Covid-19 - Diagnóstico

Tópicos Avançados II
Diagnóstico da Covid-19 – Estágios da Infecção
Tipos de testes laboratoriais para
diagnóstico da Covid-19

• Teste Rápido Imunocromatográfico

para pesquisa de Antígeno Viral (TR-Ag)

• Teste Molecular: RT-PCR em

Tempo Real (RT-qPCR)
• Teste Molecular: Amplificação
Isotérmica (RT-LAMP)
• Testes para detecção de
anticorpos
 Detalhamento dos Testes

• Compreender o funcionamento dos testes diagnósticos e a

lógica por trás de suas metodologias.
• Explicar a importância da realização de testes diagnósticos
para a identificação precoce e tratamento de doenças.
• Discutir as limitações e desafios enfrentados na realização
de testes diagnósticos, bem como as possíveis soluções e
avanços tecnológicos na área.
 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

• A PCR é uma técnica de laboratório comum

usada em pesquisas e práticas clínicas para
amplificar ou copiar pequenos segmentos de
material genético.

• A PCR é conhecida como "fotocópia

molecular" e é incrivelmente precisa e
sensível.

• Sequências curtas chamadas primers são

usadas para amplificar seletivamente uma
sequência específica de DNA.
 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

• A PCR foi inventada na década de 1980 e

agora é usada de várias maneiras, incluindo
impressão digital de DNA, diagnóstico de
distúrbios genéticos e detecção de
bactérias ou vírus.

• As análises moleculares e genéticas

requerem quantidades significativas de
uma amostra de DNA, é quase impossível
para os pesquisadores estudar pedaços
isolados de material genético sem
amplificação por PCR.
Síntese e Amplificação do DNA

SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS
• A síntese de oligonucleotídeos de DNA e RNA se desenvolve
hoje em máquinas automatizadas (sintetizadores) capazes de
construir, em poucos minutos, moléculas com dezenas de pares de
bases.

• Estes oligonucleotídeos podem ser utilizados como sondas ou como

primers para a PCR (veremos um pouco mais adiante).
Síntese e Amplificação do DNA

SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS
Síntese e Amplificação do DNA

SÍNTESE DE CDNA
• Uma enzima de origem viral transcreve a informação genética no
sentido RNA → DNA.

• Esta enzima, denominada transcriptase reversa, normalmente

garante aos vírus com genoma de RNA sua multiplicação no
hospedeiro (como o HIV, por exemplo).

• Como ferramenta de laboratório, a transcriptase reversa

possibilita a construção de filamentos de DNA
complementares (cDNA) a qualquer molécula de RNA.
Síntese e Amplificação do DNA

SÍNTESE DE CDNA
• Uma enzima de origem viral transcreve a informação genética no
sentido RNA → DNA.

• Esta enzima, denominada transcriptase reversa, normalmente

garante aos vírus com genoma de RNA sua multiplicação no
hospedeiro (como o HIV, por exemplo).
Síntese e Amplificação do DNA

SÍNTESE DE CDNA
Síntese e Amplificação do DNA

A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

• A reação em cadeia da polimerase
(Polymerase Chain Reaction ou PCR) é um
procedimento que permite obter milhões de
cópias de DNA em poucas horas.

• A chave do processo é a DNA-polimerase, uma

enzima estável a altas temperaturas que
permite à bactéria Thermus aquaticus
sobreviver em águas termais. Atualmente,
esta enzima se produz por engenharia
genética.
Síntese e Amplificação do DNA

A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

• Para isso, se precisa do DNA que contenha a sequência que se
deseja amplificar, de desoxinucleotídeos dos quatro tipos (dATP,
dTTP, dCTP e dGTP), de uma polimerase de DNA e dos primers
correspondentes.

• Estes são pequenos fragmentos sintéticos de DNA,

complementares às extremidades da sequência-alvo, sendo
indispensáveis para que a polimerase comece a sintetizar o
filamento de DNA.
Síntese e Amplificação do DNA

A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

• Em um ciclo pontuado por mudanças de temperatura, os
filamentos de DNA são dissociados e anelados com os primers,
possibilitando que a polimerase sintetize o resto da sequência.

• Repetindo muitas vezes o ciclo, gera-se em pouco tempo um

número altíssimo de cópias que podem ser utilizadas em
qualquer tipo de análise.
Síntese e Amplificação do DNA

A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Síntese e Amplificação do DNA

A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Síntese e Amplificação do DNA

A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

• Uma máquina de PCR pode desenvolver 25 ciclos em menos de
uma hora, amplificando 105 vezes o fragmento de DNA.

• Uma das grandes vantagens da PCR é que não há necessidade de

isolar previamente o fragmento a ser amplificado, bastando
conhecer as extremidades da sequência e escolher os primers
adequados.
Síntese e Amplificação do DNA

A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

• A empresa Cetus comprou de seu inventor, K. Mullis, a
patente da PCR por U$S 10.000, vendendo-a pouco tempo
depois a Hoffmann-La Roche por U$S 300 milhões; hoje se trata
de uma técnica corriqueira em qualquer laboratório de Biologia
Molecular e provavelmente nenhum dos dois fez um bom negócio.

• Mais tarde, em 1993, Mullis recebeu o Prêmio Nobel pela invenção

da PCR.
Síntese e Amplificação do DNA

A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

• O sucesso da PCR se deve a sua extraordinária versatilidade,
permitindo que seja utilizada, com objetivos diversos, em campos
tão diferentes como a agricultura, a medicina veterinária, os
estudos ambientais, os testes de diagnóstico e a medicina forense.

• Entre suas muitas aplicações, cabe citar também os estudos

antropológicos e evolutivos, tais como a extração de DNA de
múmias egípcias, de animais extintos como o quagga (um tipo de
zebra) ou de insetos presos em âmbar 40 milhões de anos atrás.
 Teste Molecular: RT-PCR em Tempo Real
(RT-qPCR)
PONTOS CHAVE:
• A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de laboratório que utiliza
primers seletivos para “copiar” segmentos específicos de uma sequência de DNA.

• Os testes de PCR para COVID-19 usam primers que correspondem a um segmento

do material genético do vírus. Isso permite que sejam feitas muitas cópias desse
material, que podem ser usadas para detectar a presença ou não do vírus.

• Um teste de PCR COVID-19 positivo significa que o SARS-CoV-2 está presente. Um

resultado negativo pode significar que a amostra não continha nenhum vírus ou
que há muito pouco material genético viral na amostra para ser detectado.
 Teste Molecular: RT-PCR em Tempo Real
(RT-qPCR)
Como funciona o teste de PCR para COVID-19?
• O teste COVID-19 usa uma versão modificada do PCR chamada reação em cadeia
da polimerase quantitativa (qPCR).

• Este método adiciona corantes fluorescentes ao processo de PCR para medir a

quantidade de material genético em uma amostra.

• Nesse caso, os profissionais de saúde medem a quantidade de material genético

do SARS-CoV-2.
 Teste Molecular: RT-PCR em Tempo Real
(RT-qPCR)
Como funciona o teste de PCR para COVID-19?
• O processo de teste começa quando os profissionais de saúde coletam amostras
usando um cotonete nasal ou tubo de saliva.

• O vírus SARS-CoV-2, que é o patógeno que causa o COVID-19, usa o RNA como
material genético.

• Primeiro, a PCR é convertida de RNA de fita simples para DNA de fita dupla em
um processo chamado transcrição reversa. As duas fitas modelo de DNA são então
separadas.
Teste Rápido Imunocromatográfico para
pesquisa de Antígeno Viral (TR-Ag)
 Teste Molecular: RT-PCR em Tempo Real
(RT-qPCR)
Como funciona o teste de PCR para COVID-19?
• Os primers se ligam ao final desses fios.

• Os primers são pequenos pedaços de DNA

projetados para se conectar apenas a uma
sequência genética específica do DNA viral,
garantindo que apenas o DNA viral possa ser
duplicado.
 Teste Molecular: RT-PCR em Tempo Real
(RT-qPCR)
Como funciona o teste de PCR para COVID-19?
• Após a ligação dos primers, novas fitas
complementares de DNA se estendem ao longo
da fita molde. Quando isso ocorre, os corantes
fluorescentes se ligam ao DNA, fornecendo um
marcador de duplicação bem-sucedida.

• Ao final do processo, são criadas duas cópias

idênticas do DNA viral. O ciclo é então
repetido 20 a 30 vezes para criar centenas de
cópias de DNA correspondentes ao RNA viral
SARS-CoV-2.
Teste Rápido Imunocromatográfico para
pesquisa de Antígeno Viral (TR-Ag)
 Teste Molecular: RT-PCR em Tempo Real
(RT-qPCR)
Resultados:
• Um resultado positivo acontece quando os primers SARS-CoV-2 correspondem ao DNA da amostra e a
sequência é amplificada, criando milhões de cópias. Isso significa que a amostra é de um indivíduo
infectado. Os primers apenas amplificam o material genético do vírus, então é improvável que uma
amostra seja positiva se o RNA viral não estiver presente. Se isso acontecer, é chamado de falso
positivo .

• Um resultado negativo ocorre quando os primers SARS-CoV-2 não correspondem ao material

genético da amostra e não há amplificação. Isso significa que a amostra não continha nenhum vírus.

• Um resultado falso negativo acontece quando uma pessoa está infectada, mas não há material
genético viral suficiente na amostra para que o teste de PCR o detecte. Isso pode acontecer logo
após a pessoa ser exposta. No geral, os resultados falsos negativos são muito mais prováveis ​do que
os resultados falsos positivos.
Teste Rápido Imunocromatográfico para
pesquisa de Antígeno Viral (TR-Ag)
 Teste Molecular: Amplificação Isotérmica
com Loop da Transcrição Reversa (RT-
LAMP)
• O Teste Molecular: Amplificação Isotérmica com Loop da Transcrição Reversa
(RT-LAMP) é uma técnica de laboratório que permite a amplificação do RNA
viral em amostras clínicas para diagnóstico de doenças infecciosas, incluindo
COVID-19.

• A principal vantagem do RT-LAMP é que ele permite a amplificação isotérmica

do RNA viral em temperaturas constantes, eliminando a necessidade de ciclos
de aquecimento e resfriamento, como ocorre na reação em cadeia da
polimerase (PCR). Isso torna o RT-LAMP mais rápido e fácil de usar, com
resultados que podem ser obtidos em menos de uma hora.
 Teste Molecular: Amplificação Isotérmica
com Loop da Transcrição Reversa (RT-
LAMP)
• Para realizar o teste RT-LAMP, uma amostra clínica, como um esfregaço
nasofaríngeo, é coletada do paciente.

• O RNA viral é extraído da amostra e adicionado a uma mistura de reação que

contém primers específicos para amplificar sequências de RNA viral.

• A reação é realizada em uma temperatura constante de cerca de 65 °C, o que é

possível devido à adição de uma enzima chamada transcriptase reversa, que
converte o RNA em DNA complementar.
 Teste Molecular: Amplificação Isotérmica
com Loop da Transcrição Reversa (RT-
LAMP)
• Durante a amplificação, a enzima polimerase Bst, presente na mistura de
reação, sintetiza DNA complementar à sequência viral amplificada pelos
primers.

• A presença de produtos de amplificação é detectada visualmente por meio da

mudança de cor do indicador de pH ou por fluorescência.

• O RT-LAMP é uma técnica promissora para o diagnóstico rápido e preciso de

COVID-19, e pode ser usado como um complemento ou alternativa ao teste RT-
PCR. Além disso, o RT-LAMP é uma técnica portátil e econômica que pode ser
usada em locais com recursos limitados.
 Testes para detecção de anticorpos

Exames Sorológicos para Covid-19

• Buscam pelos anticorpos produzidos pelo corpo para combater o vírus
• IgG, IgA, IgM isolados, IgG por CLIA e Anticorpos Totais por ECLIA
• Realizados pela metodologia ELISA

Sensibilidade dos testes

• Anticorpos Totais e IgA: positividade em torno do 7º dia após o início dos sintomas
• IgM: pode aparecer no mesmo dia ou um dia após os sintomas, em algumas situações
pode nem ser detectado
• IgG: tendência de aparecimento mais tardio, em torno de duas semanas após o início
dos sintomas, em algumas situações até mais de um mês
Diagnóstico da Covid-19 – Estágios da Infecção
 Testes para detecção de anticorpos

Ig Total por Eletroquimioluminescência

• A pesquisa de anticorpos totais anti-COVID-19 por este método apresenta
elevada especificidade. Está indicada para indivíduos assintomáticos, ou que
tenham apresentado quadro clínico sugestivo da COVID-19 há pelo menos duas
semanas. O teste indica exposição prévia ao SARS-Cov-2 e possível imunidade
motora.

Sensibilidade após os sintomas:

• De 0 a 6 dias: 65,5% de sensibilidade;
• De 7 a 13 dias: 88,1% de sensibilidade;
• 14 dias ou mais: 100% de sensibilidade.
 Testes para detecção de anticorpos

IgG por Quimioluminescência

• O IgG isolado é indicado para indivíduos assintomáticos, ou que tenham
apresentado quadro clínico sugestivo da COVID-19 há pelo menos duas semanas. A
persistência dos anticorpos IgG identifica as pessoas que foram infectadas, se
recuperaram da doença e possivelmente se tornaram imunes.

Sensibilidade após os sintomas:

• Menos de 3 dias: 0% de sensibilidade;
• De 3 a 7 dias: 25% se sensibilidade;
• De 8 a 13 dias: 86,3 de sensibilidade;
• 14 dias ou mais: 100% de sensibilidade.
 Testes para detecção de anticorpos

IgG, IgA e IgM por ELISA

• A pesquisa de anticorpos IgA e IgM é indicada a partir de 7 dias do início dos
sintomas da COVID-19, já o IgG, após 10 dias.

• Porém apresentam melhor sensibilidade a partir de duas semanas. A pesquisa

de anticorpos não deve ser usada como critério único para o diagnóstico da
COVID-19.