Laboratório de Virologia

e de Micologia Clínica
Prática Laboratorial de Virologia e Micologia

Responsável pelo Conteúdo:

Prof. Me. Elias da Rosa Hoffmann

Revisão Textual:
Prof. Me. Claudio Brites

Revisão Técnica:
Prof. Dr.a Niara da Silva Medeiros
a
 Prática Laboratorial de
Virologia e Micologia

• Teste de VDRL – Teste não Treponêmico;

• ELISA Colorimétrico;
• Teste de ELISA Quantitativo;
• Microcultivo em Lâmina;
• Imunodifusão em Meio Ágar;
• Hemaglutinação;
• Zimograma para Fungos.

OBJETIVO DE APRENDIZADO
• Apresentar metodologias para identificação de fungos e vírus, além de novas técnicas utili-
zadas e seu preparo.
UNIDADE Prática Laboratorial de Virologia e Micologia

Teste de VDRL – Teste não Treponêmico

Materiais
• Centrífuga, para separação dos soros;
• Banho-maria, ajustado a 56°C ± 1°C;
• Agitador tipo Kline, com 180 ± 2 rotações por minuto, com amplitude de 2 cm;
• Microscópio com objetiva de 10 aumentos;
• Lâminas ou placas de vidro transparente, com áreas circulares demarcadas com anéis
de 14 mm de diâmetro interno, ou placas com escavações circulares, tipo Kline;
• Tubos de ensaio;
• Pipetas de 1ml em centésimos e de 5 ml em décimos;
• Seringa tipo Luer, de 1 ml ou 2 ml;
• Agulhas calibre 18, sem bisel, fornecendo 60 ± 2 gotas por mililitro. (Adapte a
agulha a uma pipeta ou seringa de 2 ml, graduada, e conte o número de gotas
correspondentes a 1 ml de água ou de solução salina).
• Antígeno VDRL de boa procedência;
• Solução salina tamponada (SST), com pH 6,0 ± 0,1;
• Solução salina a 0,9% – Dissolver 9 g de NaCI em água destilada para 1000 ml.

Procedimentos
Os soros e os reagentes devem estar à temperatura ambiente – a qual, para a realiza-
ção do teste, deverá ficar entre 23 ºC e 29 ºC. Colocar 50µ1 de soro inativado na área
circular da lâmina (esse volume deve ser rigoroso, a partir de pipeta automática de 50
ml ou de pipeta de vidro de 0,1 ml, graduada). Adicionar 1 gota (1/60 ml) da suspensão
antigénica. A rotação deve ser feita por movimentos de báscula à lâmina por 4 minutos
(180 rpm, amplitude 2 cm). Ler imediatamente em microscópio com objetiva 10x e ocu-
lar 10x. Floculações com partículas grandes ou médias correspondem a soros reagen-
tes; pequenas, a soros fracamente reagentes; e partículas antigénicas bem dispersas ou
apenas levemente grosseiras, a soros não reagentes. Ocasionalmente, soros fortemente
reagentes apresentam resultado negativo, em consequência a uma reação de prozona.
Por esse motivo, sempre deve se incluir nos testes diluições de soro a 1:10 em solução
salina, que resultará em reagentes nos casos de reação de prozona.

Testes quantitativos
Preparar diluições dobradas do soro diretamente na lâmina, por adição e transferência
a volumes sucessivos de 50 ml de solução salina, desprezando-se 50 ml da última diluição.
Toma-se como título a última diluição nitidamente reagente (não fracamente reagente).

8
 Figura 1
Fonte: Acervo do conteudista

Para entender melhor assista o vídeo: VDRL – Análises Clínicas, disponivel no

Material Complementar.

ELISA Colorimétrico
O teste a ser realizado é o teste de ELISA colorimétrico qualitativo.

Lembrando que cada teste deve seguir de acordo com a bula do fabricante, então fica
a critério do professor/tutor como conduzir o experimento.

Para entender melhor assista o vídeo: Teste de ELISA(imunologia), disponível no

Material Complementar.

Teste de ELISA Quantitativo

O teste a ser realizado é o teste de ELISA para detecção de anticorpos anti-HBV.
Lembrando que cada teste deve seguir de acordo com a bula do fabricante, então fica a
critério do professor/tutor como conduzir o experimento.

Teste rápido
O teste será realizado o teste de imunocromatografia conhecido como teste rápido.
Lembrando que cada teste deve seguir de acordo com a bula do fabricante, então fica a
critério do professor/tutor como conduzir o experimento

Para entender melhor assista o vídeo: Sífilis - Testes treponêmicos e Testes Rápidos,
disponivel no Material Complementar.

9
9
UNIDADE Prática Laboratorial de Virologia e Micologia

Microcultivo em Lâmina
Objetivo desse experimento é conseguir identificar as estruturas de frutificação
dos fungos.

Material necessário
• Lâminas e lamínulas de microscopia;
• Alças de platina;
• Salina estéril;
• Tinta da China a 50%;
• Bastão de vidro em “U”;
• Placa de petri de vidro;
• Bisturi para cortar o ágar;
• Papel filtro;
• Agar batata.

Procedimentos (lembrando de usar material estéril para essa técnica)

1. Colocar o papel filtro na base da placa de petri;
2. Colocar o bastão de vidro em U acima;
3. Lâmina de micscopia em cima do bastão;
4. Cortar um cubo fino de ágar batata e colocar em cima da lâmina de microscopia;
5. Semear com a alça de platina em linha o fungo de interesse;
6. Após, cobrir o cubo de ágar batata já semeado com uma lamínula;
7. Gotejar 1-2 ml de salina estéril no papel filme sem encostar no meio (deixando
um ambiente úmido);
8. Deixar incubar a 25-30 ˚C por 24-48 horas no máximo cinco dias;
9. Após a incubação em outra lâmina, colocar uma gota de corante azul de lacto-
fenol-algodão;
10. Retirar com cuidado e com o auxílio de uma pinça a lamínula e colocar em
cima da lâmina com uma gota do corante azul de lactofenol-algodão;
11. Visualizar as estruturas de frutificação no microscópio e classificar os fungos.

Como deve ficar disposta a lâmina para o microcultivo:

10
 Técnica de microcultivo para análise microscópica de fungos filamentosos

Lâmina Bastão de vidro

Lamínula 4 inóculos de fungo nas

laterais do cubo
Cubo de Água estéril sobre
ágar papel de filtro

Figura 2 – Técnica de microcultivo para análise microscópica de fungos filamentosos

Para entender melhor assista o vídeo: Microcultivo, disponivel no Material Complementar.

Imunodifusão em Meio Ágar

Técnica se baseia na imunodifusão simples para a presença de anticorpos contra um
antígeno específico.

Material necessário
• Placa de Petri;
• Agarose 0,5-1,5%;
• Antígeno comercial de escolha;
• Microtubos de Duran.

Procedimentos (lembrando de usar material estéril para essa técnica)

1. Colocar a agarose 0,5-1,5% preenchendo o fundo da placa de petri (~5 cm);
2. Com os microtubos de Duran, fazer dois poços na agarose com a distância de
aproximadamente 1,5 cm;
3. Dispensar 40 µl do antígeno em um dos poços;
4. Dispensar 40 µl do soro do paciente no outro poço, não sendo o poço com
antígeno;
5. Incubar 24-48 horas a 37 ˚C;
6. Após o tempo de incubação, observar se apresenta uma linha de precipitação
entre os dois poços. Caso tenha a linha, positivo para a presença de anticorpos;
se não tiver a linha de precipitação, é negativo para a presença de anticorpos.

11
11
UNIDADE Prática Laboratorial de Virologia e Micologia

Anticorpo Antigeno

Agarose Precipitado
Figura 3

Para entender melhor assista o vídeo: Agar gel immunodiffusion assay (AGID), disponivel
no Material Complementar.

Hemaglutinação
O teste será realizado de hemaglutinação para presença de um patógeno ou não.
Lembrando que cada teste deve seguir de acordo com a bula do fabricante, então fica a
critério do professor/tutor como conduzir o experimento.

Para entender melhor assista o vídeo: Semana 1 Micro Ensaios de Hemaglutinação Parte 2,
disponivel no Material Complementar.

Zimograma para Fungos

Para montar o teste de Zimograma para fungos, são necessários alguns tubos específi-
cos contendo o açúcar específico (glicose, sacarose, maltose, lactose, rafinose ou trealose).

Materiais necessários
• Tubo com o meio semissólido do açúcar escolhido;
• Tubos de Durhan;
• Alça de platina para semear.

12
Procedimentos
1. Selecionar a cultura que será utilizada para a identificação;
2. Pegar com alça estéril uma porção e homogeneizar no meio dentro do tubo,
cuidando para não virar o tubo de Durhan que estará dentro;
3. Incubar por 15 dias à 25˚C;
4. Observar se houve aparecimento de bolhas no tubo. Se apareceram bolhas, é
positivo para o açúcar do tubo; já se não tiver bolhas, é negativo.

Figura 4
Fonte: Acervo do conteudista

13
13
UNIDADE Prática Laboratorial de Virologia e Micologia

Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:

 Vídeos
Teste de ELISA (imunologia)
https://youtu.be/cke94OREOnc
VDRL – Análises Clínicas
https://youtu.be/Tlwrl_iIqao
Sífilis – Testes treponêmicos e Testes Rápidos
https://youtu.be/oBkKt8Gj_j4
Microcultivo
https://youtu.be/o35Zm2aM7NE
Agar gel immunodiffusion assay (AGID)
https://youtu.be/oYnXeAPieN0
Semana 1 Micro Ensaios de Hemaglutinação Parte 2
https://youtu.be/NlSUO_S_vRQ

14
Referências
BRASIL. Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Microbiologia – Mod. 7
Micologia – Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. 2004.

MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S.; PFALLER, M. A. Microbiologia médica. 6. ed.

Rio de Janeiro: Elsevier, 2009, c2010.

TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 6. ed. São Paulo: Atheneu, 2015

15
15