MARCADORES

MOLECULARES NO
MELHORAMENTO
GENÉTICO DE
ARAUCÁRIA
•Componentes:

•Ana Júlia Corrêa

•André Vicente

•Cristian Miguel

•Fernanda Vitória

•Lavínia Schettini

•Ramon Barbosa
INTRODUÇÃO

→ Exploração florestal; crescente nas décadas

de 1950 e 1970

→ Araucaria angustifolia (Bert). O. Ktze.

→ Lista Oficial de Flora Ameaçada de Extinção

→ Diversidade genética; marcadores

morfológicos e isoenzimas

→ Uso de marcadores RAPD

MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DE DNA

→ Trinta indivíduos adultos do Parque

Ecológico Municipal de Lages

→ Homogeneização por inversão

→ Centrifugações; extração orgânica com CIA

→ Álcool isopropílico e álcool etílico

→ Comparação com quantidades de DNA de

fago lambda; determinar pureza Exemplo de método CTAB em acariquara-branca.
 PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE DNA

Adiciona-se 1,5 mL de tampão de

Maceradas em gral de porcelana extração [CTAB 2%; NaCl 1,5 M;
150 mg de folhas congeladas em EDTA 20 mM; Tris-HCl (pH 8,0) 100
nitrogênio líquido mM; PVP 2%; 2 mercaptoetanol 1%]
ao pó resultante

Após isso, material deixado sobre A cada 15 minutos, homogeneíza-se por Transfere-se para tubos eppendorf de 2mL, mantém-se
a bancada até alcançar inversão em banho maria (60ºC) por 40 minutos
temperatura ambiente
 PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE DNA

Acrescenta-se 600 μL de CIA

[clorofórmio: álcool isoamílico 24:1] Porção aquosa com DNA transferida
a cada tubo para 2 novos tubos; acrescenta-se μL
Homogeneíza-se por inversão de RNAse A (10 μg/mL)
durante 3 minutos e centrifuga-se a
13000 RPM por 5 minutos

Porção aquosa transferida para 2 Após 40 minutos, a 34ºC, realiza-se segunda

novos tubos; adiciona-se 50 μL de extração orgânica com CIA
solução de CTAB 10% [CTAB
10%; NaCl 1,4M], a 60°C Centrifuga-se a 13000 RPM por 5
minutos
 PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE DNA

Após homogeneização, realiza-se terceira

extração orgânica com CIA
Porção aquosa transferida para 2
novos tubos, precipita-se DNA pela
adição de 2/3 do volume de álcool
isopropílico gelado (-20ºC)
Material mantido a -20ºC por 30
minutos; depois centrifuga-se a 7000
RPM por 5 minutos

Precipitado secou à temperatura

ambiente; dilui-se DNA em 100 μL de
tampão TE, à temperatura ambiente por Material permaneceu a -20ºC por 10 DNA desidratado novamente com 1 mL de
período de 12 a 16 horas e armazenado a minutos; depois centrifuga-se a 8000 álcool etílico 95%
-20ºC RPM por 5 minutos
 PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE DNA

Concentração de DNA determinada por comparação com quantidades conhecidas de DNA de fago lambda (20, 50, 100 e 200 nanograma/μL),
após eletroforese em gel de 0,8% de agarose, corado com solução de 0,02% de brometo de etídio
REAÇÕES RAPD: O QUE SÃO?

→ Seis iniciadores (OPA04, OPA09, OPA17,

OPC06, OPF16, OPAN15)

→ Tampão PCR 1X

→ Termociclador PTC-100 em 13 μL

→ Desnaturação; 35 ciclos de amplificação;

elongação das cadeias de DNA

→ Eletroforese horizontal; luz ultravioleta;

filme Polaroid preto e branco
 PROCESSO DAS REAÇÕES RAPD
OPA OPA OPA
04 09 17

OPC OPF OPAN

06 16 15

6 iniciadores comercializados
pela Operon Technologies ® Coquetel da reação constou de: PCR 1X, 3,8 mM de MgCl , 0,4
2 mM de

dNTPs, 0,4 μM de iniciadores, 1 U de Taq DNA polimerase e 1,5 ng/ μL de

DNA

Reações PCR desenvolvidas em Termociclador PTC-100 em volume de 13 μL

PROCESSO DAS REAÇÕES RAPD
Etapa inicial de desnaturação (4 minutos a
92ºC), depois 35 ciclos de amplificação (45
segundos a 92ºC, 45 segundos a 35ºC, 1
minuto e 15 segundos a 72ºC) e finalizada
com etapa de elongação nas cadeias de
DNA (3 minutos a 72ºC)

Produtos amplificados separados por eletroforese

horizontal submersa em tampão TBE 1X, em gel
de 1,5% de agarose, corado com solução de 0,02%
de brometo de etídio
REAÇÕES AFLP: O QUE SÃO?

→ Sete combinações de iniciadores

aleatoriamente

→ Protocolo de Vos et al.

→ Restrição do DNA; ligação dos

oligonucleotídeos

→ Pré-amplificação; DNA amplificado;

iniciadores; diluído; amplificado novamente

→ Termociclador PTC-100; eletroforese; géis;

ácido acético; ácido nítrico; água destilada
 PROCESSO DAS REAÇÕES AFLP
E-ACG+M-CAC E-ACT+M-CAA E-ACA+M-CTT

E-ACG+M-CAG E-AAG+M-CTG E-ACC+M-CAT

7 combinações de iniciadores para reações AFLP

ACC+M-CAC selecionadas aleatoriamente no kit AFLP ® Analysis
System 1

Realiza-se restrição de DNA com enzimas EcoRI e

MseI durante 2 horas, a 36ºC
 PROCESSO DAS REAÇÕES AFLP

MseI-C EcoRI-A

Na pré-amplificação, DNA foi amplificado com

utilização de iniciadores com uma base seletiva (EcoRI-
Ligação de oligonucleotídeos adaptadores realizada por A e MseI-C)
2 horas, a 20ºC em volume de 25 μL

DNA pré-amplificado diluído em

Etapas de restrição EcoRI-ANN razão 1:25 e amplificado de novo,
enzimática, de ligação dos utilizando-se iniciadores com três
adaptadores e de
bases seletivas (EcoRI-ANN e MseI-
amplificações realizadas em MseI-CNN CNN)
Termociclador PTC-100
 PROCESSO DAS REAÇÕES AFLP

Para coloração, géis fixados com solução 0,5% de

Produtos amplificados separados por eletroforese vertical em ácido acético, 5% de etanol por 10 minutos; e com
tampão TBE 1X, em gel de 6% de poliacrilamida solução de ácido nítrico por 3 minutos

Após os 30 minutos,
Revelações
solução 3% de carbonato
finalizadas
de sódio e 0,2% de
com solução
formaldeído foi utilizada
5% de ácido
para revelação das bandas,
acético
durante o tempo que for
necessário
Posteriormente, géis impregnados com solução
de nitrato de prata 0,2% por 30 minutos
* Todos os tratamentos foram realizados sob leve agitação
CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE
GENÉTICA E CAPACIDADE INFORMATIVA
→ Similaridade genética, número médio de bandas,
porcentagem de bandas polimórficas e diversidade
genética

→ Matriz binária; software NTSYS-pc 2.02

→ Índice de Jaccard; métodos UPGMA

→ Índice de Shannon; loco com dois alelos

→ Marcadores isoenzimáticos e PCR-RFLP

 RESULTADOS E DISCUSSÃO: RAPD
→ Dezoito marcadores polimórficos; 62 bandas
amplificadas; média de 11,16 bandas totais por iniciador

→ Média de bandas: 3 por iniciador, porcentagem

média de 26,9%

→ Índice de Shannon igual a 0,53

Padrão de bandas obtidos por iniciador OPA04 para reações

RAPD.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO: AFLP
→ 62 marcadores polimórficos; 625 bandas
amplificadas; média de bandas totais de 89,3

→ Média de bandas: 8,8 por combinação de

iniciadores; porcentagem média de 9,8%

→ Índice de Shannon igual a 0,54

 RESULTADOS E DISCUSSÃO: RAPD E AFLP
→ 80 bandas polimórficas correspondiam a 11,6%;
687 bandas amplificadas

→ Médias de bandas totais e polimórficas

amplificadas de 52,8 e 6,15 por iniciador

→ Índice de Shannon igual a 0,54

 RESULTADOS E DISCUSSÃO: RAPD E AFLP
→ Marcadores isoenzimáticos; diversidade de
Shannon de 0,29
→ Marcadores PCR-RFLP de DNA de cloroplastos;
um único haplótipo; diversidade inexistente
→ Marcadores RAPD e AFLP altamente eficientes;
1,8x maior do que isoenzimas
Equação do índice de Shannon.
→ Níveis baixos comparados a outros estudos OBS: Informação entrópica da distribuição,
tratamento das espécies e tamanhos da
→ AFLP com polimorfismo bem maior respectiva população como probabilidade.

→ Comparação de 3 dendrogramas gerados

 COMPARAÇÃO DE DENDROGRAMAS: O QUE SÃO?
→ 86% → 71%
L11 e L13 L6 e L7

→ 81%
L5 e L26 → Maior número de bandas AFLP na Figura 4; muito
semelhante à Figura 3

RESULTADOS
→ 50% para similaridade genética; Figura 2 divide-se em
12 grupos; ponto de união de todos os grupos com 30,5%
de similaridade
→ 50% para similaridade genética; 15 grupos; Figura 3;
ponto de união com 24% de similaridade
2
→ Relação proximidade geográfica e número; 2,34 km de
área do Parque
CONSIDERAÇÕES FINAIS
→ A. angustifolia; provável alta diversidade

→ Checar diversidade genética de populações

remanescentes

→ Impacto da ação do homem; retirada dos melhores

fenótipos

→ Técnicas RAPD e AFLP; áreas livres da ação da

seleção natural

→ Marcados virtualmente neutros; técnicas poderosas

 ARTIGOS

https://link.springer.com/content/pdf/10.1023/A:1018301215945.pdf

https://www.scielo.br/j/rarv/a/4crZpQnDK3gwGsW8WdLykmc/?for
mat=pdf&lang=pt
WEBSITES

https://www.promega.com.br/products/cloning-and-dna-mark
ers/dna-ladder-rna-ladder/
http://biotools.eu/en/43-molecular-markers
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AULER, N.M.F.; REIS, M.S.; GUERRA, M.P.; NODARI, R.O. The genetics conservation of Araucaria angustifolia: I: genetic structure and diversity of
natural populations by means of non-adaptative variation in the state of Santa Catarina, Brazil. Genetics and Molecular Biology, 25(3):329-338, 2002.

GUERRA, M.P.; SILVEIRA, V.; REIS, M.S.; SCHNEIDER, L. Exploração, manejo e conservação da araucária (Araucaria angustifolia). in: SIMÕES,
L.L.; LINO, C.F. Sustentável Mata Atlântica: a exploração de seus recursos florestais. São Paulo: Ed. SENAC São Paulo, 2002. p.85-101.

IBAMA. Lista Oficial de Flora

ameaçada de extinção. Disponível em <http://www2.ibama.gov.br/flora/extincao.htm> acessado em 21/06/02

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LEWONTIN, R. C. The apportionment of human diversity. Evolutionary Biology, 6: 381-390, 1972.

MANTOVANI, A.; MORELLATO, L.P.C.; REIS, M.S. Variação genética em uma população de Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze. (Araucariacae).
Anais do 48.o Congresso Nacional de Genética, Águas de Lindóia, Brasil, cdrom, 2002.

MONTEIRO, R.F.R.; SPELZ, R.M. En-

saio de 24 progênies de Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze. IUFRO: Meeting on Forestry Problems of Genus Araucaria, Curitiba, Brasil, 1980,
p.181-200.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Florianópolis, 2000. [Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Santa Catarina]

SHIMIZU, J.Y.; HIGAS, A.R. Variaçãogenética entre procedências de Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze. na região de Itapeva-SP, estimada até o 6.o
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WILLIAMS, J. G. K.; KUBELIK, A. R.; LIVAK, K. J.; RAFALSKI, J. A.; TINGEY, S. V. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful
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