REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR) /BIOLOGIA MOLECULAR

O objetivo desta prática é explicar os fundamentos da reação de polimerização em cadeia (PCR) e mostrar os
cuidados necessários durante o procedimento.

A reação de PCR é baseada no processo de replicação do DNA. A replicação ocorre na fase S do ciclo celular
e é um processo necessário para a divisão da célula pois aumenta o genoma uma vez dispondo de quantidade
de DNA suficiente e “idêntico” para dividir entre as células filhas. A replicação celular ocorre com a abertura
das fitas de DNA (quebra das pontes de hidrogênio), seguido pelo pareamento dos nucleotídeos livres com o
DNA fita simples, seguindo a ligação A-T, C-G, e pela catalisação das ligações fosfodiéster entre os
nucleotídeos recém-parados. Para que isso ocorra, existem enzimas que catalisam as reações: a helicase abre
as fitas de DNA que servirão de molde, a enzima primase sintetiza os iniciadores ou primers necessários para
a atuação da DNA polimerase, e a DNA polimerase catalisa as ligações fosfodiéster. Os primers são
sintetizados como sequências de poucos nucleotídeos ao longo de todo o DNA, para que a DNA polimerase
consiga amplificar todo o genoma.

Com base nestas informações, a reação foi adequada para ser realizada in vitro, porém, ao contrário da
replicação celular, que tem o objetivo de aumentar todo o genoma para a divisão celular, a reação in vitro
tem como objetivo amplificar uma região pequena do genoma. Para que a síntese ocorra de forma específica,
usa-se primers complementares à sequência de DNA que se deseja amplificar. A reação é feita com o DNA
que se deseja testar (DNA molde), a DNA polimerase Taq (DNA polimerase resistente a altas temperaturas,
derivada de Thermus aquaticus uma bactéria de fontes termais), as condições para a ação da Taq: os primers,
o tampão (sais necessários para a enzima atuar) e MgCl2 (cofator da enzima Taq) e os nucleotídeos.

A reação é guiada por alteração de temperatura em ciclos, onde a helicase é substituída por altas
temperaturas (90- 95ºC) que quebram as pontes de hidrogênio de todo DNA. A temperatura seguinte pode
variar de 50 à 65ºC, dependendo da temperatura de anelamento do primer. Com a redução gradual da
temperatura, o DNA vai renaturando lentamente, mas, devido ao seu pequeno tamanho, os primers são os
primeiros a parearem. Por fim, a temperatura é elevada a 72ºC que é a temperatura ótima de ação da enzima.
O ciclo é repetido de 35 a 40 vezes levando ao aumento exponencial de fragmentos específicos (Figura 1).

Org an i zad o re s : In s titu to d e Bi olo gi a – U FP el

Professores: Monica L. Blauth; Fábio R. P. de Souza; Juliana Cordeiro De p art a me n to d e E co lo gia,
Acadêmicos: Daniele S. Souza, João H. F. de Oliveira, Carolina Pedriger Zool og ia e G en éti ca
Figura 1: Esquema mostrando o aumento exponencial das sequências específicas de DNA a cada ciclo.
Cada segmento amplificado servirá de molde para a síntese de outro fragmento.

Material e métodos:

Materiais Reagentes
- Tubo de microcentrífuga - Água ultrapura
- micropipeta - Tampão da enzima Taq DNA polimerase
- ponteira - MgCl2 cofator da enzima Taq DNA polimerase
- vortex - nucleotídeos (A, T, C, G)
- termociclador - primer PV92 senso
- primer PV92 antisenso
- Taq DNA polimerase
- Amostras de DNA
 Procedimento e prática de PCR

Uma reação de PCR é feita conforme concentrações especificadas na tabela abaixo. Faça o
cálculo do volume necessário para uma reação de PCR usando a fórmula C1 x V1= C2 x V2
Após estabelecer os volumes de uma reação, calcule as quantidades necessárias para um mix
de 5 reações.

Reagentes Concentração Concentração Volume na Mix de

estoque em uma reação reação 5 reações
Tampão da Taq 10x 1x

MgCl2 50mM 2mM

Nucleotídeos ou dNTPs 10pmol 10pmol

primer senso 10 pmol 10pmol

primer antisenso 10 pmol 10pmol

Taq DNA polimerase 5U/ul 0.1U/volume

DNA (quantificar em gel de Não colocado
30 a 50 ng/ul 30 a 50 ng/ul
agarose) no Mix
Completar volume
Água ultrapura - -
final 15ul __
Volume final - - 15ul
_______

Depois de montada a solução mix, ela será distribuída nos microtubos de 0,2ul, descontando o
volume da amostra de DNA. Após a distribuição, a quantidade de DNA que será usada em cada
reação será aplicada nos microtubos que já contém o mix de reação.

As amostras de DNA serão: DNA humano teste 1; DNA humano teste 2; DNA mosca teste; DNA
humano positivo; controle negativo água. O controle positivo serve para mostrar que a reação
de PCR foi bem conduzida (não faltou reagentes e eles estão na quantidade correta), enquanto
o controle negativo indica que não houve contaminação nos reagentes ou no mix. Como serão
quatro amostras, serão feitas cinco reações. O mix de reações permite trabalhar com volumes
maiores de reagentes, reduzindo o erro de pipetagem para cada reação e para que, assim,
possamos ter controles positivo e negativo.

As reações são colocadas no termociclador e este equipamento é responsável pelos ciclos

de temperaturas nos tempos corretos.
Questões sobre a atividade prática

1. Considerando que a sequência dos primers está indicado abaixo, qual a

sequência de nucleotídeos no DNA que esses primers se anelam?

5'-GGATCTCAGGGTGGGTGGCAATGCT-3' (sense)
5'-GAAAGGCAAGCTACCAGAAGCCCCAA-3' (antisenso)
2. Sobre a reação de PCR, responda:
a. Qual o comportamento esperado do controle negativo? Caso o comportamento
esperado não seja visualizado no gel de agarose, como você justificaria o que
ocorreu na reação de PCR?
b. Qual o comportamento esperado do controle positivo? Caso o comportamento
esperado não seja visualizado no gel de agarose, como você justificaria o que
ocorreu na reação de PCR?
c. Qual o comportamento esperado do na reação de PCR da amostra de DNA humano?
Caso o comportamento esperado não seja visualizado no gel de agarose, como você
justificaria o que ocorreu na reação de PCR?
d. Qual o comportamento esperado do DNA de mosca? Caso o comportamento
esperado não seja visualizado no gel de agarose, como você justificaria o que
ocorreu na reação de PCR?