Universidade de São Paulo – USP

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – FFCLRP

Departamento de Química

Bioquímica Industrial Experimental

Prática 9: Transformação de E. coli

Discentes
Ana Lívia Vezzoso N° USP: 10392118
Larissa Beitum N° USP: 10408278
Maisa Mitiko Nº USP: 10293494

Ribeirão Preto
2020
 I. Introdução

A transformação e a seleção bacteriana são passos fundamentais no

processo de clonagem de DNA, onde as cópias são realizadas frequentemente
em bactérias.

A competência natural das bactérias para receber o DNA do meio

circundante é um fenómeno raro (verificando-se apenas em determinadas
espécies e em condições fisiológicas específicas). Assim, é necessário
desenvolver essa capacidade, tornando as células competentes para viabilizar a
introdução do DNA recombinado (rDNA) no hospedeiro selecionado. Ao
processo de entrada de DNA livre na célula, dá-se o nome de transformação.

Realizaremos um experimento típico de clonagem, o qual primeiramente se

introduz um pedaço de DNA (como um gene), em um pedaço circular de DNA,
denominado plasmídeo. Após, ocorre o processo de ligação, transferindo esse
DNA para bactérias (nesse caso, do tipo E.coli), se tornando o que denominamos
de transformação, onde serão utilizados métodos de seleção de antibióticos e
análise de DNA para que se possa identificar as bactérias desejadas, que
contenham o plasmídeo.

II. Objetivos

Esse experimento tem por objetivo a realização da transformação de E.coli

DH5com plasmídeo contendo o gene lacZ para que se possa efetuar a seleção
de plasmídeos, os quais contém inseridas em sua estrutura, uma sequência de
DNA exógena.
III. Materiais e métodos

 Materiais por grupo:

 Placa de petri descartável (3)

 Micropipetas P1000, P200 e P10
 Ponteiras autoclavadas P1000 (azul), P200 (amarela) e P10 (incolor)
 2 tubos tipo eppendorf de 1,5 mL autoclavados.
 Erlenmeyer de 125mL com 60 mL de meio LB-ágar autoclavado (1)
 Estante para microtubos (1)
 Estante para tubo falcon de 50 mL
 Tubo falcon de 50 mL autoclavado (2)
 Microtubo com 100 L de ampicilina 100 mg/mL (1)
 Microtubo com 50 L de IPTG 20% (1)
 Microtubo com 250 L de X-gal 2% (1)
 Microtubo contendo 2 mL de meio SOC (1) (10 no total contando extras)
 1 tubo com 100 L de células competentes E. coli DH5
 01 tubo falcon de 15 mL com esferas de vidro autoclavado (encher até
~10 mL)
 Cronômetro (1)
 01 béquer de 100 mL para descarte das esferas de vidro.
 Rodinho de vidro + placa de petri com álcool comercial (1)
 Isopor pequeno para gelo (1)
 Álcool 70%
 Bico de Bünsen (1)
 Fósforo (1)
 Papel higiênico (1)
 Descarte para ponteiras
  Materiais de uso geral:

 Balança analítica
 Balança semi-analítica
 Banho de água a 42 °C com boias para microtubos (2)
 Incubadora com agitação orbital
 Incubadora (estufa)

 Reagentes:

 Extrato de levedura
 Triptona
 Cloreto de sódio
 Cloreto de potássio
 Cloreto de magnésio
 Ampicilina
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)
 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal)
 Dimetilformamida (DMF)
 Vetor de clonagem pUC57 com inserto e sem inserto (100ng/L)
 Solução de HCl para acertar pH
 Solução de NaOH para acertar pH
 Etanol comercial
 Água sanitária
  Métodos:

 Preparo das placas Petri:

 Foram preparadas 4 placas Petri com meio LB, sendo elas: 1 para
controle, o qual foram medidos 20mL de meio LB sem antibiótico em um
tubo Falcon, seguindo para o derramamento na placa; as outras 3
separadas para seleção, foram preparadas com 20mL cada uma, com
uma solução contendo 60mL de meio LB e 60L de ampicilina (com
concentração de 100mg/mL), verificando antes se o meio não estaria
muito quente, para que não ocorresse a degradação do antibiótico.

 Em seguida, deixou-se solidificando por 15 minutos, aproximadamente.

Após, adicionou-se em cada placa 40µL de X-gal 2% e 7µL de IPTG 20%,
espalhando sobre a placa com o auxílio de uma alça de Drigalski,
deixando a placa com a tampa aberta ao lado do bico de Bunsen por
60min, aproximadamente.

 Transformação:

 Foi utilizado 1 microtubo com células competentes (100µL) para a

transformação celular.
 Misturou-se 1µL do plasmídeo – pUC57 de concentração 100ng/µL (DNA
a ser inserido no meio intracelular) com 100µL de E.coli competente
mantida em gelo. Em seguida, incubou-se por 10min no gelo.
 Realizou-se o procedimento “Heat shock”, o qual se incubou as células
por 90s exatos a 42ºC, após colocando-se imediatamente, 1 minuto no
gelo. Adicionando-se 900µL de meio SOC a temperatura ambiente,
passando pra incubação de 45 minutos à 37ºC e 200 rpm, para
regeneração das células.
 Com o auxílio de microesferas de vidro, inoculou-se 50 µL da
transformação na placa sem antibiótico e 50 µL e 100 µL em duas das
placas com antibiótico.
  Em seguida, centrifugou-se o tubo com o restante do volume a 5000 rpm
por 1 min a temperatura ambiente, descartando 600 µL do sobrenadante,
ressuspendendo o pellet com o líquido restante e inoculando este volume
na outra placa com antibiótico.
 Após o inóculo, descartou-se as microesferas de vidro em recipiente
apropriado e aguardando cerca de 3 minutos para o meio absorver a fase
líquida inoculada.
 Incubou-se a 37°C por 12 horas com a tampa da placa voltada para baixo,
voltando no dia seguinte para verificação de resultado e contagem de
colônias.

IV. Resultados e Discussões

Devido a atual situação, a prática em questão não foi realizada diretamente

pelos alunos, mas diante a aula dada pelo docente responsável através da
plataforma on-line, e a disponibilidade dos dados respectivos para cada grupo,
foi possível a confecção desta discussão. Mais uma vez, os dados, mesmo que
não experimentais, ainda forneceram aos alunos a possibilidade da simulação
do experimento, viabilizando um melhor entendimento do método utilizado.

Este experimento teve como objetivo a transformação da célula competente

de E. coli com o plasmídeo pUC57 (podendo este ser com ou sem a presença
do inserto) através do procedimento já demonstrado no item III. Diante a isso,
foram disponibilizados os dados simulados para cada grupo. Neste relatório
utilizamos os dados referentes ao grupo 04.

Figura 1: Simulação do resultado da transformação de E. coli com o plasmídeo pUC57,

disponibilizado pelo docente.
 Em uma primeira análise, já podemos apontar que a transformação
referente foi dada com o plasmídeo pUC57 sem o inserto, visto que as colônias
representadas são da cor azul.

Na proposta do experimento, ao se realizar o processo de transformação,

alguns plasmídeos iriam conter o inserto (o que resultaria em colônias brancas,
pois o inserto do DNA interrompe a sequencia da lac Za, e assim as células
transformadas perdem sua atividade enzimática da β-galactosidase), alguns não
iriam conter o inserto (o que resultaria no que vimos na figura 1, colônias de
coloração azul devido a atividade da enzima β-galactosidase indicado pelo
substrato X-gal adicionado), e por fim algumas amostras seriam mistas
(contendo plasmídeos com e sem a presença do inserto). Esta relação é melhor
explicada na questão 2, mais a frente.

Tabela 1 – Contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) nas

respectivas placas de Petri.

Placa Inóculo (µL) Contagem (UFC)

Sem Antibiótico 50 27
50 20
Com Antibiótico 100 35
Inóculo Restante (= 200) 42

Com a contagem de cada placa feita, se faz possível o cálculo da

eficiência de transformação.

 Sabe-se a partir da preparação que a concentração de DNA era de

100ng/µL; e que 1µL foi inoculado em um volume final de 1000 µL (100µL
de plasmídeo + 900µL de meio SOC)

 Portanto em 1000µL temos 100 ng de DNA. (i)

Placa sem antibiótico com 50 µL de inóculo

De (i), temos que: 50 µL  5 ng DNA

27 colônias ---------- 5 ng

X ---------- 1000 ng (1µg)

X = 𝟓, 𝟒 . 𝟏𝟎𝟑 𝐔𝐅𝐂/µ𝐠 𝐃𝐍𝐀

Placa com antibiótico com 50 µL de inóculo

De (i), temos que: 50 µL  5 ng DNA

20 colônias ---------- 5 ng

X ---------- 1000 ng (1µg)

X = 𝟒, 𝟎 . 𝟏𝟎𝟑 𝐔𝐅𝐂/µ𝐠 𝐃𝐍𝐀

Placa com antibiótico com 100 µL de inóculo

De (i), temos que: 100 µL  10 ng DNA

35 colônias ---------- 10 ng

X ---------- 1000 ng (1µg)

X = 𝟑, 𝟓 . 𝟏𝟎𝟑 𝐔𝐅𝐂/µ𝐠 𝐃𝐍𝐀

Placa com antibiótico com 200 µL de inóculo

De (i), temos que: 200 µL  20 ng DNA

42 colônias ---------- 20 ng

X ---------- 1000 ng (1µg)

X = 𝟐, 𝟏 . 𝟏𝟎𝟑 𝐔𝐅𝐂/µ𝐠 𝐃𝐍𝐀

 Tabela 2 – Resultado dos cálculos de eficiência de transformação para as
células de E. coli transformadas.

Placa Inóculo (µL) Eficiência de Transformação (UFC/µg DNA)

Sem Antibiótico 50 5,4 x 10^3
50 4,0 x 10^3
Com Antibiótico 100 3,5 x 10^3
Inóculo Restante (= 200) 2,1 x 10^3

Analisando as eficiências de transformação das células de E. coli, podemos

notar que a eficiência para esta simulação se encontra um pouco abaixo do valor
que é desejado para a prática experimental (um valor de eficiência superior ou
igual a 10^4 UFC/µg DNA).

Analisando também a relação entre a quantidade inoculada em cada placa

contendo o antibiótico, podemos mais uma vez notar que quanto maior for a
quantidade inoculada, maior será a quantidade de colônias encontradas.

Apontamos ainda que a célula transformada apresenta crescimento tanto

na placa contendo antibiótico quanto na placa sem a presença do antibiótico,
isso ocorre devido ao marcador de seletividade presente no plasmídeo utilizado,
o qual se faz capaz de resistir ao antibiótico.
 V. Questões

(Questão 1) Qual a função do antibiótico, do X-gal e do IPTG adicionados

ao meio de cultura LB nas placas de Petri?

R: O IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido) é caracterizado como

indutor da atividade da β-galactosidase em muitas bactérias. Sua função como
um análogo lac, induz a atividade da β-galactosidase ligando-se e inibindo o
repressor lac. O IPTG é usado para induzir a expressão do gene lac-Z em
experimentos de clonagem. O operon lactose de E. coli está sob controle
negativo da proteína Lac repressora, que se liga especificamente ao operador
do genoma de E. coli. Assim, o IPTG é o indutor sintético mais utilizado do Lac-
operon, pois é ativo em concentrações muito baixas e não está sujeito a
degradação enzimática.

O vetor apresenta em sua estrutura um marcador de seleção, geralmente

de resistência a determinados antibióticos. Assim, quando a bactéria incorpora
o plasmídeo, apresenta resistência ao antibiótico, sendo capaz de crescer em
um meio, mesmo com sua presença. Portanto, é possível selecionar as colônias
de bactérias que incorporam o vetor. A região na qual o inserto deve ser ligar
fica dentro do gene da β-galactosidase (Lac-Z), a qual confere às bactérias a
capacidade de metabolizar determinados carboidratos.

Uma vez que o inserto se liga ao vetor, o gene é interrompido e logo, não
é expresso, a bactéria não demonstra a capacidade de metabolizar o carboidrato
e expressará o fenótipo branco; já se o vetor se religa sem o inserto, o gene é
reestruturado e a bactéria metaboliza o carboidrato e confere fenótipo azul.
Portanto, a seleção de colônias é feita a partir das colônias brancas, pois a
probabilidade do inserto de interesse ter se ligado ao vetor presentes nela é
maior.

O Xgal, por sua vez, é um substrato cromogênico útil para a β-

galactosidase que produz uma rica cor azul que pode ser facilmente detectada
visualmente ao fundo. Desta forma, é escolhido para a seleção azul-branca de
colônias de bactérias recombinantes com o genótipo lac, que auxilia na
determinação a atividade da β-galactosidase.
(Questão 2) Porque podem aparecer colônias brancas e azuis após a
transformação? Explique.

R: As colônias azuis resultam do crescimento de E. coli sem inserto. Essa

coloração é adquirida, pois, devido a ausência do inserto, não há interrupção da
sequência do Lac-Z, e assim não perde a atividade da enzima β-Galactosidade.
Esta enzima, por sua vez é responsável por clivar o Xgal liberando um composto
de cor azul, colorindo a colônia formada.

Já as colônias brancas, resultam do crescimento de E. coli com inserto. As

mesmas são brancas uma vez que o inserto interrompe os genes que codificam
a enzima β-Galactosidade. Assim, o Xgal não é clivado garantindo uma
coloração branca para a colônia formada.

Logo, pelos dados fornecidos, pode ser concluído que houve a

transformação foi dada com o plasmídeo pUC57 sem o inserto, visto que a
coloração das colônias são azuladas.

(Questão 3) Caso não haja crescimento na placa sem antibiótico, o que isto
significaria?

R: É de certa forma quase impossível não ocorrer crescimento de

bactérias, devido a sua alta proliferação e crescimento. No entanto, em vista
desse experimento, o não crescimento em uma placa sem antibiótico pode ter
sido devido ao não seguimento correto do protocolo, causando uma inviabilidade
das células, seja após passar pelo processo de transformação não ter realizado
o tratamento SOC para regeneração das mesmas, uma mudança na
temperatura ou até mesmo ter caído sobre a placa alguma substância (como
álcool ou água sanitária), resultando na sua degeneração.

(Questão 4) Qual foi o resultado da sua transformação: foi com ou sem

inserto?

R: Respondido no item “IV. Resultados e Discussões”.

(Questão 5) Qual a eficiência de transformação do seu grupo?

R: Respondido no item “IV. Resultados e Discussões”.

 VI. Conclusão

Embora a prática não tenha sido realizada pelo grupo, através das aulas e
dados experimentais fornecidos, foi possível reforçar os conceitos envolvidos
para a transformação da E. coli. Com isso, se pode acompanhar a sequência do
processo, cuja prática anterior visava a obtenção do plasmídeo recombinante, o
qual contém ou não o inserto de interesse, e na continuidade agora, a
transformação para inserção do vetor, gene que codifica para uma enzima, em
uma célula de E. coli competente.

Foi analisada a importância das diferentes colorações das colônias

presentes nas placas de Petri, sendo que as de cor azulada indicavam o
crescimento da bactéria sem inserto e a branca, por sua vez, a presença do
inserto. Também foram trabalhados os conceitos acerca das funções
desempenhadas pelo antibiótico, do X-gal e do IPTG para a formulação do meio.

Além disso, avaliando os resultados obtidos para as eficiências de

transformação das células de E. coli para cada simulação proposta, é notável
que os resultados se encontram um pouco abaixo do esperado, o qual deveria
ser igual ou superior a 104 UFC/µg DNA. Um dos fatores que podem explicar
esse resultado é pelo uso do choque térmico no processo de transformação,
método que, comparado à eletroporação, possui menor eficiência e assim, uma
pequena parte da população bacteriana é transformada.

VII. Bibliografia

BORZANI, W.; LIMA, V. A.; AQUARONE, E. Biotecnologia: Engenharia

Bioquímica. São Paulo. Ed. Edgard Blucher. 2001.

Conceitos básicos de técnicas em biologia molecular por Liziane Maria de

Lima; Campina Grande, 2008