Biotecnologia Aplicada

à Biomedicina
Biotecnologia Diagnóstica

Responsável pelo Conteúdo:

Prof. Dr. Fabio Mitsuo Lima

Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Selma Aparecida Cesarin
 Biotecnologia Diagnóstica

• Introdução;
• Como Visualizar o Resultado da Reação de PCR;
• Como Podemos Saber o Tamanho das Bandas;
• Aplicações da PCR;
• Variantes da Técnica de PCR;
• PCR em Tempo Real;
• Proteômica no Diagnóstico de Agentes Patogênicos.

OBJETIVOS DE APRENDIZADO
• Apresentar ao aluno as ferramentas biotecnológicas mais relevantes e eficientes emprega-
das para o diagnóstico de doenças;
• Evidenciar os conceitos chaves da Biotecnologia que embasam os métodos diagnósticos uti-
lizados atualmente.
UNIDADE Biotecnologia Diagnóstica

Introdução
Nesta Unidade, estudaremos uma das aplicações mais importantes da Biotecnolo-
gia: o diagnóstico de doenças genéticas, neoplásicas e infecciosas.

Espero que aproveite ao máximo este material.

A partir do conhecimento da estrutura do DNA, abriu-se a possibilidade de estu-

dar a molécula de forma mais profunda e, logo, diversos pesquisadores se ocuparam
da tarefa de tentar manipulá-la em Laboratório.

Uma das primeiras técnicas desenvolvidas, e hoje uma das mais utilizadas, é a
chamada Reação em Cadeia da Polimerase, cuja sigla é PCR (do inglês Polymerase
Chain Reaction).

A PCR consiste na multiplicação de um fragmento de DNA, em um tudo de en-

saio, mimetizando o processo de replicação que ocorre em nossas células durante a
fase S do ciclo celular.

Nas células, diversas enzimas e outras proteínas participam do processo, tais

como: proteínas SSB, helicase, primase, topoisomerase, ligase e DNA polimerase,
dentre outras. Entretanto, na replicação in vitro, como é o caso da PCR, necessita-se
apenas da DNA polimerase.

Como o nome sugere, essa enzima é responsável por polimerizar a nova ca-
deia de DNA adicionando nucleotídeos livres à cadeia nascente. Esse processo
é semiconservativo, o que significa que a dupla fita de DNA se separa e cada
fita serve como molde para a síntese de uma nova fita de DNA complementar
à fita original.

Após a ação da DNA polimerase, tem-se duas moléculas de DNA, sendo que cada
uma possui uma fita original e uma fita nova. Essa conclusão foi obtida a partir do
experimento clássico dos cientistas Matthew Meselson e Franklin Stahl, utilizando o
isótopo pesado do nitrogênio (15N) em meio de cultura para bactérias E. coli.

Com isso, os pesquisadores refutaram, definitivamente, outras duas hipóteses que

existiam na época, chamadas de hipótese conservativa e hipótese dispersiva.

Na hipótese conservativa, uma molécula de DNA resultante da replicação seria

composta pelas duas fitas originais e a outra molécula seria composta por fitas to-
talmente novas (mas, também idênticas à molécula original em relação à sequência
de DNA).

Na hipótese dispersiva, as moléculas de DNA resultantes da replicação seriam

misturas aleatórias das fitas parentais, sendo que cada molécula de DNA seria um
mosaico composto por fragmentos de origens distintas.

Veja a figura a seguir, que ilustra essa questão.

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 Figura 1 – Possíveis mecanismos da replicação do DNA propostos por diversos autores antes
da comprovação por Meselson e Stahl de que a replicação acontece de forma semiconservativa
Fonte: Adaptado de WATSON, 2015, p. 31.

Leia mais detalhes do experimento de Meselson e Stahl acessando o link,

disponível em: https://bit.ly/2V3NuCh

Mimetizando o que ocorre dentro da célula, na reação de PCR ocorre a denatura-

ção do DNA, anelamento de primers e polimerização da nova fita.

Novas fitas de DNA são formadas in vitro pela sucessão de múltiplos ciclos, em
geral de 20 a 40, dependendo do interesse do investigador.

Cada ciclo da PCR é dividido em três etapas distintas, variando entre si em tempo
e temperatura (Figura 2):
• A primeira etapa, chamada de desnaturação, compreende a elevação da tempe-
ratura a 95°C por cerca de 20 segundos. A alta temperatura quebra as pontes
de hidrogênio que ligam as bases nitrogenadas e, consequentemente, separa a
dupla fita de DNA em duas fitas simples (Figura 2A);
• A etapa seguinte é chamada de etapa de alinhamento dos primers (Figura 2B).
A temperatura é reduzida para permitir que os primers anelem na sequência
molde previamente desnaturada e forme uma região de dupla fita. O anelamen-
to se dá pela complementariedade de bases entre o primer e a sequência molde,
obedecendo a Regra de Chargaff, ou seja, Adenina pareando com Timina e
Citosina pareando com Guanina;

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• Após o anelamento, eleva-se novamente a temperatura, agora para 72°C, que é a

temperatura ótima para a enzima Taq DNA polimerase incorporar os nucleotíde-
os livres à nova cadeia (Figura 2C). A essa etapa, dá-se o nome de Amplificação:

Figura 2 – As etapas da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Fonte: adaptado de Khan Academy

Com o fim dessa etapa, encerra-se o primeiro ciclo da PCR. As moléculas presen-
tes no tubo servirão como molde para o segundo ciclo, no qual haverá a repetição
das etapas de desnaturação, alinhamento dos primers e amplificação.

As moléculas presentes no tubo após a finalização do segundo ciclo servirão de

molde para o terceiro, e assim sucessivamente.

Como citado acima, a reação completa ocorre entre 20 e 40 ciclos, o que pode
ser finalizado em até três horas. A cada ciclo, ocorre um aumento exponencial no
número de novas moléculas de DNA.

Para melhor visualização desse processo, assista ao vídeo “Aula PCR e animação 3D”,
disponível em: https://youtu.be/ViCYwjzBZGs

Para entendermos o poder de amplificação dessa técnica, temos que compreen-

der que, a partir de uma única cópia de DNA molde, obtém-se, após 30 ciclos, mais
de 1 bilhão de cópias da sequência alvo.

Em geral, para a maioria das amostras biológicas, iniciamos a reação com muito
mais do que uma única cópia.

Assim, a técnica de PCR pode ser utilizada para diversas aplicações, tais como
o diagnóstico molecular de agentes patogênicos, identificação de mutações em do-
enças genéticas e neoplásicas, isolamento de genes para o Processo de Clonagem,
Medicina Forense e Sexagem Fetal, dentre outras.

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Teste seu conhecimento
1. O que significa a sigla PCR?
2. O que é e como ocorre a reação de PCR?
3. A técnica de PCR mimetiza qual processo, que ocorre normalmente na célula?
4. DESAFIO: considerando a técnica de PCR como um todo, explique por
que, entre as enzimas que participam do processo de replicação, apenas
a DNA polimerase é utilizada na reação de PCR?
5. Explique por que a replicação de DNA é semiconservativa? Como Meselson
e Stahl chegaram a essa conclusão? (dica: leia o Material Complementar)
6. Quais foram as outras duas hipóteses refutadas pelo experimento de
Meselson e Stahl? Explique;
7. Quais são as etapas da reação de PCR? Explique cada passo. (dica: faça
um Mapa Mental desenhando o que ocorre em cada etapa, para facilitar
a fixação do conteúdo e aprendizado);
8. Explique como ocorre a progressão exponencial do número de molécu-
las de DNA durante a técnica de PCR.

Como Visualizar o Resultado da Reação de PCR

Para visualizar o resultado da amplificação, é necessário realizar uma eletroforese
em gel de agarose.

Essa técnica consiste na separação de moléculas de DNA em uma matriz inerte,

formada pela polimerização da agarose, por meio de um campo elétrico.

A agarose é um polissacarídeo extraído de algas. No Laboratório, apresenta-se na

forma de pó que, ao ser hidratado, aquecido até a fervura e resfriado, forma um gel
semelhante à gelatina comestível.

Por ação desse campo elétrico, as moléculas de DNA, que são negativas devido
à presença de fosfato em sua cadeia, são “puxadas” em direção ao polo positivo da
cuba de eletroforese.

Como o gel de agarose forma uma espécie de rede, essa separação se dá por ta-
manho das moléculas. Em outras palavras, moléculas grandes migram menos no gel,
por terem mais dificuldade em migrar por entre a malha da agarose. Já moléculas
pequenas, migram mais.

Em um gel de agarose, onde se localizam as moléculas maiores e as menores?

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Como as moléculas menores conseguem migrar mais facilmente, conseguem se

deslocar da região superior onde está o poço para a parte inferior do gel.
Já as moléculas maiores ficam retidas na região superior do gel. Todas as molécu-
las de mesmo tamanho migram exatamente na mesma região, formando uma banda
que pode ser visualizada após coloração com corante chamado brometo de etídeo.

Como Podemos Saber

o Tamanho das Bandas
O tamanho das bandas é medido em número de pares de base da molécula de
DNA e pode ser medido por comparação com padrões conhecidos de DNA.
Esses padrões são como “escadas de DNA”, em que cada degrau possui uma
quantidade conhecida de pares de bases. Dessa forma, basta que o pesquisador com-
pare os tamanhos das bandas geradas pela reação de PCR com esse padrão, que é
vendido comercialmente.
Veja a representação esquemática a seguir:

Figura 3 – Representação esquemática de eletroforese em gel de agarose

Fonte: Adaptado de Khan Academy

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 A Figura 4 mostra uma imagem real da separação de um produto de PCR por
eletroforese em gel de agarose.

A visualização é possível graças à incorporação de um corante fluorescente na

cadeia de DNA, chamado brometo de etídeo.

Figura 4 – Separação de produto de PCR por eletroforese em gel de agarose

Fonte: Adaptado de Khan Academy

Teste seu conhecimento

1. O que é agarose e como ela é utilizada na área da Biotecnologia?
2. Como funciona a eletroforese em gel de agarose?
3. Por que as moléculas de DNA migram do polo negativo em direção ao
polo positivo?
4. Como ocorre a separação de fragmentos de DNA oriundos de uma rea-
ção de PCR?
5. O que é e para que serve o padrão de tamanho molecular?
6. Do que são compostas as bandas visualizadas em um gel de agarose?
7. O que é brometo de etídeo?

Aplicações da PCR
Agora que entendemos como funciona a reação, vamos estudar sobre algumas
de suas aplicações. Em um Laboratório Clínico, as aplicações da PCR são diversas.
Tudo depende da sequência que se deseja amplificar.

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No diagnóstico de doença causada por uma bactéria, por exemplo, deve-se esco-
lher amplificar uma sequência de DNA que seja exclusiva do microrganismo.

Imagine a seguinte situação: um paciente procura por auxílio médico por apre-
sentar tosse com secreção espessa, falta de ar, cansaço excessivo, perda de peso e
falta de apetite.

O médico suspeita de tuberculose, coleta uma amostra da secreção e envia a um

Laboratório de Análises Clínicas.

Como o M. tuberculosis leva cerca de 14 dias para crescer em meio de cultura, o

médico também solicita o teste molecular por PCR.

Quando o analista realizar a extração de DNA da amostra, esta conterá DNA de

origem humana e DNA de origem bacteriana, se o paciente estiver infectado. Mas
como saber se há DNA bacteriano na amostra?

A resposta para essa pergunta é: utilizar primers que reconheçam especificamen-

te uma sequência de DNA exclusiva da bactéria, como, por exemplo, o gene que
codifica o rDNA 16S.

Os primers específicos anelam por complementaridade apenas com o rDNA 16S

da bactéria e com nenhuma sequência de DNA humano.

Lembre-se de que para a DNA polimerase iniciar a polimerização é necessária

uma pequena região de dupla fita formada pela fita de DNA e pelo primer!

Quais são os possíveis resultados?

Realizando a reação com esses primers específicos e todos os outros componen-
tes, teremos dois resultados possíveis:
• Se identificarmos uma banda no gel de agarose com tamanho esperado para
aquele gene, o diagnóstico é positivo para a bactéria. Isso significa que havia
DNA de M. tuberculosis na amostra suficiente para sua amplificação;
• Se não houver bandas formadas, significa que não houve amplificação por não
haver molde de DNA bacteriano na amostra.

Outra aplicação muito importante na clínica é a utilização da PCR na identificação

humana, seja em teste de paternidade, seja na Ciência Forense.

Em nossos cromossomos, existem regiões variáveis chamadas microssatélites.

Elas consistem de repetições de nucleotídeos uma ao lado da outra, como contas em
um colar.

São também chamadas de VNTR (do inglês, Variable Number of Tandem Repeats)
e, como o nome sugere, há variações no número de repetições entre indivíduos.

Agora, imagine o seguinte caso: a perícia científica faz a análise de uma cena de cri-
me. Encontram vestígios de amostra biológica e fazem a coleta para posterior análise

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em Laboratório. Decidem amplificar a região de microssatélites da amostra encontrada
no local do crime e comparam com o mesmo lócus de três suspeitos diferentes.

Para realizar tal análise, é necessário utilizar primers específicos que são comple-
mentares especificamente para essa região cromossômica.

Como essa região é polimórfica em tamanho, ou seja, cada indivíduo possui um

lócus de tamanho diferente, supõe-se que é possível comparar o perfil dos suspeitos
com a amostra isolada na cena do crime.

Analise a figura a seguir e tire suas conclusões:

DNA da
cena do crime

Escada de DNA DNA do suspeito

nº1 nº2 nº3

500 pb
400 pb
300 pb
200 pb

100 pb

Figura 5 – Análise de lócus de microssatélite por PCR

seguido de eletroforese em gel de agarose
Fonte: Adaptado de Khan Academy

Analisando o DNA da cena do crime, é possível observar que o fragmento possui,

aproximadamente, 200pb de tamanho.

Quando analisamos o tamanho desse mesmo lócus nos suspeitos, observamos

que somente o indivíduo 3 possui perfil idêntico ao DNA da cena do crime.

Assim, descarta-se a o envolvimento dos indivíduos 1 e 2 e se conclui que o indi-

víduo 3 é o responsável pelo crime. Na prática, diversos loci de microssatélites são
necessários para chegar a tal conclusão com alto índice de confiabilidade.

Um outro exemplo de aplicação da técnica de PCR na clínica é sua utilização na

sexagem fetal. Sabe-se que, muitas vezes, os exames de imagem não são capazes de
determinar o sexo do feto pela posição em que ele se encontra no útero materno ou
pelo número reduzido de semanas da gestação.

A demora no diagnóstico pode causar alguma ansiedade e atrapalhar o planeja-

mento da família.

Desde 1997, sabe-se que, já durante as primeiras semanas de gestação, o DNA

do feto é encontrado na circulação sanguínea da mãe.

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Com oito semanas, é possível ter concentração de DNA fetal em concentrações

adequadas para a realização do teste, porém, na 11ª semana, ele atinge seu pico.
Assim, retirando-se sangue da circulação periférica da mãe, extraindo-se o DNA, pode-
-se buscar por sequências específicas do cromossomo Y, utilizando primers específicos.
Se houver amplificação desse DNA, conclui-se que o bebê é um menino, pois a
mãe é XX e não possui cromossomo Y. Caso não haja amplificação, conclui-se que
é menina, pois não apresenta cromossomo Y, tal como a mãe.
Evidentemente, existem muitas outras aplicações para a técnica de PCR na ro-
tina clínica.
Para mais detalhes, consulte o Material Complementar correspondente.

Teste seu conhecimento

1. Explique como a Técnica de PCR pode ser utilizada para diagnóstico de
doenças bacterianas?
2. Qualquer tipo de infecção bacteriana pode ser diagnosticada por PCR?
E infecções virais?
3. Em 2020, o mundo sofre os danos de uma pandemia causada por um
vírus da família Coronaviridae. Você consegue dizer qual a principal téc-
nica utilizada no diagnóstico dessa infecção? Como os médicos conse-
guiam saber se o paciente estava infectado pelo vírus da Influenza ou
pelo Coronavírus?
4. Explique como a técnica de PCR é utilizada na Medicina Forense. E em
exames de paternidade?
5. O que garante a confiabilidade de um Teste de Sexagem Fetal?

Variantes da Técnica de PCR

Como vimos, a técnica de PCR é muito poderosa, pois permite a amplificação
exponencial de um fragmento de DNA de interesse.

Com o passar do tempo, muitos cientistas desenvolveram variações na Técnica de

modo a contemplar suas necessidades.

PCR da polimerase reversa

Uma variação muito importante é chamada RT-PCR (do inglês, Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction).

Na RT-PCR utiliza-se a enzima transcriptase reversa, que é uma DNA polimerase

que utiliza RNA como molde, ou seja, sintetiza uma cadeia de DNA a partir de uma
fita simples de RNA.

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 O DNA sintetizado a partir de um molde de RNA é chamado DNA complemen-
tar (cDNA).

As vantagens em se utilizar essa técnica são: realizar estudos de genes expressos,

estudos de íntros, éxons e splicing.

Na rotina clínica, é especialmente útil no diagnóstico e acompanhamento de doenças

causadas por retrovírus, cujo genoma é composto por RNA, como é o caso do HIV.

Importante!
cDNA é uma molécula de DNA copiada a partir de um molde de RNA pela enzima Trans-
criptase Reversa. Como os íntrons presentes no DNA genômico são removidos durante o
processamento do RNA, o cDNA não contém íntrons.

Figura 6 – Compreensão das etapas de transcrição de RNA pela célula até a produção de
molécula de cDNA em um tubo de ensaio pela técnica de PCR pela transcriptase reversa
Fonte: Adaptado de TORTORA; FUNKE; CASE

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PCR em Tempo Real

Outra variante de PCR muito importante que precisamos conhecer é a reação
de PCR em Tempo Real, algumas vezes simbolizada pela mesma sigla RT-PCR (do
inglês Real Time PCR).

Para diferenciar, alguns pesquisadores chamam essa técnica de qPCR (“q”

de quantitativo).

Importante!
Não confundir
• RT-PCR-, do inglês Reverse Transcriptase PCR: PCR com utilização da enzima Trans-
criptase Reversa;
• RT-PCR-, do inglês Real Time PCR: PCR em tempo real.
Preferencialmente, não utilize essa sigla quando quiser fazer referência a uma dessas
técnicas. Utilize o nome completo para não causar confusão.

A qPCR é considerada a técnica padrão-ouro para o diagnóstico molecular quan-

titativo em casos de infecções bacterianas e virais.

Ela permite o acompanhamento, em tempo real, da síntese das novas cadeias de

DNA por meio da adição de compostos fluorescentes no momento da preparação
da amostra. Esses, por sua vez, serão excitados por uma fonte de luz adequada e a
fluorescência emitida será captada por um detector ao final de cada ciclo de PCR.

Cada vez que uma molécula de DNA é sintetizada, emite fluorescência, ou seja, a
fluorescência aumenta a cada ciclo, já que novas moléculas são sintetizadas a cada ciclo.

Em outras palavras, a intensidade de fluorescência será proporcional à quantidade

de DNA sintetizado, a qual será representada em um Gráfico, como o da Figura 7.

Figura 7 – Cinética da produção de DNA pela técnica de PCR

Fonte: Acervo do conteudista

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 Perceba que, nos primeiros ciclos, especificamente nesse exemplo, até o ciclo 15,
não há a detecção de fluorescência acima da linha de base.

Essa é a chamada fase linear, na qual há excesso de reagentes, mas a quantidade

de produto ainda é muito baixa para que a fluorescência seja detectada.

Depois do ciclo 15, vemos um crescimento exponencial da fluorescência. Há acú-

mulo do fragmento de DNA desejado pelo pareamento facilitado, vez que há várias
cópias das sequências alvo.

Segue-se, a partir do ciclo 28, a fase de platô, na qual a amplificação já é subó-

tima devido à limitação dos reagentes e à competição dos produtos gerados com
os primers.

Como Analisar um Resultado Obtido

pela Técnica de PCR em Tempo Real
Observe no Gráfico (Figura 7) um ponto na curva exponencial chamado C T
(Ciclo Threshold).

O CT é ciclo em que a fluorescência ultrapassa o limite de detecção pré-estabele-

cida pelo equipamento (threshold).

O ciclo em que a curva de determinada amostra ultrapassa o threshold depende

da quantidade de DNA presente, isto é, cada amostra analisada vai ultrapassar a
threshold em momentos distintos e, consequentemente, ter diferentes Ct, se houver
diferentes quantidades de DNA.

A figura a seguir mostra um pesquisador analisando o resultado de qPCR de dife-

rentes amostras antes da determinação da linha threshold.

A amostra cuja curva exponencial está à esquerda possui mais DNA que as de-
mais amostras, enquanto a amostra cuja curva exponencial está à direita possui
menos DNA que as demais.

Em outras palavras, em ensaios de quantificação, quanto maior a quantidade de

moléculas de DNA alvo no início da reação, menos ciclos serão necessários para
ultrapassar o threshold.
Da mesma forma, quanto menor a quantidade de sequência alvo, mais ciclos se-
rão necessários para produzir DNA suficiente para ultrapassar esse limite.

Assim temos que, quanto menor o CT, mais DNA alvo existe na amostra original.
Quais as aplicações da técnica de PCR em tempo real? Entre os diversos exem-
plos, podemos citar a quantificação de genes expressos em determinado tecido,
quantificação de carga viral, detecção de agentes infecciosos e reação do organismo
a determinado tratamento terapêutico entre outros.
Por exemplo, fazer o diagnóstico de pacientes infectados pelo vírus HIV para
determinar a carga viral presente no sangue do paciente e, consequentemente,

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orientar o médico para saber se precisa fazer tratamento quimioterápico e qual o

tipo de tratamento.

Figura 8
Fonte: Getty Images

Caso o paciente inicie um tratamento, amostras são colhidas de tempos em tem-

pos para verificar se a carga viral está diminuindo ou não, ou seja, se o medicamento
está funcionando na terapia ou se é necessário alterar a medicação.

Evidentemente, existem vantagens e desvantagens para o uso de uma ou outra

técnica de PCR.

Em um Laboratório Clínico, é importante ter em mente o custo-efetividade do

método para escolher a opção que atenda à demanda.

Sem dúvida, se há a necessidade de um resultado quantitativo, a qPCR é a me-

lhor opção. Entretanto, se o interesse é apenas qualitativo, a PCR convencional
deve ser escolhida.

A Tabela a seguir apresenta uma breve comparação entre ambas as técnicas.

Tabela 1 – Comparação entre a técnica de PCR convencional e a qPCR

PCR convencional PCR em Tempo Real
Qualitativo Quantitativo
Analisa o platô da curva Analisa durante a fase exponencial
Processamento pós PCR para análise Análise em tempo real
Menor sensibilidade Maior sensibilidade
Menor custo para realização Maior custo para realização

Teste seu conhecimento

1. O que é como é realizada a técnica de PCR da polimerase reversa?
2. O que é cDNA e como ele é obtido?

20
 3. O que é como é realizada a técnica de PCR em tempo real?
4. Explique o que é threshold e o que é CT;
5. Analise e explique um gráfico obtido após um PCR em tempo real;
6. O que é fase linear, fase exponencial e platô em uma reação de PCR em
tempo real? O que acontece em cada uma dessas etapas?
7. DESAFIO: a reação de PCR convencional seria equivalente à qual fase
do PCR em tempo real?
8. Como a carga viral de um paciente pode ser detectada pelo PCR em
tempo real?
9. Relacione o Ct com a quantidade de DNA em uma amostra;
10. Quais aplicações do PCR em tempo real?

Proteômica no Diagnóstico
de Agentes Patogênicos
Um dos maiores desafios da Microbiologia Clínica é o tempo para a liberação
do resultado.

Isso ocorre porque é necessário que o microrganismo cresça em meio de cultu-

ra e que testes bioquímicos sejam realizados para a identificação do patógeno de
forma inequívoca.

Por mais que a Tecnologia avance, a taxa de crescimento é característica e pecu-

liar do microrganismo. A utilização das Técnicas baseadas em PCR tem sido muito
importante para a redução do tempo de liberação de um laudo clínico e se tornou
realidade em muitos Laboratórios do país.

Uma proposta mais recente é a utilização da espectrometria de massas para a iden-

tificação rápida de patógenos. Esta é uma técnica de química analítica, que vem sendo
aplicada na microbiologia. Ela funciona como uma “balança molecular”, sendo capaz
de medir, com alta resolução, a massa de um composto químico que contenha carga.

Existem diferentes formas de ionizar um composto e analisá-lo. Por essa razão,

temos diferentes equipamentos de espectrometria de massas, os quais se adaptam
melhor a diferentes aplicações.

Na Microbiologia, a forma mais utilizada é conhecida por MALDI-ToF, uma si-

gla para “dessorção/ionização a laser assistida por matriz-tempo de voo” (do inglês
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight).

MALDI refere-se à forma de ionizar, ou seja, de doar prótons para que a molécula
fique carregada positivamente.

Na figura a seguir, é possível entender o princípio da técnica de ionização.

Um analito que se queira medir (pontos em laranja) é misturado com uma matriz

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UNIDADE Biotecnologia Diagnóstica

orgânica (pontos em verde), com quem é co-cristalizado numa superfície sólida

(em cinza).

Um feixe de laser de alta frequência incide sobre o cristal e desorve da placa (retira)
o analito com matriz. Este absorve a energia do laser e transporta as moléculas do ana-
lito para a fase gasosa, transferindo prótons à ela e, consequentemente, ionizando-o.

Agora, a massa do analito carregado positivamente poderá ser medida pelo ana-
lisador de massas chamado ToF.

Figura 9 – Ionização de analitos por MALDI

Fonte: Acervo do conteudista

Uma vez ionizado, o analito “voa” em direção à diferença de potencial (ddp) que
existe ao longo de um tubo (tubo tempo de voo) e é detectada ao final.

Moléculas pequenas levam menos tempo para atingir o detector, enquanto molé-
culas maiores o atingem em mais tempo.

Um software acoplado ao Sistema transforma a informação de tempo em massa

e gera um gráfico chamado espectro de massas. A Figura 10 ilustra esse processo.

Figura 10 – Princípio da medição de massa por tempo de voo (ToF)

Fonte: Acervo do conteudista

A aplicação dessa técnica na Microbiologia para a detecção de patógenos segue

o seguinte raciocínio, representado também na Figura 10:

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 • Realiza-se a cultura bacteriana em placas de Petri contendo meio de cultura;
• Uma parte da colônia é misturada à matriz (ácido orgânico capaz de absorver
energia do laser) e aplicada à placa para co-cristalização;
• Incide-se o laser sobre o ponto em que há bactérias e matriz;
• Diferentes moléculas da bactéria são dessorvidas, ionizadas e, em seguida, en-
tram no tubo tempo de voo para que suas massas sejam medidas;
• Um espectro de massa, característico dessa amostra, é determinado;
• Compara-se o espectro gerado na amostra com um banco de espectros presen-
te no software de análise.

Figura 11 – Aplicação de MALDI-ToF em Microbiologia

Fonte: Acervo do conteudista

Imagine a seguinte situação: suspeita-se que determinado paciente esteja infecta-

do por uma E. coli produtora de β-lactamase de espectro estendido.
Realiza-se o protocolo descrito acima e se obtém o espectro de peptídeos de pro-
teínas específicas dessa bactéria suspeita.
Ao comparar com os espectros contidos no banco de dados, tem-se a seguinte imagem:

Figura 12 – Comparação de espectros de massas gerados por MALDI-ToF

Fonte: Adaptado de journals.plos.org

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UNIDADE Biotecnologia Diagnóstica

Perceba que o espectro obtido (vermelho) se sobrepõe quase que perfeitamente

ao espectro do Banco de Dados (azul).

Quando há tal correspondência, pode-se concluir que são a mesma espécie.

Assim, é possível realizar a identificação desse patógeno de forma inequívoca, com-
parando o conteúdo proteico espécie-específica.

Um ponto importante a se ressaltar é que todo o procedimento, desde a co-

-cristalização da bactéria com matriz até a comparação de espectros é muito rápido,
necessitando de poucos minutos para ter o resultado final.

Muitos Laboratórios de Microbiologia já têm implantado essa Técnica em sua

rotina, principalmente, dentro de hospitais, onde a velocidade na liberação do laudo
é fundamental.

Teste seu conhecimento

1. Por que a análise proteômica vem sendo cada vez mais utilizada em
Laboratórios de Diagnóstico Clínico? Qual a vantagem dessas técnicas?
2. Explique o que é e como ocorre a Técnica de MALDI-TOF. De um exem-
plo de como uma amostra pode ser analisada por essa técnica.

Em Síntese
Nesta Unidade, vimos como algumas Técnicas de Biotecnologia podem ser utilizadas no
diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas.
Lembre-se de que, para a técnica de PCR, é fundamental um bom desenho dos primers
e este deve reconhecer uma sequência de DNA específica.
A técnica é a mesma (mesmo nas variantes), tudo dependerá qual sequência se
deseja analisar.

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Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:

Vídeos
Semi conservative replication
https://bit.ly/39JDraF
PCR em Tempo Real
https://youtu.be/d-wtEfjnjGU

Leitura
Modelo de replicação do DNA: Experimento de Meselson-Stahl
https://bit.ly/2V4ORk5
Aplicação das técnicas de pcr e suas técnicas derivadas em diagnóstico molecular
https://bit.ly/2weZ590
Novas metodologias de identificação de micro-organismos: MALDI-TOF
Espectrometria de massas para identificação de microrganismos.
https://bit.ly/2JHqJyF

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UNIDADE Biotecnologia Diagnóstica

Referências
ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. Porto Alegre: Artmed,
2011. 1396p.

COOPER, G. M. A célula: uma abordagem molecular. 3.ed. Porto Alegre: Artmed,

2007. 736p.

KARP, G. Biologia celular e molecular: conceitos e experimentos. Barueri: Manole,

2005. 832p.

LODISH, H. et al. Biologia Celular e Molecular. 7.ed. Porto Alegre: Artmed,

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