NÚCLEO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
BIOLOGIA MOLECULAR BÁSICA Profa. Rubiani de Cassia Pagotto

Duplicação do DNA in vivo e in vitro: Estudo Dirigido

ATENÇÃO!!! Se você ainda não sabe a composição química do DNA, sua estrutura
molecular e as principais características de genomas procariotos e eucariotos, antes
de prosseguir faça uma revisão destes temas. É indispensável para o entendimento
correto dos próximos conteúdos!

Abaixo você será solicitado a responder um questionário, sendo as questões

dispostas em ordem crescente de dificuldade e conhecimento do tema : Duplicação do
DNA in vivo e in vivo.
Inicialmente você deve realizar a leitura do texto disponibilizado (Valadares, 2011,
cap. 6, páginas 1 a 16), para ter uma primeira noção básica do mecanismo de duplicação
(ou replicação) do DNA in vivo.
Após esta primeira leitura, solicita-se que o discente utilize as informações
disponíveis nos livros indicados na bibliografia para responder as questões:

Introdução:
1) Explique brevemente o que é a duplicação do DNA e sua importância para os organismos.

A replicação da molécula de DNA, também conhecida por duplicação ou polimerização, é um

fenômeno genético que assegura a autoduplicação das informações contidas nos cromossomos,
especificamente nos genes. Esse processo ocorre durante a fase “S” da interfase (fase do ciclo
celular que repara a célula para entrar em divisão), sendo necessário para a manutenção
orgânica do indivíduo, permitindo o desenvolvimento do organismo (crescimento), a reposição
de tecidos lesionados (epitelial) ou regeneração quando possível, bem como a propagação
hereditária das características, propiciando a formação de gametas contendo as informações
fidedignas da espécie. Para o acontecimento desse processo são indispensáveis alguns evenos
envolvendo o filamento da molécula de dna. Inicialmente o filamento da molécula molde
(molécula mãe), tem sua dupla fita (cadeia polinucleotídica: grupamento fosfórico, pentose
desoxirribose e base nitrogenada) separa devido o rompimento das pontes de hidrogênio,
mantidas entre as bases nitrogenadas complementares. Importante pois, por meio da
replicação podemos entender como nós, seres humanos, fomos formados a partir de sucessivas
divisões de uma céluila, fruto da fecundação (célula ovo ou zigoto), passando por intensa
multiplicação até resultar em um organismo tão complexo.

Duplicação do DNA in vivo:

2) Explique resumidamente o que são as origens de replicação e no que se diferenciam em
procariotos e eucaritos.

Para que o DNA de fita dupla atue durante a replicação, as duas fitas pareadas devem ser
separadas, ou desnaturadas, para tornar as bases disponíveis ao pareamento com as bases dos
dNTPs que são polimerizados nas novas fitas-filhas recém-sintetizadas. As origens de
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replicação são compostas por sequências de DNA que atraem as proteínas iniciadoras e são
segmentos de DNA particularmente fáceis de separar. Nesse contexto, sabemos que o par de
bases A – A é unido por menos pontes de hidrogênio do que o par G-C. Portanto, um
segmento de DNA rico em pares de bases A-T é relativamente mais fácil de ser separado e,
com isso, esses pares são normalmente encontrados nas origens de replicação. Em
procariotos a replicação ocorre entre as divisões celulares, enquanto que nos eucariotos
ocorre na fase S da interfase

3) Quais são as fases da replicação do DNA e quais eventos ocorrem em cada uma delas?

Iniciação, alongamento e terminação. A iniciação é considerada a única fase regulada da

replicação do DNA, e visa assegurar que o DNA seja replicado somente uma vez por ciclo
celular. Como o próprio nome diz, essa fase corresponde ao início da replicação do DNA, na
qual as enzimas helicases agem separando a dupla fita de DNA. Seguida a essa etapa, incia a
fase de alongamento, a qual corresponde À síntese das fitas líder e tardia propriamente dita.

4) Descreva o processo de replicação do DNA in vivo, incluindo as principais enzimas

envolvidas e a sequência geral de eventos.

A replicação do DNA ocorre na interfase e precisa ser fiel e precisa para garantir a
estabilidade. Além dessas duas qualidades, ela percisa ser ultra rápida porque a quantidade de
material genético a ser replicado é imensa e as células que se modificam rapidamente, tem
que se multiplicar rapidamente também. É a estrutura do DNA que carrega a informação
necessária para perpetuar a espécie. A sequência de fatos que ocorrem durante a replicação:
Primeiramente ocorre a separação das fitas de DNA (desfaz a hélice) no sentido 5’-3’ pela
enzima DNA Helicase. Ocorre então a síntese de uma nova fita e esta sempre se dá no sentido
5’-3’. Logo vem a principal enzima da replicação: DNA Polimerase. A DNA Polimerase é
capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a partir de uma fita molde e agrega nucleotídeos na
extremidade 3’ da fita de DNA. Na verdade não é só uma enzima que participa de replicação,
é um grupo de enzimas.

5) Quais são os principais mecanismos de correção de erros durante a replicação do DNA in

vivo?
A enzima exonuclease é responsável por remover os primers das fitas originais após a
formação de fitas contínuas e descontínuas. Para evitar erros de sequenciamento uma revisão
e, se necessário, uma correção é realizada por outra exonuclease. A enzima DNA ligase faz
com os fragmentos de DNA sejam unidos e o DNA sequenciado em duas fitas contínuas.

6) Aponte algumas diferenças entre a replicação em procariotos e eucariotos.

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A principal diferença entre procariotos e eucariotos está na origem de replicação, que nos
cromossomos circulares procariotos é único do qual partem duas forquilhas que formam uma
única bolha de replicação que avança em ambors os sentidos até se encontrarem no lado
contrário, formando duas moléculas-filhas mas nos cromossomos eucarióticos são míultiplos,
que formam diversas bolhas, avançam e se fundem de modo a também formar duas moléculas-
filhas.

Duplicação do DNA in vitro:

7) Explique o que significa a duplicação do DNA in vitro e porque esse processo é útil em
pesquisas e tecnologias.

O PCR consiste em amplificar cópias de DNA “in vitro”, usando elementos básicos do
processo de replicação natural do DNA. É o método para rápida amplificação de sequências
específicas de DNA. A localização da sequência alvo é feita pelos iniciadores, que são
oligonucleotídeos com 20-24 bases usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítico
único em um genoma de alta complexidade. Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a
partir dos iniciadores serve como molde para a síntese de uma nova fita, isso garante o
aumento exponencial do número de novas fitas. Por permitir a obtenção de grandes
quantidades de cópias do DNA de genes de interesse, a PCR se tornou uma técnica de grande
importância em diferentes áreas. Por exemplo, a PCR permite o diagnóstico de doenças
genéticas, o diagnóstico rápido de patógenos de difícil cultivo, como a bacteria Mycobacterium
tuberculosis, ou mesmo o acompanhamento da carga viral em pacientes com vírus de
imunodeficiência (HIV) e da hepatite do tipo C (HCV).
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8) Quais são os principais componentes necessários para realizar a replicação do DNA in

vitro?

Primeiramente, adicionam-se todos os reagentes a uma máquina chamada termociclador. Eles

são primers, taq DNA polimerase, MgCl2 (estimulam a taq DNA polimerase), tampão
(mantém pH ótimo para enzima), água, DNA molde e dNTPs. Depois, são seguidas estas
etapas: 1- “Melting” ou desnaturação: consiste na separação da dupla fita do DNA
amplificado; 2- “Annealing” ou anelamento ou hibridização: ligação do iniciador ou “primer”
ao DNA a ser amplificado; 3- “Extension” ou extensão: polimerização propriamente dita.

9) Cite exemplos de aplicações práticas da replicação do DNA in vitro em técnicas

laboratoriais.
A técnica PCR é muito usada na eletroforese em gel agaroso, em que auxilia na detecção e
subtipagem viral, detecção de mutação e polimorfismo genético, identificação de pessoas,
entre outros.

Comparação entre a replicação in vivo e in vitro:

10) Liste as principais semelhanças e diferenças entre a duplicação do DNA in vivo e in vitro.
In vivo, realizada em céluas vivas, DNA doador na maioria das vezes é um genoma inteiro, O
DNA genômico precisa ser cortado, primers de RNA sintetizados pela RNA primase, DNA
polimerase opera em temperatura fisiológica, DNA duples é aberto pela enzima helicase.
In vitro, realizada em tubo de ensaio, DNA alvo é um gene específico ou uma região do
DNA, o DNA genômico não precisa ser cortado, primers de DNA, taq polimerase opera em
altas temperaturas, DNA duplex é desnaturado usando calor.

11) Quais são os principais desafios enfrentados na replicação do DNA in vitro em

comparação com a replicação in vivo.

A necessidade de replicar todo o DNA eucariótico apenas durante a fase S do ciclo celular
representa um desafio. Por isso, os eucariontes possuem muitas origens de replicação.
Estima-se que as origens de replicação estão localizadas a uma distância de 30 kb, portanto,
um cromossomo eucariótico pequeno tem mais de 10 origens e um cromossomo grande tem
milhares delas. Então, uma diferença importante entre os mecanismos de replicação de
procariontes e eucariontes refere-se à quantidade e à natureza das origens de replicação.
Enquanto as bactérias apresentam apenas uma origem de replicação em seu cromossomo, a
replicação de uma molécula de DNA eucariótico inicia-se em diversos sítios. A existência
de múltiplos sítios de origem de replicação é fundamental para que as enormes moléculas
de DNA dos eucariontes se repliquem em períodos de tempos curtos, compatíveis com a
duração do ciclo celular. Em certos casos, como durante a fase embrionária, existem tantas
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origens que o maior conjunto gênico eucariótico pode ser replicado em menos de 1 hora.

Métodos de estudo da duplicação do DNA:

12) Além da replicação in vivo e in vitro, quais são outras abordagens utilizadas para estudar
a duplicação do DNA?

Replicação dispersiva, no modelo dispersivo, a replicação do DNA resulta em duas moléculas

de DNA que são misturas, ou “híbridas”, de DNA parental e da molécula filha. Nesse modelo,
cada fita individual é uma colcha de retalhsos do DNA e do original. Na replicação dispersiva,
todas as moléculas deveriam ter pedaçoes do velho e do novo DNA, tornando-se impossível
conseguir uma molécula “puramento leve”. Se o modelo dispersivo estivesse certo: Ele
prediz que cada molécula de DNA replicada seria um mosaico de DNA paterno (da geração
anterior) e DNA filial (recém-sintetizado durante a replicação). Mecanicamente, é como se o
DNA antigo e o novo fossem despedaçados e misturados durante a replicação, e depois
remontados formando as hélices. Assim, no modelo dispersivo, cada rodada de replicação
produziria moléculas mescladas com partes pesadas e leves. O mosaico de DNA conteria
frações maiores de 14N a cada replicação sucessiva, portanto a densidade do DNA diminuiria
gradualmente ao longo do tempo, resultando em uma faixa (faixa ou borra difusa) que se
moveria para cima a cada geração.

13) Explique brevemente como a técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase) pode ser
utilizada para amplificar regiões específicas do DNA.
PCR Convencional, consiste na replicação de sequências específicas de DNA utilizando
equipamentos termocicladores. Para realizar a reação acrescentam-se às amostras de material
genético sequências iniciadoras complementares (também conhecidas como primers)
desoxirribonucleotídeos e DNA-polimerase termo resistente. Através da variação cíclica de
temperaturas realizada pelo termocilcador ocorre a desnaturação das fitas complementares de
DNA, o anelamento de primers com suas regiões específicas de cada fita e a replicação do
fragmento pela enzima DNA-polimerase. Após realizar um determinado número de ciclos,
obtém-se milhares de cópias da sequência gênica de interesse.

14) Explique brevemente como a técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase) pode ser
utilizada para amplificar sequencias de DNA em espécies novas ou pouco estudadas (não
há conhecimento prévio de suas sequências).

15) Faça um quadro resumindo as principais variações da técnica de PCR e suas aplicações,
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vantagens e desvantagens.

É uma potente técnica central da biologia molecular que é um método in vitro

eficaz e rápido para amplificação enzimática de sequências específicas de
DNA ou RNA de várias fontes. A PCR padrão consiste no DNA-alvo, um
conjunto de primers de oligonucleotídeos sintéticos que se posicionam ao
lado da sequência do DNA-alvo, uma DNA polimerase termoestável
PCR (geralmente Taq polimerase) e nucleotídeos. Com o uso de termocicladores,
há três fases durante cada ciclo de amplificação, incluindo a desnaturação do
DNA dupla-fita em DNA de fitas simples separadas, hibridização de primers
à sequência do DNA-alvo e amplificação, em que a DNA polimerase amplia o
DNA a partir dos primers, criando um novo dsDNA com a fita antiga e uma
nova. As fitas sintetizadas em um ciclo servem de molde para o próximo,
resultando em um aumento de milhões de vezes de DNA em apenas 20 ciclos.

É uma variação da técnica de PCR padrão que envolve a amplificação de

mRNA específico obtido de amostras muito pequenas. Ela elimina a
necessidade do entediante processo de purificação de mRNA necessário para
as técnicas de clonagem convencionais. Com RT-PCR, usa-se transcriptase
reversa e uma amostra de RNA, além dos reagentes de PCR padrão. A mistura
RT- de reação é aquecida a 37° C, o que permite a produção de cópias
PCR complementares de cDNA a partir da amostra de RNA pela transcriptase
reversa. Em seguida, esse cDNA é hibridizado a um dos primers, levando à
síntese da primeira fita. A partir desse ponto, segue-se a PCR padrão, em que
o dsDNA é, por fim, gerado. Frequentemente a RT-PCR é combinada com
PCR em tempo real (qPCR), que é amplamente usada para a quantificação de
níveis de transcritos em células e tecidos

PCR É uma tecnologia que inibe a Taq polimerase ghot start ou a incorporação de
HOT dNTPs modificados durante o preparo da reação até a ocorrência de uma
START etapa de termoativação. Vários métodos estão disponíveis para interromper a
atividade da polimerase hot star e incluem métodos de modificação química,
métodos mediados por anticorpos e mediados por aptâmeros.

PCR É frequentemente usada para detectar a presença de alvos e a abundância

END- relativa no final da reação. O comprimento restrito de sequências produzidas
POINT durante a PCR padrão, aproximadamente 5 kb, é superado em parte com a
incorporação de fatores adicionais que oferecem uma atividade de “revisão”.
A PCR de alta-fidelidade e longo alcance (LA) incorpora o uso de uma
segunda polimerase termoestável com exonuclease 3’ 5’ para reparar as
incorporações errôneas de nucleotídeos terminais, resultando em uma
fidelidade significativamente aumentada e a capacidade de amplificar alvos de
DNA de até 40 kb.

Questões adicionais:
16) Como a replicação do DNA está relacionada à hereditariedade e à evolução dos
organismos?
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17) Em casos de doenças genéticas, como mutações na replicação do DNA podem levar a
problemas de saúde?

18) Pesquise e mencione uma descoberta científica relevante relacionada à duplicação do

DNA que tenha contribuído para avanços na área da Biologia Molecular.

Considerações finais:
19) Conclua o estudo dirigido resumindo (quadro ou mapa mental) a as principais
características da duplicação do DNA in vivo e in vitro e a importância destes
conhecimentos para a Biologia Molecular e para o avanço da ciência em geral.

A replicação do DNA ou duplicação do DNA é um processo de grande importância para a

transmissão do material genético, pois, quando ocorre a divisão celular, esse material será
dividido de forma igual entre as células-filhas. A replicação ocorre antes do início da divisão
celular, durante a fase S da interfase.
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Bibliografia recomendada:

Mazzon, R.R. Reação de Amplificação em Cadeia. In Marques, Marilis do Valle; Baldini, Regina
Lúcia; Galhardo, Rodrigo da Silva; Pereira;Tiago Campos (editores) Métodos de Bioquímica e
Biologia Molecular - Fundamentos e Aplicações. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de
Genética, 2020. 373 p. (este livro pode ser adquirido gratuitamente pelo site da Editora da SBG:
https://sbg.org.br/buyebook&id=20 ).

Oliveira, MTS et al. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de

amplificação de dna por meio da técnica de reação em cadeia. São Carolos. EMBRAPA
Pecuária Sudeste. 2007. Acesso gratuito:
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf

Valadares, BLB. Capitulo 6. Replicação do DNA e transcrição. In Valadares, B.L.B.;

Araújo, E.D.; Pantaleão, S.M. (ed). Genética Básica. São Cristovão. Universidade Federal
de Sergipe. CESAD. 2011.

Zaha, Ferreira e Passaglia. Biologia molecular básica 5. ed. Porto Alegre : Artmed, 2014.

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https://youtu.be/iQsu3Kz9NYo