Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Pontos Principais:

 A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias de

uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um

organismo).

 A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq polimerase, e

requer primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse do DNA

 Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de

temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse.

 A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente usada em

clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de DNA.

O que é PCR?

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para

fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA

pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja

função o pesquisador queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas

forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos.

Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA,

de modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira. Por exemplo, DNA

amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado por eletroforese em

gel, ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos.

A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia

molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia.

Taq polimerase
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimerase

que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase

tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à bactéria

resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).

T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante estável

ao calor e é mais ativa à 70°C70°C70, °, start text, C, end text (temperatura em que as DNA

polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq

polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta temperatura é usada repetidamente na PCR

para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas fitas.

Primers de PCR

Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe

é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida

para a síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que

será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher.

Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta

de 202020 nucleotídeos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de PCR, e

eles são projetados de modo que englobem a região de interesse (região que deve ser

copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem

nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de

bases complementares.

DNA molde:

5' TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT 3' 3'

ATAGTCTAGGTACCTCA...CTCATGATCAGGATACTCA 5'
 Primer 1: 5' CAGATCCATGG 3' Primer 2:

Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela polimerase, e a

região que está entre eles será copiada.

[Diagrama mais detalhado mostrando a direcionalidade do DNA e do primer]

As etapas da PCR

Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA molde e

nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são reunidos em um tubo,

juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e passam por repetidos ciclos de

aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado.

As etapas básicas são:

1. Desnaturação (96°C96°C96, °, start text, C, end text): Aquece fortemente a reação

para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita

simples para a próxima etapa.

2. Anelamento (555555 - 656565°C°C°, start text, C, end text): Resfria a reação para que

os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita

simples.

3. Extensão (72°C72°C72, °, start text, C, end text): Eleva a temperatura da reação para

que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.

Este ciclo se repete 252525 - 353535 vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente

ocorre em 222 - 444 horas, dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a

reação for eficiente (funcionar bem), a região de interesse pode gerar de uma ou poucas

cópias até bilhões.

Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez. Ao invés, o

novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de síntese de DNA.

Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação,

então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo.

Esse padrão de crescimento exponencial é mostrado na imagem abaixo.

Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR

Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do

uso da eletroforese em gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são

puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos

de DNA de acordo com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para

que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser vista

a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma

reação de PCR produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases (pb) apareceria desta

maneira no gel:

Coluna esquerda: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, 500 pb.

Coluna direita: resultado da reação PCR, uma banda em 400pb.

Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse do DNA, não apenas

uma ou algumas cópias. Como o DNA é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes

antes que possamos vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma

ferramenta importante: ela produz cópias suficientes de uma sequência de DNA de modo que

possamos ver ou manipular aquela região de DNA.

Aplicações da PCR

Através da PCR, uma sequência de DNA pode ser amplificada milhões ou bilhões de vezes,

produzindo cópias suficientes de DNA para serem analisadas por outras técnicas. Por exemplo,

o DNA pode ser visualizado por eletroforese em gel, enviado para sequenciamento, ou

digerido por enzimas de restrição e clonado em um plasmídeo.

A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem aplicações práticas em

ciências forenses, testes genéticos e diagnósticos. Por exemplo, a PCR é utilizada para

amplificar genes associados a desordens genéticas a partir do DNA de pacientes (ou do DNA

fetal, nos casos de teste pré-natal). A PCR também pode ser utilizada para testar se há DNA

bacteriano ou viral no corpo de um paciente: se o patógeno estiver presente, pode ser possível

amplificar regiões de seu DNA a partir de uma amostra de sangue ou tecido.

Amostra-problema: A PCR nas ciências forenses

Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências forenses. Você acabou de

receber uma amostra de DNA de um cabelo deixado em uma cena de crime, juntamente com

amostras de DNA de três possíveis suspeitos. Seu trabalho é examinar um marcador genético

em particular e verificar se algum dos três suspeitos coincide com o DNA do cabelo para esse

marcador.

O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma única repetição (região

marrom abaixo), enquanto o outro contém duas cópias da repetição. Em uma reação PCR com

primers que atuam na região de repetição, o primeiro alelo produz um fragmento de DNA

de 200200200 bpbpstart text, b, p, end text, enquanto o segundo produz um fragmento de

DNA de 300300300 bpbpstart text, b, p, end text:

Marcador do alelo 1: primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de

DNA de 200 pb

Marcador do alelo 2: primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de

DNA de 300 pb

Você faz uma PCR nas quatro amostras de DNA e visualiza os resultados por eletroforese em

gel, como representado abaixo:

O gel tem cinco faixas:

Primeira faixa: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, e 500 pb.

Segunda faixa: DNA da cena do crime, banda de 200 pb.

Terceira faixa: DNA do suspeito #1, banda de 300 pb.

 Quarta faixa: DNA do suspeito #2, bandas de 200 e 300 pb.

Quinta faixa: DNA do suspeito #3, banda de 200 pb.

O DNA de qual suspeito coincide com o DNA da cena do crime para esse marcador?

R:

Mais sobre PCR e ciências forenses

Em testes forenses reais com o DNA da cena do crime, os técnicos fariam uma análise

conceitual similar à representada no exemplo acima. Contudo, uma série de marcadores

diferentes (não apenas o único marcador do exemplo) seria comparada entre o DNA da cena

do crime e o DNA do suspeito.

Ademais, os marcadores usados em análises forenses típicas não vêm apenas em duas formas

diferentes. Em vez disso, eles são altamente polimórficos (poli = muitas, morfo = formas). Isto

é, eles vêm em muitos alelos que variam minimamente em comprimento.

O tipo mais comum de marcadores usado nas ciências forenses,

chamado microssatélites (STRs na sigla em inglês), consiste em várias cópias da mesma

sequência curta de nucleotídeos que se repetem (tipicamente, 222 a 555 nucleotídeos de

comprimento). Um alelo de um STR pode ter 202020 repetições, enquanto outro pode

ter 181818 e um outro apenas 10101011start superscript, 1, end superscript.

Por meio do exame de múltiplos marcadores, cada um dos quais vem em muitas formas de

alelos, os cientistas forenses podem montar uma "impressão digital" singular a partir de uma

amostra de DNA. Em uma análise típica de STR usando 131313 marcadores, as chances de um

falso positivo (duas pessoas tendo a mesma "impressão digital" de DNA) são menores

que 111 em 101010 bilho˜esbilho˜esstart text, b, i, l, h, o, with, \~, on top, e, s, end text11start

superscript, 1, end superscript!

Embora possamos pensar na evidência de DNA sendo usada para condenar criminosos, ela

tem tido um papel crucial na exoneração de pessoas falsamente acusadas (incluindo algumas

que estavam presas há muitos anos). A análise forense também é usada para estabelecer

paternidade e identificar restos mortais de cenas de desastres.