Unidade 2 | Seção 3

Roteiro
Aula Prática

Higiene e
microbiologia dos
alimentos
 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA
NOME DA DISCIPLINA: Higiene e microbiologia dos alimentos
Unidade 2
Seção 2.3

OBJETIVOS
Definição dos objetivos da aula prática:
 Aprender e desenvolver o diagnóstico microbiológico do gênero Staphylococcus
e Streptococcus.

INFRAESTRUTURA
Instalações:
Esta aula prática é realizada no Laboratório Multidisciplinar.

Materiais de consumo:
Descrição
ÁGAR BAIRD PARKER
ÁGAR TRIPTONA SOJA
ÁGUA OXIGENADA 3% - 100 ML
ALÇA DE DRIGALSKI DE VIDRO
ALÇA PLATINA COM CABO 5CMX0.5MM
BANHO MARIA ISOLAMENTO TÉRMICO COM TAMPA
BICO DE BÜNSEN COM REGISTRO
CALDO CEREBRO CORACAO (BHI)
CLORETO DE SÓDIO P.A.
COAGULO PLASMA (KIT)
CULTURA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
LAMÍNULA DE VIDRO (24 X 24 MM)

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 MICROPIPETA VARIAVEL 100-1000UL
PIPETA GRADUADA EM VIDRO - 1 ML
PIPETA PASTEUR EM VIDRO - 1ML
PLACA DE PETRI VIDRO AUTOCLAVÁVEL (100 X 15 MM)
PONTEIRAS COM FILTRO PARA MICROPIPETA 100 - 1000 MICRO LITRO
SORO FISIOLÓGICO 0,9% 10 ML
TUBO DE ENSAIO EM VIDRO (16X150MM) - 23 ML

Software:
Sim ( ) Não ( X )
Em caso afirmativo, qual?
Pago ( ) Não Pago ( )
Tipo de Licença: NSA.

Descrição do software:
NSA

Equipamento de Proteção Individual (EPI):

Jaleco
Óculos de proteção
Sapato fechado e sem salto
Máscaras
Luvas
Retirar brincos e adornos pessoais

PROCEDIMENTOS PRÁTICOS

Procedimento/Atividade n.1
Procedimento/Atividade n.1
Contagem de Staphylococcus aureus em amostra de leite para o consumo

Procedimentos para a realização da atividade:

1ª Parte – Diluição da amostra: Realizar o procedimento de diluições seriadas
• Transfira assepticamente uma alíquota de 1 ml da amostra para 9 ml de diluente
(solução salina 0,9% ou soro fisiológico), obtendo a solução 10-1.
• Transfira 1 ml da diluição 10-1 para 9 ml de diluente, obtendo a solução 10-2.
• Realize o mesmo para as soluções posteriores 10-3 e 10-4.

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 2ª Parte - Método: Por contagem direta em placa
• Inocule, nas de placas de ágar (BP), 1 ml de cada diluição da amostra do alimento
realizada anteriormente, espalhando o inóculo com uma alça de drigalski por toda a
sua superfície até total absorção do líquido. Esta é a técnica de semeadura em
superfície ou spread-plate.
• Incube as placas invertidas em estufa a 37º C / 48h.
• Conte as colônias de S. aureus, típicas, e selecione as placas que tenha entre 20 a
200 colônias. As características das colônias típicas são: negras, brilhantes, com anel
opaco, rodeado por um halo claro transparente, em UFC g/L, utilizadas para a
contagem.
• Selecione de 3 a 5 colônias típicas.
• Repique-as para tubos contendo caldo BHI.
• Emulsione bem a massa de células e em seguida transfira uma alçada para um tubo
com Ágar TSA inclinado.
• Incube os meios a 35°C / 24 horas.
Observação: Do cultivo crescido no caldo BHI – realizar a prova bioquímica da
Coagulase.
Do cultivo crescido no Ágar TSA – realizar a prova da Catalase.

3ª Parte – Prova da coagulase:

• Transfira 300 μL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis contendo 0,5 mL
de plasma de coelho.
• Incube a 35° por 6 horas.
• Verifique a presença de coágulos, considerando os critérios a seguir:
• Reação negativa: não formação de coágulo.
• Reação 1+: coágulo menor e desorganizado.
• Reação 2+: coágulo menor e organizado.
• Reação 3+: coágulo maior e organizado.
• Reação 4+: coagulação de todo o conteúdo do tubo e não se desprende mesmo que
o tubo for invertido.
• Se o resultado da reação de coagulação for do tipo 3+ e 4+, é positivo para
Staphylococcus aureus.

4ª Parte – Prova da catalase

• Prepare a lâmina de vidro ou a placa de vidro contendo 3 gotas de peróxido de
hidrogênio (água oxigenada) (H2O2) a 3%.
• Retire uma alíquota do cultivo em ágar TSA, com o auxílio de uma alça de platina, e
transfira para uma lâmina de vidro.

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 • Misture bem o inóculo ao peróxido e observe a reação.
• A formação de bolhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus
é catalase positiva.
• A não formação de bolhas indica prova negativa para catalase.

Checklist:
- Esterilizar os materiais a serem utilizados na aula com antecedência.
- Preparar os meios de cultura com 48 horas de antecedência, manter em estufa a 35º
C para constatar a esterilidade.
- Preparar as culturas de microrganismos com 48 horas de antecedência e verificar o
crescimento após 24h.
- Preparar as soluções com antecedência e em volume suficiente para todos os grupos.
- Orientar os alunos para visualização do resultado após 48h. A aula será realizada em
dois momentos e, portanto, os alunos devem observar o resultado em até 48 horas para
realizar o segundo procedimento.
- Formação dos grupos – 5 pessoas.

RESULTADOS
Resultados da aula prática:
A contagem de S. aureus em alimentos envolve dois objetivos: 1 – saúde pública, nos
casos de surto de intoxicação alimentar; 2 − controle de qualidade higiênico-sanitária
dos processos de produção de alimentos, pois o S. aureus serve como indicador de
contaminação pós-processo ou das condições sanitárias do local de trabalho.