CITOTOXICIDADE – MTT

Princípio da técnica: o MTT é um composto amarelado e quando em contato com

células viáveis, suas redutases mitocondriais o convertem em formazan, um
composto roxo. Quanto mais roxa a intensidade da reação, maior a absorbância
em 570 nm, maior a viabilidade celular.
Objetivo: Avaliar o efeito citotóxico de substâncias frente à células de mamíferos
Materiais:
 Garrafas de células com 70% de confluência
 Placa de 96 poços estéril
 Meio DMEM
 Soro Fetal Bovino (SBF)
 Antibiótico (ATB)
 Pipetas de 10 e 5 mL descartáveis ou de vidro
 Câmara de Neubauer e lamínula
 Tubos Falcon de 50 e 15 mL estéreis
 MTT
 PBS estéril e não estéril

Procedimento:
1º DIA
 Observar as células no microscópio invertido e verificar confluência
No fluxo:
 Retirar o meio de cultura
 Adicionar 2 mL de PBS (para a retirada de cristais do soro)
 Adicionar 3 mL de tripsina na garrafa e deixar por 45s
 Retirar a tripsina e bater na garrafa para observar o descolamento da
monocamada
 Adicionar 5 mL de meio de cultura DMEM + 10% SBF + 1% ATB
 Deixar 1,0 mL na garrafa e transferir o restante para um tubo falcon
Em um eppendorf:
 Adicionar 88 µL de meio DMEM + 2 µL de corante azul de tripan (cora células
inviáveis) + 10 µL de células (tubo falcon com pool de células ressuspensas)
 Realizar a contagem em câmara de Neubauer
 Na câmara de Neubauer
 “Colar” a lamínula retangular sobre a câmara de Neubauer com água
 Adicionar 10 µL do pool de células diluído em cada lado da câmara
Contar as células em microscópio: Nº de células x fator de correção da câmara
(104) x diluição no eppendorf (10) /8
5
nº de células x 10
8
 Após a contagem, fazer a suspensão de células contendo:
o 2,5 x 105 células/mL
o 10% de soro fetal bovino
o 1% de antibiótico
o Meio DMEM
o Cpool . Vpool = Cfinal . Vfinal; Vpool = 2,5 x 105 x Vfinal/Cpool
 Em uma placa de 96 poços, distribuir 100 µL por poço
 Incubar a placa por 24 h à 37º C com atmosfera de 5% de CO2
2º DIA
Após a incubação:
 Fazer diluições seriadas em eppendorfs da substância a ser testada em DMEM
 Retirar o meio de cultura dos poços
 Adicionar 100 µL das diluições desejadas nos respectivos poços.
OBS: no controle negativo (poços sem tratamento), adicionar 100 µL de meio
sem soro
 Incubar a placa à 37 °C em atmosfera com 5% de CO2 durante 24 h
3º DIA
Leitura: Após o tratamento de 24 h
 Fazer uma solução de MTT (2 mg/ml) em PBS (pesa de acordo com o tanto que
for usar. Ex. Se precisa de 5 ml, pesar 10 mg de MTT e diluir em 5 ml de PBS)
 Retirar o meio DMEM da placa
 Adicionar 50 µL de MTT por poço
 Incubar à 37 °C por 2-4 h
 Após, retirar o MTT e adicionar 150 µL de DMSO (solubilizar o Formazan)
 Realizar a leitura em espectrofotômetro a 570 nm.

Pra cito irradiada colocar 250 microlitros da solução de MTT. Lavar com PBS uma vez
antes de colocar o MTT.