UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

DEPARTAMENTO DE VETERINÁRIA PREVENTIVA

LABORATÓRIO DE DOENÇAS PARASITÁRIAS

TÉCNICAS COPROLÓGICAS

Pelotas, 2012.

Leandro Quintana Nizoli

Sergio Silva da Silva
Tânia Regina Bettin dos Santos
Técnicas coprológicas 2

Técnicas coprológicas

O conhecimento dos diferentes métodos laboratoriais para o diagnóstico

precoce das infestações parasitárias é fundamental, pois estes patógenos
constituem-se em uma das principais causas de perdas, associada à
morbidade e mortalidade elevadas.

Colheita do material
As amostras devem ser colhidas frescas, preferencialmente
diretamente da ampola retal, e conservadas para o transporte até o Laboratório
em caixas isotérmicas com gelo. As amostras de fezes devem ser processadas
o mais rápido possível, e devem ser mantidas sob refrigeração, ou então,
conservadas em solução própria.
Deve ser colhido em torno de 10 g de fezes, ou a quantidade que seja
julgada necessária, na dependência do experimento.
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Técnica de Willis-Mollay

Objetivo
Diagnóstico qualitativo de ovos de helmintos nas fezes de animais
domésticos.

Princípio
Essa técnica se baseia na propriedade que alguns ovos de helmintos
apresentam de flutuarem na superfície de uma solução com densidade
elevada e de aderirem ao vidro. Este procedimento é bastante utilizado, em
amostras de fezes de animais de companhia, já que alguns helmintos
possuem potencial zoonótico.

Material
- Copos plásticos ou de vidro;
- Bastão de vidro;
- Tamis pequeno;
- Copo de Borrel;
- Placa de Petri e lâmina 4x7 cm;
- Solução hipersaturada*
- Microscópio.
 Opções de Solução hipersaturada:
As soluções hipersaturadas podem ser feitas com Cloreto de Sódio
(sal de cozinha) – NaCl a 35%, ou com açúcar a 50%, as quais devem
ter uma densidade de 1.200.

Técnica
1. Utilizando um bastão de vidro, misturar 2-5 g de fezes com
aproximadamente 20 ml de solução hipersaturada, em um copo.
2. Filtrar a suspensão de fezes através de um tamis para outro copo.
3. Colocar a solução de fezes em um copo de Borrel (que deverá estar
dentro de uma placa de Petri) e completar o volume com solução
hipersaturada, até formar um menisco nas bordas do copo.
4. Colocar, com cuidado, uma lâmina 4x7 cm sobre o copo de Borrel,
para que esta entre em contato com o menisco convexo. Não
deverá conter bolhas de ar entre as lâminas e a superfície do
líquido.
5. Deixar o conjunto em repouso por 15 minutos.
6. Remover a lâmina, invertendo a sua posição, rapidamente, para
evitar que escorra a solução.
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7. Colocar a lamínula.
8. Examinar ao microscópio, em objetiva 10X.

Técnica de Gordon & Withlock (modificada)

Esta técnica requer uma lâmina denominada de "Câmara de McMaster".

Objetivo
Diagnóstico qualitativo e quantitativo, onde o resultado é dado em ovos
por grama de fezes (o.p.g.). Essa técnica é mais utilizada para analisar
amostras de fezes de ruminantes, já que a correlação custo-benefício é muito
importante.

Princípio
O princípio da técnica é a flutuação.

Material
- Balança simples para pesar fezes;
- Solução hipersaturada com densidade de 1200;
- Tamis de 80 malhas por polegada;
- Copo ou outros recipientes semelhantes;
- Pipeta de Pasteur com pêra de borracha ou gotejador;
- Câmara de McMaster;
- Contador mecânico (Laboratory counter);
- Microscópio
Medidas da Câmara:
Altura................................1,5 mm
Área de cada câmara.........1,0 cm²
Haverá um volume de 0,15 ml para cada área e um total de 0,3 ml por
câmara.

Técnica
1. Pesar 2g (ovinos) de fezes coletadas diretamente do reto;
2. Colocar as fezes em um copo, acrescentando 58 ml de solução
hipersaturada.
3. Triturar as fezes com um bastão ou fundo de um tubo de ensaio
menor.
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4. Homogeneizar a suspensão fecal com um bastão e tamisar

passando para outro copo.
5. Assim que a solução for tamisada, homogeneizar a solução com a
pipeta e encher a câmara de McMaster, para que os ovos não
comecem a flutuar.
6. Para auxiliar o preenchimento da câmara sem formação de bolhas
de ar devemos umedecê-la (água ou “bafo”).
7. Esperar 1-2 minutos, para realizar a contagem.
8. Examinar ao microscópio, objetiva de 10x. Contar os ovos
encontrados em ambas as áreas, ou seja, 1 cm 3 à esquerda e outro
à direita.

Calculo de O.P.G.:
O total de ovos encontrados na área esquerda mais o total de ovos da
área direita deve ser multiplicado por 100 (fator de correção), dando o
resultado em O.P.G.(Ovos Por Grama de Fezes).
Fator de Correção:
A técnica é executada com 2g de fezes e 58 ml de solução hipersaturada.
O resultado é demonstrado em OPG, logo se fosse utilizado 1g de fezes o total
de solução hipersaturada seria de 29 ml perfazendo um total de 30 ml. Desta
forma, seria examinando a centésima parte de 1 g, pois cada célula da câmara
McMaster contém 0,15 ml, assim são examinados 0,3ml.
Portanto é examinado a centésima parte de uma grama, por isso, o total
de ovos encontrado é multiplicado por 100, quando se trabalha com 2g de
fezes (ovinos).
Seguindo o mesmo raciocínio, quando for utilizado 4g (bovinos e
eqüinos), multiplica-se o resultado da contagem de ovos por 50, pois nesse
caso é examinada a qüinquagésima parte de um grama.
Os ovos de nematódeos gastrintestinais, encontrados devem ser
contados separadamente de acordo com o gênero do parasito, por exemplo,
ovos tipo Strongyloides, Nematodirus, Capillaria, Trichuris, Neoascaris e ovos
da Superfamília Strongyloidea ovos que não podem ser identificados pela sua
forma quanto ao gênero do parasito.
Para bovinos, recomenda-se pesar 4 g de fezes e adicionar 56 ml de
solução hipersaturada, multiplicando por 50 o resultado obtido.
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Técnica de Roberts & O'Sullivan (Coprocultura)

Objetivo

Identificação e contagem de larvas de terceiro estádio de nematóides

gastrintestinais de ruminantes e eqüídeos.

Pré-requisitos
- temperatura
- umidade
- oxigenação

Material
- Recipiente de vidro (250-300 ml) com tampa;
- Placa de Petri;
- Pipetas de Pasteur;
- Tubos de ensaio;
- Pedaços de cordão;
- Água;
- Estufa regulada entre 25 e 28C.
- Serragem lavada e esterilizada*

Opções para a serragem: conteúdo ruminal ou fezes esterilizadas.

*(opcional para coprocultura de ruminantes);

Técnica
1. Fezes coletadas diretamente do reto.
2. Misturar a serragem, na proporção de  duas partes de serragem
para uma de fezes, no gral, com auxílio do pistilo ou bastão,
umedecendo se necessário.
3. Homogeneizar a mistura em recipiente de vidro até  3/4 da sua
capacidade, tampar com a placa de Petri, colocando um pedaço de
cordão entre a tampa ou placa e o bordo, para proporcionar a
aeração.
4. Fezes de ruminantes não diarréicas dispensa o uso de serragem ou
de qualquer outra substância para fazer a coprocultura.
5. Levar a estufa por 7 dias período em que os ovos evoluem para
larvas infectantes.
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Coleta das Larvas Infectantes

Transcorrido o período normal de cultivo:
6. Encher o frasco de cultivo com água morna (+/- 280C) até o bordo.
7. Tampar o frasco com a placa de Petri, invertendo o conjunto
bruscamente.
8. Colocar 5-10 ml de água na placa de Petri.
9. Após 2-4 h, coletar o conteúdo existente na placa de Petri com uma
pipeta, transferindo para o tubo de ensaio, colocar em geladeira.
10. Examinar o sedimento. Agitar o sedimento no tubo de ensaio;
retirar uma amostra com a pipeta e colocar sobre lâmina,
adicionando uma gota de Lugol (para matar as larvas), lamínula e
observar ao microscópio.
11. Proceder a identificação das larvas, que já apresentam as
características do gênero.
12. Características morfológicas a serem levadas em consideração na
identificação das larvas:
- Tamanho das larvas;
- Tamanho da cauda da bainha;
- Forma da região anterior;
- Tipos de cauda das larvas;
- Presença ou não da bainha;
- Tipos de células intestinais.
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Técnica de Dennis, Stone e Swanson (modificada)

Objetivo
Diagnóstico qualitativo e quantitativo (o.p.g.) de ovos de trematódeos
nas fezes de ruminantes.

Princípio
O princípio da técnica é a sedimentação.

Material
- Solução detergente a 10%;
- Copo de plástico;
- Tamis;
- Bastão;
- Cálice de sedimentação;
- Sifão;
- Pipeta de Pasteur;
- Placa de Petri,
- Corante (verde de metila a 0,5% ou tinta de caneta),
- Microscópio,
- Estereomicroscópio.

Técnica
1. Pesar 2 g de fezes, colocar no copo de sedimentação e adicionar
+/- 30 ml de água e 5 gotas de solução detergente.
2. Homogeneizar o conteúdo com o bastão e tamisar passando para o
cálice de sedimentação.
3. Aguardar 10 min. e eliminar o sobrenadante com o sifão.
4. Lavar novamente sem a solução detergente o sedimento,
homogeneizar.
5. Repetir essa operação até o sobrenadante estar limpo.
6. Aguardar novamente 10 min e eliminar o sobrenadante.
7. Colocar 2 ou 3 gotas de corante no sedimento e homogeneizar.
8. Retirar uma amostra do sedimento com a pipeta e colocar sobre a
lâmina, colocar a lamínula e observar no microscópio, para
diagnóstico qualitativo.
9. Para diagnóstico quantitativo (o.p.g.), transferir o sedimento do
cálice aos poucos, para a placa de Petri de fundo riscado em linhas
paralelas.
10. Fazer a contagem dos ovos no estereomicroscópio.
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Obs.: O número total de ovos encontrados será dividido por 2. No caso de

ter sido usado 1 g de fezes (ovinos), o nº total de ovos na placa equivale ao
o.p.g..

Técnica de Girão e Ueno: Quatro Tamises

Objetivo
Diagnóstico qualitativo e quantitativo (o.p.g.) de ovos de trematódeos
nas fezes de ruminantes.

Princípio
O princípio da técnica são tamisação e sedimentação.

Material
- Solução detergente a 10%
- Copo
- Bastão
- Placa de Petri
- Pipeta de Pasteur
- Corante (verde de metila a 0,5% ou tinta de caneta)
- Tamises com telas metálicas de 100, 180, 200 e 250
malhas/polegada, desta forma, a abertura é de 174, 96, 87 e 65 mm,
respectivamente.
- Estereomicroscópio.

Técnica
1. Pesar 2 g de fezes (bovino) ou 1 g (ovino), colocar no copo e
adicionar 30 ml de água da torneira, com 5 gotas de solução
detergente.
2. Homogeneizar o conteúdo com o bastão e após passarem
lentamente no conjunto de tamises dispostos uns sobre os outros.
3. Lavar em água corrente lentamente, descartando-se, um por um,
dos três primeiros tamises, recolhendo-se o material retido no último
tamis (250 malhas/polegada) em uma placa de Petri de fundo
riscado,
4. Completar com água o fundo do tamis invertido, erguendo-o, para
que o material caia na placa de petri.
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5. Adicionar 1 ou 2 gotas de corante (verde metila).

6. Examinar no estereomicroscópio.
Obs.: No caso de ter sido usado 2 g de fezes, dividir o nº total de ovos
por dois. Se usado 1 g, o nº total de ovos na placa equivale ao o.p.g..

Técnica de Baermann

Esta técnica foi desenvolvida originalmente para a coleta de vários tipos

de nematódeos livres no solo, na área de pesquisa agrícola; e foi adaptada
para a área de parasitologia veterinária e humana, com o objetivo de isolar
formas larvais e adultos de helmintos vivos localizados em órgãos ou fezes.

Princípio
O método de Baermann baseia-se no hidrotermotropismo positivo das
larvas como as do parasito Strongyloides stercoralis.

Material
- Funil de vidro (10 cm de diâmetro com um pedaço de tubo de borracha)
e gaze.
- Tamis metálico arredondado de 6 – 8 cm de diâmetro (18-20 malhas /
polegada)
- Tubo de centrífuga e suporte.

Técnica
1. Preparar e fixar o aparelho de Baermann sobre um suporte.
2. Colocar o tamis metálico no funil e colocar gaze dobrada sobre o
tamis.
3. Colocar as fezes acima da gaze.
4. Acrescentar água morna (37-40ºC) até o nível da gaze.
5. Deixar em repouso por 1-2 horas no meio ambiente.
6. Abrir um pouco o interceptor para colocar 3-5 ml de sedimento.
7. Colocar na geladeira por 2-3 horas, para sedimentação completa
das larvas de vermes pulmonares.
8. Retirar o sedimento e colocá-lo na lâmina para observação
microscópica.
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Técnica de Ueno: tubo cônico de centrifuga

O presente método, apesar de não necessitar de equipamento específico

tem boa precisão na detecção de larvas pulmonares.

Princípio
Sedimentação

Material
- Tubo cônico de centrífuga de 10 cm de altura por 3,5 de diâmetro ou
tamanho maior.
- Suporte para tubo.
- Papel filtro, ou tela de papel usada em forro de gola, ou gaze dupla 10
x 10 cm.

Técnica
1. Pesar 2 g de fezes frescas e colocá-las na gaze,
2. Envolver o material fecal, formando um saquinho,
3. Colocar este saquinho dentro do tubo,
4. Acrescentar água morna pelas paredes do tubo até a boca do
mesmo, cobrindo as fezes,
5. Deixar em repouso por uma noite no meio ambiente.
6. Succionar aproximadamente 0,5 ml do precipitado do tubo, sem
agitar,
7. Colocar o sedimento obtido sobre uma lâmina comum e levar ao
microscópio.
O número de larvas encontradas no sedimento é dividido por 2
(quantidade de fezes usadas) e representará o número de larvas por grama
(lpg)
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Método de Faust

Objetivo
Pesquisa de protozoários, ovos e larvas de helmintos.

Princípio
Método de centrífugo-flutuação. Exame microscópio qualitativo direto, após a
concentração de fezes.

Material
- Fezes;
- Água filtrada;
- Sulfato de Zinco a 33%;
- Densidade 1.180;
- Tubos de ensaio;
- Alça de Platina;
- Centrífuga;
- Lâminas e lamínulas;
- Gaze.

Técnica
- Desmanchar 1g de fezes em 10 ml de água filtrada;
- Tamisar através de gaze dobrada em quatro, para um tubo de ensaio,
tampar os tubos com rolha de borracha, sempre que centrifugar;
- Centrifugar a suspensão de fezes a 2.500 rpm, durante 1 minuto;
- Descartar sobrenadante, ressuspender o sedimento em água,
centrifugar novamente, repetir até que fique claro (três lavagens);
- Descartar a água da última lavagem e ressuspender na solução de
sulfato de zinco, centrifugar;
- Com uma alça de platina, remover o líquido para a lâmina (4 ou 5
vezes);
- Adicionar uma gota de lugol;
- Examinar o sedimento entre lâmina e lamínula;
- Observar ao microscópio, objetiva de 10 X várias lâminas de acordo com
a quantidade do sedimento.