constrição no cromossomo chamada de constrição primária. Neste
sítio, unem-se as cromátides-irmãs, sendo também o local onde ocorre
a formação do cinetócoro.
O cinetócoro é uma estrutura única que liga os cromossomos
ao fuso acromático, monitora essa ligação de cada cromossomo,
através do checkpoint mitótico, e une as forças do fuso acromático e
das proteínas para mover os cromossomos durante a pro-metáfase e
a anáfase. O segmento cromossômico situado acima do centrômero é
chamado de braço curto (p – do francês, petit), e abaixo do centrômero
fica o braço longo (q). Assim, os cromossomos são classificados em
três tipos, conforme a posição do centrômero: metacêntrico, quando o
centrômero se localiza aproximadamente na região central e divide o
cromossomo em dois braços de tamanhos similares; submetacêntrico,
com o centrômero fora da região central e braços ligeiramente desiguais;
acrocêntrico, com o centrômero próximo da extremidade e um braço
curto muito pequeno.
Em metáfases de cromossomos humanos tratados com
colchicina, o centrômero é visto nitidamente em todos os cromossomos.
Durante a interfase, os centrômeros são vistos com coloração DAPI
como estruturas brilhantes. (Ver figura 04)
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 15

Figura 5: Mudanças nos cromossomos e no conteúdo do DNA durante o ciclo celular

Fonte: http://bit.ly/2sc2ZO5

A constrição secundária é observado nos braços curtos dos

cromossomos acrocêntricos. Em consequência deste estreitamento,
sua extremidade apresenta-se visualmente separada do restante do
cromossomo, sendo por isso denominada satélite (porção de cromatina
que se localiza distal à constrição secundária dos acrocêntricos humanos).

Telômeros
O nome telômero vem do grego e significa “parte final”. As
extremidades dos cromossomos possuem uma sequência de DNA
(TTAGGG) repetida muitas vezes, estas repetições, em grande parte,
servem como locais para vinculação de proteínas específicas dos
telômeros que impedem de obter o reparo das respostas normalmente
ativadas por sequências de DNA terminais.
Telômeros são estruturas localizadas nas extremidades dos
cromossomos lineares, cujo encurtamento ocorrido a cada mitose pode
resultar em senescência ou envelhecimento.
16 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Assim, as funções biológicas dos telômeros são a proteção dos

cromossomos e das fusões das sequências finais com outros cromossomos,
reconhecimento dos danos do DNA, estabelecimento de mecanismos
para a replicação do DNA, contribuem para a organização funcional do
cromossomo no interior da célula, participa na regulação da expressão
gênica e controla a capacidade replicativa das células humanas.
O tamanho dos telômeros é mantido por enzimas, chamadas
de telomerases, que adicionam as repetições de seis nucleotídeos á
sua extremidade. A enzima telomerase utiliza um componente interno,
e também desempenha um papel importante, pois impede que as
sequências teloméricas terminais se percam a cada divisão celular.
No entanto, essa enzima só está ativa nas células germinativas e
embrionárias. Logo, à medida que se multiplicam, as células somáticas sofrem
um encurtamento de suas extremidades, devido a uma falta de atividade da
telomerase. Talvez esse encurtamento funcione como um sinalizador para
os mecanismos de apoptose, indicando que a célula está envelhecendo e
apresenta maior possibilidade de sofrer uma alteração estrutural.

SAIBA MAIS:
A senescência replicativa e o envelhecimento em células
humanas estão associados à ausência de atividade da
enzima telomerase. Para saber mais sobre o assunto leia
o artigoContribuição dos Telômeros e da Telomerase
no Surgimento de Neoplasias e no Processo de
Envelhecimento disponível em: https://bit.ly/2HoUSSr

Características dos cromossomos humanos

Os cromossomos estão localizados no núcleo. Os seres humanos
possuem 46 cromossomos, divididos em 23 pares, sendo 44 autossomos
e 2 sexuais. O estudo das características estruturais e numéricas dos
cromossomos é feito a partir da citogenética. Essa técnica avalia defeitos
relacionados com a estrutura cromossômica bem como a quantidade de
cromossomos. A observação de cromossomos é feita por um processo
chamado cariotipagem, uma palavra derivada do grego karyon, que
significa “núcleo”.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 17

RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu
mesmo? Agora, só para termos certeza de que você
realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo,
vamos resumir tudo o que vimos. Você deve ter aprendido
que o DNA é molécula chave do genoma humano. O DNA
é composto de nucleotídeos, os quais são compostos por
uma pentose (um carboidrato de cinco carbonos), uma
base nitrogenada e grupos fosfatos. O açúcar presente
no DNA é a desoxirribose. As bases nitrogenadas são
classificadas em pirimidinas e purinas. As piridiminas
são compostas de carbônio e nitrogênio e as purinas
possuem dois anéis. As piridiminas são Citocina (C), timina
(T) e uracila (U), e as purinas são adenina (A) e guanina
(G). A uracila não é observada no DNA. Essas bases são
complementares. Quando a célula está próxima a se dividir
o DNA é condensado. Nos eucariotos, a compactação do
DNA ocorre por meio da adição de proteínas chamadas
de histinas, que são proteínas de carga negativa as quais
enovelam o DNA. O complexo de DNA, histonas e outras
proteínas estruturais chamamos de cromatina. Quando
a cromatina se condensa, pode-se observar a presença
de pedaços lineares e avulsos, o qual chamamos de
cromossomos. Os cromossomos humanos compreendem
cerca de 46 cromossomos organizados em 23 pares, e os
dois membros de cada par são considerados homólogos
entre si. O centrômero é a região mais condensada do
cromossomo e podem ser classificadas em metacêntrico
quando o centrômero está localizado exatamente no
meio do cromossomo, submetacêntrico quando ele está
«um pouco» afastado do centro, acrocêntrico quando
o centrômero está mais próximo das extremidades do
que do centro, telocêntrico - quando ele está numa das
extremidades do cromossomo e acêntrico- quando ele está
numa das extremidades e não possui mais genes acima
deles sendo portando a extremidade final do cromossomo.
E, os telômeros são estruturas responsáveis por conferir a
estabilidade do cromossoma.
18 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Código genético
O código genético analisa a relação entre a sequência de
bases nitrogenadas do DNA e a sequência de aminoácidos na cadeia
polipeptídica correspondente. A palavra-chave do código para um
aminoácido consiste em uma sequência de três bases nitrogenadas
adjacentes, que formam a unidade de informação genética ou códon.
O código genético apresenta as seguintes características:
1. A leitura do código genético é feita em trincas de bases ou de
nucleotídeos;
2. O código é dito degenerado ou redundante. Isso ocorre porque
existem aminoácidos que são codificados por dois ou mais códons, isso
é de extrema importância uma vez que o DNA possui apenas quatro
bases distintas, são necessárias diversas combinações dessas bases
para codificar os diferentes tipos de aminoácidos.
Por exemplo, o aminoácido fenilalanina pode ser codificado
por dois códons diferentes: UUU e UUC. Os códons que representam
os mesmos aminoácidos são denominados códons sinônimos,
relacionando-se, em geral, por uma alteração de sua terceira base; a de-
generação da terceira base minimiza os efeitos de possíveis mutações.
3. Ambíguo porque uma trinca só pode codificar um aminoácido.
A exemplo da fenilalanina que pode ser codificado por UUU e UUC e
nenhum outro aminoácido pode ser codificado pela mesma trinca de
aminoácidos;
4. É um código sem superposição, ou seja, uma dada base
pertence a uma só trinca ou códon;
5. É, também, contínuo, não existindo espaçamento entre os
códons;
6. É dito semiuniversal porque os mesmos aminoácidos são
codificados com os mesmos códons em quase todos os organismos,
permitindo que um RNA mensageiro seja traduzido em uma célula de
outra espécie, o que possibilitou a técnica do DNA recombinante;
7. Presença de códons de iniciação e de finalização ou terminação.
O início da síntese de um polipeptídio, em procariotos, é assinalado
pela presença de um códon iniciador específico, que é AUG no RNA
mensageiro, correspondendo ao aminoácido metionina. Há, também,
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 19

códons finalizadores ou terminadores, que indicam o término da síntese

polipeptídica, como UAA, UAG e UGA, e em geral não correspondem a
aminoácidos em eucariotos.
O DNA nuclear dos eucariotos apresenta os seguintes tipos de
sequências: DNA não repetitivo, que consiste em sequências individuais
presentes em apenas uma cópia no genoma haploide; e DNA repetitivo,
que abrange sequências presentes em mais de uma cópia por genoma.
O DNA não repetitivo ocorre a partir de sequências individuais presentes
em apenas uma cópia por genoma, contendo os genes estruturais (55
Mb) e sequências relacionadas (945 Mb). O DNA repetitivo é constituído
a partir do o DNA extragênico, que abrange 2.000 Mb sem informação
genética conhecida.

REFLITA:
É importante refletir sobre a manipulação do genoma
humano, principalmente quanto ás implicações éticas.
O Projeto Genoma Humano trouxe várias possibilidades,
como por exemplo, a identificação de genes associados a
doenças, mas modificando às vezes comportamentos ao
intervir geneticamente no ser humano, trazendo benefícios
ou malefícios sociais. Devido a esse grande salto surgiu o
estudo do proteoma, a base dessa nova ciência é estudar
as proteínas bem com as suas interações na célula, isso
poderia levar ao entendimento do funcionamento do
organismo bem como das células. Assim, o grande desafio
é decidir o que a humanidade pretende em relação a este
gigantesco salto.

DNA repetitivo em tandem

As repetições em tandem (nas quais o início de uma repetição
ocorre imediatamente adjacente ao final de outra) consistem em muitas
repetições de sequênciais de DNA não codificadoras, que podem estar
concentradas em locais restritos ou muito dispersas no genoma. Pode
ser dividido em três subtipos:
1. DNA satélite: O DNA satélite baseia-se nos segmentos de
DNA relativamente simples, curtos e altamente repetitivos, que diferem
do resto do DNA pelo arranjo das bases. Na época atual o uso termo
20 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

satélite foi ampliado para descrever o DNA altamente repetitivo, cujas

sequênciasdispõem-se lado a lado (em tandem), mesmo que ele não
possa ser separado do restante em função de sua densidade nos
gradientes. Essa característica pode ser aplicada na técnica de FISH
(hibridização in situ por fluorescência). Essa é uma técnica é uma
ferramenta para a citogenética molecular que utiliza sondas de DNA
marcadas com fluorescência com o objetivo de detectar anomalias
cromossômicas como microdeleções e rearranjos complexos. As sondas
utilizadas são sequências repetitivas (DNA satélite);
2. Minissatélites são formadas a partir de duas famílias de
repetições curtas em tandem. Podem ser do DNA telomérico, situado na
porção terminal das extremidades cromossômicas (telômeros), consistindo
em 10 a 15kb de repetições em tandem de uma sequência de DNA de 6
pb (TTAGGG); esse DNA é necessário para a integridade cromossômica
na replicação e é adicionado ao cromossomo por uma enzima específica
denominada telomerase ou DNA minissatélite hipervariável, que ocorre
nas proximidades dos telômeros e em outros locais dos cromossomos.
O DNA hipervariável está localizado, principalmente, nas proximidades
dos centrômeros e, como sua herança responde às leis mendelianas, a
medicina forense o utiliza quando precisa realizar estudos de paternidade
ou de identidade de pessoas;
3. Microssatélites são repetições curtas em tandem(< de 10
nucleotídeos, geralmente 1 a 5 nucleotídeos), dispersas no genoma e
com alto grau de polimorfismo. São conhecidas também como STRs (do
inglês short tandem repeats), utilizadas como marcadores moleculares
na análise genômica.

ACESSE:
Para entender melhor como aplicar essas técnicas na
citogenética leia a tese Caracterização Genética da
População do Estado de Goiás baseada em Marcadores
STRs Autossômicos e do Cromossomo Y,disponível em:
https://bit.ly/2U4Ru4i
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 21

DNA mitocondrial
O DNA mitocondrial é uma molécula circular de fita dupla, com
16.569 pares de bases, existente no interior das mitocôndrias. A mitocôndria
é formada por uma matriz limitada por duas membranas, uma externa e
outra interna. Esta última apresenta dobramentos para dentro, formando
cristas que aumentam internamente sua superfície total.
No genoma mitocondrial humano e de outros mamíferos
apresenta 13 genes codificadores de proteínas, 22 genes de tRNA e 2
genes de rRNA. Os genes codificadores de proteínas encontram-se
no complexo citocromo-c-oxidase (subunidades 1, 2 e 3) e nas regiões
do citocromo b e das subunidades 6 e 8 do complexo da ATPase. Por
meio de densidade, pode ser diferenciada uma fita simples leve (L) de
uma pesada (H), na qual se encontra a maioria dos genes. Os genes
mitocondriais utilizam um código genético diferente do usado pelos
genes nucleares; em mamíferos, UGA para trp, AUA para met e AGA/
AGG como códon de finalização.

IMPORTANTE:
É importante sinalizar que a taxa de mutação do DNA
mitocondrial é quase 20 vezes maior do que a do DNA
nuclear, isso pode ocorrer devido à grande produção de
radicais livres de oxigênio (mutagênicos). É importante
analisar o DNA mitocondrial porque existe uma gama de
doenças genéticas que são herdadas a partir do DNA
mitocondrial, ou seja da mãe.

Os bilhõess de moléculas do DNAmt de qualquer indivíduo são

geralmente idênticos e de herança materna, pois o espermatozoide
contém escasso citoplasma, com poucas mitocôndrias; portanto, uma
doença causada por mutação no DNAmt é herdada exclusivamente
da mãe, a exemplo temos oftalmoplegia externa progressiva crônica,
síndrome de Kearns-Sayre, neuropatia óptica hereditária de Leber,
síndrome da epilepsia mioclônica com fibras vermelhas esgarçadas
(EMFVE), síndrome da encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e
episódios parecidos com acidentes vasculares (EMALAV), entre outras.
22 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

A severidade de uma doença causada por uma mutação no DNA

mitocondrial depende do tipo de mutação e da proporção entre as
molculas de DNAmt mutado e não mutado em um certo tipo celular.
Por vezes, quando são detectadas mutações no DNA mitocondrial, as
clulas podem conter uma mistura de moléculas de DNAmt selvagem
ou mutado, caracterizando a condição chamada de heteroplasmia.
Cada vez que uma célula de mamífero se divide, moléculas de DNAmt
selvagens ou mutadas vão segregar ao acaso para as células filhas.
Assim, o genótipo em relação ao DNAmt pode se modificar entre
uma divisão celular e outra, e entre uma geração e outra. O acaso pode
fazer com que se estabeleçam linhagens predominantemente portadoras
de DNA mutado ou predominantemente selvagens. Uma vez que todas
as enzimas necessárias para a replicação do DNA mitocondrial são
codificadas pelo DNA nuclear, mutações no DNA mitocondrial em teoria
não afetam sua capacidade de replicação. Ao contrário, foram descritos
casos em que grandes deleções do DNA mitocondrial acarretaram
vantagem replicativa.

ACESSE:
Estude sobre as doenças relacionadas com o DNA
mitocondrial no artigo Análise das Doenças Relacionadas
ao Dna Mitocondrial: Uma Revisão da Literatura. Disponível
em: https://bit.ly/2ZroYir

Replicação do DNA
A replicação do DNA é um processo que ocorre após o processo
de divisão celular. A replicação do DNA ocorre a partir da separação das
duas fitas parenterais, após são produzidas duas novas fitas, tendo as
parentais como molde. Assim, cada nova molécula de DNA contém uma
fita parental e uma fita recém-sintetizada, por isso a replicação do DNA é
dita semiconservativa. Nesse processo estão envolvidas várias proteína
e enzimas que atuam no processo de forma ordenada garantindo
fidelidade.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 23

Figura 6: Replicação semiconservativa do DNA

Fonte: http://bit.ly/2uzlVXL

As regiões de fita simples são feitas com a ajuda das proteínas

de ligação de fita simples (SSB) que protegem essas regiões de sofrer
hidrólise pelas nucleases. Para aliviar a tensão provocada pela torção
da cadeia dupla durante o seu desenrolar pela helicase, a enzima DNA
topoisomerase I se liga com a cadeia parental a montante da helicase. Esta
enzima cataliza quebras transitórias das ligações fosfodiéster em um dos
filamentos fornecendo um eixo de rotação que permite que os segmentos
de DNA em lados opostos da quebra girem independentemente, com o
filamento intacto servindo como eixo. As topoisomerases I são bastantes
eficazes, pois armazenam a energia resultante da clivagem das ligações
fosfodiéster para serem reaproveitadas para recompor o filamento.
As DNA polimerases catalisam a adição de nucleotídeos ao
filamento em crescimento da extremidade 5’ para a 3’. No terminal 5’
do açúcar há um grupo fosfato e no 3’ existe uma hidroxila livre onde
se estabelece a ligação fosfodiéster com o nucleotídeo que está sendo
incorporado. As DNA polimerases, para realizarem o processo de
polimerização, necessitam também dos quatro desoxirribonucleotídeos
trifosfato (dTTP, dATP, dGTP e dCTP) e de Mg2+.
A DNA polimerase III é um complexo enzimático com 10
subunidades responsável pela polimerização 5’→3’ da fita de DNA
recém-formada. Esta holoenzima apresenta, ainda, a atividade 3’→5’
exonucleásica que permite que nucleotídeos incorretos adicionados
24 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

sejam prontamente removidos, um por vez, durante a replicação

e substituídos por nucleotídeos corretos, mecanismo de revisão e
reparo. A DNA polimerase I tem a função de reparar e remendar o DNA
danificado e para tanto apresenta as atividades; polimerásica 5’→3’ e
exonucleásica 3’→5’ e 5’→3’, esta última permite que vários nucleotídeos
sejam removidos durante o reparo.
Durante o processo de replicação do DNA, uma das fitas novas é
formada continuamente na direção 5’→3’ (fita líder) e a outra de maneira
descontínua e no sentido inverso para manter a mesma direção 5’→3’
(fita retardatária). A fita descontínua é replicada através de fragmentos
de Okasaki (1000 a 2000 nucleotídeos). Cada um desses fragmentos
apresenta, além do DNA recém sintetizado, um RNA iniciador que será
substituído por desoxirribonucleotídeos pela DNA polimerase I e a DNA
ligase reconstituirá a nova fita. O filamento líder possui apenas um RNA
iniciador que também será substituído pela DNA polimerase I.

RESUMINDO:
O DNA é uma molécula responsável por armazenar e
transmitir as informações genéticas. Além disso, O DNA é
o molde da molécula do RNA. Assim, o DNA coordena a
síntese do RNA e o RNA comanda a síntese de proteínas. A
replicação do DNA é semiconservativa. Cada fita na dupla
hélice atua como modelo para a síntese de uma nova fita
complementar. As enzimas responsáveis pelo processo de
replicação são: DNA polimerases, que necessitam de um
molde e um primer (iniciador) e sintetizam DNA na direção
5’ para 3’. E além dessas enzimas, são importantes a DNA
polimerase, incluindo DNA primase, DNA helicase, DNA
ligase, e topoisomerase. Existem tipos de DNA como o
TANDEM e o mitoxondrial. O DNA TANDEM são repetições
de sequênciais de DNA não codificadoras, que podem
estar concentradas em locais restritos ou muito dispersas
no genoma e podem ser subdivididos em DNA satélite,
microssatélite e microssatélites. E, o DNA mitocondrial está
presente nas mitocôndrias, e é passado maioritariamente
de mãe para filho na grande maioria dos organismos
multicelulares, por isso as doenças mitocôndrias são
herança materna.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 25

Ciclo celular
A divisão celular ocorre a partir de uma sequência de eventos na
qual o crescimento da célula ocorre pela replicação de todos os seus
componentes, com a posterior divisão em duas células‐filhas.
O ciclo celular é composto por três fases: intérfase, nessa fase
ocorre o crescimento da célula bem como o reparo para a próxima fase.
Fase mitótica, também conhecida como a fase M ocorre a separação dos
cromossomos da célula mãe e a citocinese, na qual ocorre o rompimento
das membranas plasmáticas e a finalização do processo celular, dando
origem a duas células-filhas. Nessas fases são avaliados os erros nos
processos que podem levar à célula ao processo de apoptose ou no
desenvolvimento de células tumorais.
A célula passa a maior parte do tempo em intérfase, mas através
de sinais químicos externos (hormônios e fatores de crescimento) ou
internos (ciclinas e quinases – CDKs), a célula é sinalizada para entrar em
divisão. Estes sinais que controlam o ciclo provêm de fora para dentro da
célula, pois os fatores de crescimento liberados ligam-se aos receptores
de membrana das células-alvo e estes vão estimular a produção
de sinalizadores intracelulares, ativando a cascata de fosforilação
intracelular e induzindo a expressão de genes que são essenciais para
o controle do ciclo celular (composto por CDKs e ciclinas, descritas em
detalhe no capítulo de controle do ciclo celular).
O tempo médio para a divisão celular depende de fatores
relacionados com a célula e com as condições fisiológicas como
idade celular, disponibilidade de hormônios, fatores de crescimento,
temperatura, pressão osmótica, pressão hisdrostática e pressão do
oxigênio externo e o ritmo circadiano. A interfase é a fase mais longa do
ciclo celular. Está dividida em três fases: G1,S e G2.
A fase G1 é caracterizada pela intensa produção de síntese
enzimática, já na fase S se caracteriza a duplicação do material genético,
bem como peloaumento da quantidade DNA, o que favorece que cada
cromossomo apresente uma cromátide irmã. Também na fase S, se
inicia a duplicação dos centrossomas e o início dos movimentos para
os polos da célula. Já na fase G2 ocorre uma síntese de proteínas e um
rápido crescimento celular, o que prepara a células para a fase mitótica.
26 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

O deslocamento dos centrossomas ocorre através de dineínas e

cinesinas. As cinesinas são motores protéicos que tem a capacidade de
locomoção usando os microtúbulos e a dineína é uma proteína motora
responsável pelos deslocamentos de organelas no citoplasma. Logo
após a duplicação, os centrossomas começam a produção dos fusos
astrais. Esses se juntam com as dineínas e promovem o deslocamento
do centrossoma para os polos. Após se associam com as cinesinas
para auxiliar no deslocamento.Quando o centrossoma já estiver em sua
devida posição, o fuso astral se liga com cinesina fazendo uma força
contrária à tendência de movimento, fazendo com que o centrossoma
pare em determinada posição). No estágio G0 a célula entra num estágio
de repouso e não entra em processo de divisão celular.
Figura 07: Fases da mitose e meiose da célula

Fonte: http://bit.ly/2R03KlE

Na pesquisa, é utilizado a PHA (Fitohemaglutinina ) é um mitógeno

utilizado para estimular os linfócitos T para o cariótipo constitucional. A
fitohemaglutinina (PHA) é derivada de extratos de sementes de Phaseolus
vulgaris. Trata-se de uma glicoproteína que se liga às membranas das células
e altera suas propriedades. A PHA altera a permeabilidade da membrana,
levando a uma captação molecular aumentada, que, em retorno, ativa a
síntese macromolecular, levando a célula a entrar no ciclo celular.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 27

RESUMINDO:
Nas células eucarióticas, ou células com núcleo, os estágios
do ciclo celular são divididos em duas fases principais:
interfase e a fase mitótica (M). Durante a interfase, a célula
cresce e faz uma cópia de seu DNA e durante a fase
mitótica (M), a célula separa seu DNA em dois conjuntos e
divide seu citoplasma, formando duas novas células. Para
que a divisão seja iniciada, três etapas são fundamentais:
fase G1 onde ocorre o crescimento celular com intensa
produção enzimática, na fase S ocorre duplicação do
material genético e aumento do DNA e duplicação dos
centrossomas, nesse momento ocorre a mudança dos
centrossomas para os pólos da célula e na fase G2 ocorre
uma intensa síntese enzimática, crescimento celular e
preparação para a fase mitótica.

Reguladores do ciclo celular

O sistema controle do ciclo celular ativa as enzimas e proteínas
responsáveis por checar todo o processo de divisão do ciclo celular.
Esse processo é importante porque assegura que cada estágio do ciclo
termine antes de iniciar o próximo: deve haver certeza, por exemplo, que
a replicação do DNA foi completada somente uma vez antes do início
da mitose, que a mitose tenha terminado antes da divisão da célula em
duas e que outro processo de replicação do DNA não ocorra até que a
célula tenha sofrido mitose e atingido um tamanho apropriado.
As proteínas quinases dependentes de ciclinas (Cdks) são
responsáveis por impulsionar os eventos do ciclo celular nas células
eucarióticas, além de determinar o tempo em que cada um deve ocorrer.
Além disso, atuam coordenando os eventos do ciclo celular em face da
mudança ambiental ou de falha mecânica. Cada ciclina está associada a
uma determinada fase, transição, ou conjunto de fases no ciclo celular e
ajuda a conduzir os eventos dessa fase ou período.
28 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Figura 8: As ciclinas no ciclo celular

Fonte: http://bit.ly/37UBJD2

Para que a ativação das CDK ocorra são necessários dois eventos.
O primeiro evento é a ligação com uma molécula reguladora positiva,
a ciclina;20, 21 e o segundo, a fosforilação de um resíduo de treonina
(Thr160 em CDK2) localizado na alça conhecida como segmento de
ativação.
O ciclo celular é composta das fases G1 (intervalo, gap 1), fase
em que a célula se prepara para síntese do DNA; s (síntese), estágio
no qual o DNA é replicado; G2 (gap 2), fase na qual a célula se prepara
para a mitose; m (mitótica), fase onde a célula passa por diversas
transformações que resultam na divisão do núcleo (mitose) e divisão do
citoplasma, ou seja, a formação de duas células filhas (citocinese).
A CDK4/ciclina (Cyc)D e CDK6/CycD são responsáveis pela
progressão na fase G1 enquanto que a CDK2/CycE é necessária para
a progressão da fase G a S; CDK2/CycA para a transição de S; a CDK1/
CycB é responsável para a transição G /M. (ver figura 08).
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 29

Figura 9: Ciclinas e sua dinâmica no ciclo celular

Fonte: http://bit.ly/309WBna

Para o progresso do ciclo célula é necessário que uma ciclina ative

ou desative proteínas alvo dentro da célula. Os eventos subsequentes são
realizados associando-se a uma família de enzimas chamada quinases
dependentes de ciclinas (Cdks). A enzima Cdk sozinha fica inativa, porém
a ligação com uma ciclina a ativa, tornando-a uma enzima funcional e
permitindo que ela modifique proteínas alvo dentro da célula.
As CDks são quinases, enzimas que fosforilam, ou seja, ligam gupos
fosfatos a proteínas alvo específicas. Uma vez ligados, o grupo fosfato
torna a proteína alvo mais ou menos ativa. Quando ocorre a ligação da
ciclina com uma CdK há a ativação da CdK como uma quinase e ocorre o
direcionamento da CdK para proteínas alvo. A exemplo temos as Ciclinas
G start subscript, 1, end subscript/S enviam Cdks para alvos da fase S
(promovendo, por ex., a replicação do DNA ), enquanto ciclinas M enviam
Cdks para alvos da fase M (fazendo a membrana nuclear se romper).
Fatores de crescimento são responsáveis por aumentar a atividade
de Cdks e ciclinas, enquanto danos ao DNA levam a uma diminuição ou
bloqueio da atividade enzimática. Os danos ao DNA podem acontecer
por fatores exógenos como a exposição aos raios ultravioletas. Por isso,
existe uma proteína chamada de P53 que é responsável por checar e
impedir que o dano seja levado adiante no ciclo celular.
30 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Fatores como genética, interação da P53 com proteínas virais e

interação da P53 com outras proteínas do ciclo celular podem induzir uma
perda de função dessa proteína. As mutações genéticas podem ser do
tipo mutação pontual. (Missense), deleção gênica (Non Sense) de um ou
dois alelos do gene p53 e inserção de nucleotídeos na sequência de DNA.
Essas mutações podem ocorrer entre os códons 120 e 290, situados entre
os éxons 5 e 9, que são considerados sítios quentes (hot spots) de mutação,
e por isso podem resultar na transcrição de uma proteína não funcional. A
deleção gênica pode gerar uma transcrição de códon de parada prematuro
da proteína. Nesses casos uma mutação no gene P53, quer seja pontual ou
não, pode alterar de forma relevante a função dessa proteína levando ao
estado de incapacidade da parada do ciclo celular e disparo de mecanismo
de apoptose. Uma das formas de avaliar a mutação da P53 é utilizar a
citometria de fluxo como ferramenta diagnóstica ou a imunohistoquímica,
uma vez que essa técnica permite identificar as células tumorais.

RESUMINDO:
O ponto de checagem ocorrem nos diversos estágios do
ciclo célula e tem como principal objetivo identificar erros
e reparar os mesmos, entretanto, quando esse erro não
pode ser corrigido a célula pode entrar em apoptose. Os
pontos de checagem ocorrem nos pontos G1 em transição
para a fase S, na transição da G2 para M e na transição da
metáfse para anáfase. As proteínas quinases dependentes
de ciclinas (Cdks) são responsáveis por impulsionar os
eventos do ciclo celular nas células eucarióticas, além de
determinar o tempo em que cada um deve ocorrer. O ciclo
celular passa pelas fases G0, G1, S, G2 e M para completar
a divisão celular. A progressão é regulada pela expressão
e ativação das proteínas do ciclo celular, incluindo ciclinas,
CDKs e CDIs. O ciclo celular se inicia pela elevação da ciclina
D, que interage com as CDK4 e CDK6 formando o complexo
ciclina D- CDK4/6 que age fosforilando a Rb e liberando a
E2F, evento que ativa a transcrição do DNA. A progressão
do ciclo celular pode ser bloqueada pela ação de inibidores
endógenos, membros das CDIs, e por alguns bloqueadores
exógenos, que atuam em diferentes pontos do ciclo celular.
Além dessas, ainda há a p53 que é responsável por checar e
impedir que o dano seja levado adiante no ciclo celular.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 31

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