UFGD- UNIVERSIDADE FEDERAL DA GRANDE DOURADOS

FAEN- FACULDADE DAS ENGENHARIAS

Engenharia de Alimentos

Determinação de Coliformes Totais, Termotolerantes e

Contagem Padrão de Bactérias Mesófilas em Amostra de
Leite Tipo C

Acadêmicos: Camila Quirino e Thalita Santos

Dourados MS
Abril de 2014
 UFGD- UNIVERSIDADE FEDERAL DA GRANDE DOURADOS
FAEN- FACULDADE DAS ENGENHARIAS
Engenharia de Alimentos

Determinação de Coliformes Totais, Termotolerantes e

Contagem Padrão de Bactérias Mesófilas em Amostra de
Leite Tipo C

Acadêmicos: Camila Quirino e Thalita Santos

Relatório do Experimento da Disciplina

Microbiologia de Alimentos;
Universidade Federal da Grande
Dourados, Faculdade de Engenharia;
Turma p2, 2014/4;

Profa. Cristina Tostes Filgueiras.

Dourados MS
Abril de 2014
Introdução

Coliformes totais é a denominação dada ao grupo de bactérias gram-negativas na

forma de bastonetes, não esporogênicas, aeróbios ou aeróbios facultativos, que
realizam a fermentação da lactose em período de 24 a 48h em temperatura de 35 oC.
Dentre estas, há o subgrupo de bactérias denominadas coliformes fecais, capazes de
realizar a fermentação da lactose num período de 24h a temperatura de 44,5 oC a
45,5oC. Devido a sua capacidade de realizar a fermentação nestas temperaturas,
também são chamadas de termotolerantes.

Estas bactérias vivem no trato intestinal de animais de sangue quente, incluso o

homem. Por serem eliminadas em grande quantidade nas fezes, o valor de coliformes
fecais serve como indicador de qualidade da água ou de alimento, pois sinaliza o
quanto, ou se houve, contato com fezes humanas ou de algum outro animal. Estas
bactérias por si só não representam grande risco na maioria das vezes, mas indicam a
presença de alimento de má qualidade que pode conter agentes nocivos.

Os coliformes termotolerantes vivem em simbiose com o homem, agindo na

degradação da lactose no intestino e gerando dióxido de carbono, entre outros gases
que compõem o flato. Só irão apresentar risco a saúde quando presentes em outras
regiões do corpo. Cada organismo já apresenta resistência necessária para a
convivência com seus coliformes fecais, podendo apenas ser intoxicado por coliformes
fecais de estirpe diferente, estirpe essa determinada principalmente pelo fator
geográfico.

O leite pode ser classificado em três tipos diferentes quanto a sua qualidade e forma de
produção. Sendo esses, do tipo A, B e C. O leito do tipo A é um leite de excelente
qualidade microbiológica e pode ser consumido, desde que resfriado e armazenado
corretamente, de 5 dias a 7 dias após a pasteurização. O leite Tipo A não pode ser
transportado cru, e por isso, tem que ser pasteurizado e embalado na própria fazenda.
A legislação brasileira só permite a produção do leite Tipo A integral (teor de gordura
5,6%), ou seja que não é retirado nenhuma parte da gordura. Não existe leite Tipo A
desnatado ou semi desnatado, cujo teor de gordura é de menos 0,5% e 0,2%
respectivamente. O leite do tipo B é um leite de boa qualidade. Porém a contagem de
microrganismos no momento da pasteurização se encontra em níveis mais elevados,
pelo menor controle da higiene na produção e na refrigeração. Há um maior intervalo
entre a ordenha (na fazenda) e a pasteurização (nos laticínios). O leite tipo B, também
só é encontrado na forma integral. Já o leite do tipo C é um leite de baixa qualidade,
inclusive, com modificação no sabor pelo elevado número de bactérias antes da
pasteurização, pois o leite é entregue na plataforma dos laticínios na temperatura
ambiente. E a consequência é uma vida de prateleira muito curta, menos que 3 dias.
Alguns cientistas da área de alimentação não recomendam o consumo desse leite.

A aula pratica tem o objetivo de identificar Coliformes Totais, Termotolerantes e

Contagem Padrão de Bactérias Mesófilas em Amostra de Leite Tipo C. A técnica
utilizada se divide em três etapas, uma prova presuntiva para coliformes totais, seguida
de uma prova confirmativa para coliformes totais e outra confirmativa para coliformes
termotolerantes. A prova presuntiva é realizada em caldo de Lauril Sulfato triptose,
contendo lactose. A presença do surfactante inibe o crescimento da membrana
citoplasmática de bactérias gram-positivas e a presença da lactose viabiliza a
fermentação, que libera gás carbônico evidente no tubo de Durham.

Os tubos que apresentarem formação gasosa são inoculados em caldo verde brilhante
bile e incubados a 35oC por 48 horas. A confirmação vem com nova formação de
dióxido de carbono. A seletividade do meio vem da presença de bile bovina e de um
corante derivado do trifenilmetano, que inibe as bactérias gram-positivas.

A prova confirmativa para coliformes termotolerantes é realizada com a inoculação dos

tubos positivos da prova presuntiva em caldo EC e incubação a cerca de 44 oC por 24
horas em banho-maria. Este caldo possui uma mistura de fosfatos, que mantém o pH
do meio em valor adequado. A seletividade do meio se deve aos sais biliares, que
inibem o crescimento de microrganismos gram-positivos. Se houve formação gasosa
nestas condições, há a confirmação de coliformes termotolerantes.
Materiais e Métodos

Materiais:

 Câmara microbiológica  Pipeta

 Becker  Placa de Petri

 Álcool 70  Microscópio

 Faca  Caldo Lauril Sulfato de Triptose

 Tubo de ensaio  Caldo Verde Bile Brilhante

 Tubo de Durhan  Caldo Escherichia Coli

 Tampão de algodão  Cristal Violeta

 Lâmina  Lugol

 Grade de tubos  Álcool-acetona

 Bico de bunsen  Fucsina

 Alça de platina  Leite tipo C

 Alça de Drigalski
 Metodologia

1. Determinação de Coliformes Totais e Termotolerantes:

Primeiramente, é feita a esterilização da câmara microbiológica com raio UV durante 5

minutos. Logo após, lava-se o saquinho de leite Tipo C da marca Cambi, com água
corrente e sabão, e higieniza-o com álcool 70. Dentro da câmara microbiológica flamba-
se a faca para abrir o saquinho, e com o auxílio da ponteira pipeta-se 1000 µL de leite e
adiciona-o ao tubo de ensaio contendo o caldo Lauril Sulfato de Triptose. Por fim agita-
se o tubo de ensaio e leva-os a estufa a 35°C por 48 horas. Realizar esse procedimento
para um total de nove tubos, separados em três series, com concentrações diferentes
de amostra. Sendo assim, três tubos com 1000 µL, três tubos com 100 µL e três tubos
com 10 µL.

A segunda etapa, segue-se da análise dos tubos que deram positivos para a formação
de gás carbônico. Dessa forma, dentro da câmara microbiológica, flamba-se a alça de
platina, esfriando-a nas paredes do tubo de ensaio, e em seguida a mergulha no tubo
da amostra positiva, flamba-se o tubo antes de fechá-lo, e assim transfere-se os
microrganismos presentes na alça de repicagem para o tubo contendo o caldo Verde
Bile Brilhante. Por fim agita-se o tubo de ensaio levando-o a estufa a 35°C por 48 horas.
Esse procedimento é feito em uma série de três tubos de ensaios.

A terceira etapa, é feita com as mesmas amostras positivas do Caldo Lauril Sulfato de
Triptose, porém diferente da segunda etapa, os microrganismos serão inoculados em
tubos de ensaios contendo o Caldo Escherichia Coli e levados a estufa a 44ºC por 24
horas. Esse procedimento também é feito em uma série de três tubos de ensaios.

2. Contagem Padrão de Bactérias Aeróbias Mesófilas:

Para a contagem padrão de bactérias mesófilas é feita a diluição da amostra de leite

tipo C em água peptonada, em tubos de ensaio com diluição de 10 -1, 10-2, 10-3, 10-5, 10-
, 10-8. Em seguida pipeta-se 100 µL de cada diluição e coloca-se em pingos em todo o
7
ágar de PCA, flamba-se a alça de drigalski e espalha-se a amostra por toda a placa
levando-a a estufa a 35°C por 48 horas.

Após a obtenção dos resultados da contagem de colônias, deve-se fazer a coloração de

gram para a análise microscópica. Assim, as colônias presentes na placa, são
transferidas para a lâmina onde é feito o esfregaço com o auxílio da alça de repicagem
e uma gota de água, e feita a fixação utilizando-se o bico de Bunsen. Em seguida, a
lamina é lavada com Cristal Violeta por 1 minuto e enxague em agua corrente, Lugol
por 1 minuto e enxague em agua corrente, em seguida lava-se com alcool-acetona e
enxague em agua corrente, e por fim lava-se com fucsina por 30 segundos e enxague
em agua corrente. Dessa forma a lamina está pronta para ser levada ao microscópio.

Resultados e Discussões

Resultados de microrganismos no Caldo LST:

Tubos Microrganismos

3 tubos de 1000 µL Presente

3 tubos de 100 µL Ausente

3 tubos de 10 µL Ausente

Tabela 1: Presença de microrganismos no Caldo LST

Foi possível notar a presença de microrganismos que realizam a fermentação da

lactose em período de 48h em temperatura de 35 oC, apenas nos três tubos de ensaio
que continha 1000 µL da amostra.

Após o resultado positivo para as amostras o tubo de 1000 µL, os microrganismos

foram retirados com auxílio da alça de repicagem e transferidos para 3 tubos de Caldo
Vede Bile Brilhante, para a verificação de Coliformes Totais e para 3 tubos de Caldo EC,
para a verificação de Coliformes Termotolerantes.
Resultado de microrganismos no Caldo Verde Bile Brilhante:

Tubos Microrganismos

1000 µL Ausente

1000 µL Ausente

1000 µL Ausente

Tabela 2: Presença de microrganismos no Caldo Verde Bile Brilhante

Resultado de microrganismos no Caldo EC:

Tubos Microrganismos

1000 µL Ausente

1000 µL Ausente

1000 µL Ausente

Tabela 3: Presença de microrganismos no Caldo EC

Dados de acordo com a legislação:

Legislação

Coliformes N= 5 C= 2 m= 2 M= 4
Totais

Coliformes N= 5 C= 1 m= 1 M= 2
Termotolerantes

Tabela 4: Legislação para Coliformes totais e termotolerantes no leite

Fonte: http://www.anvisa.gov.br/alimentos/legis/especifica/aditivos.htm
Assim, de acordo com as tabelas 2 e 3 e com a Legislação brasileira não houve a
presença de Coliformes totais e Coliformes termotolerantes na amostra do leite tipo

Resultados da Contagem Padrão de Bactérias Aeróbias Mesófilas:

                     

                                      10-1            Muitas colônias

                     

                                      10-2            Muitas colônias

   

                                      10-3            Colônias razoáveis

                                                                       

                                      10-5            Nenhuma colônia

                   

                                      10-7            Nenhuma colônia

                   

                                      10-8            Nenhuma colônia

Figura 1: Imagem ilustrativa da Contagem Padrão de Bactérias Mesófilas

Assim, de acordo com os resultados da contagem padrão de bactérias mesófilas, é
possível observar, que a placa utilizada para contagem, foi a placa 10 -3, com um total de
133 colônias.

NC x FD
UFC/mL= al í quota

Legislação

Aeróbias N= 5 C= 2 m= 1x105 M= 3x105

Mesófilas

Tabela 5: Legislação para bactérias aeróbias mesófilas no leite

Fonte: http://www.anvisa.gov.br/alimentos/legis/especifica/aditivos.htm

NC x FD
UFC/mL= al í quota

1
133 x
UFC/mL= 0,00 1
0,1

UFC/mL= 133 x 104

UFC/mL= 1,33 x 106 ou 13,3 x 105

Utilizando a formula de unidades formadoras de colônias e consultando a legislação, o

resultado para bactérias aeróbias mesófilas encontra-se alterada para a amostra
utilizada nas análises, pois o valor de UFC/mL encontrado foi maior que o valor máximo
tabelado pela legislação.

A partir do estudo das laminas de coloração gram, observou-se que as bactérias

aeróbia mesófilas encontradas são da forma coccus e gram-positivas.

Imagem 2: Imagem de microscópio de bactérias aeróbias mesófilas

Conclusão
Logo, com o término das análises experimentais, observa-se que embora o leite
utilizado tenha sido do tipo C, considerado de baixa qualidade e com maior
probabilidade de contaminação, não houve a presença de Coliformes totais e
Coliformes termotolerantes, porém identificou-se uma concentração maior do que a
permitida pela legislação, de bactérias aeróbias mesófilas na amostra.

A presença de bactérias aeróbias mesófilas e a ausência de Coliformes Totais e

termotolerantes, pode ter sido causada pela variação das amostras utilizadas, que
possivelmente pertenciam a lotes diferentes, influenciando assim nos resultados das
análises finais. Sobretudo como trata-se apenas de uma aula didática, não é possível
condenar um tipo ou uma marca de leite.
Revisão Bibliográfica

Site Ebah
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAYjQAK/determinacao-coliformes-totais-
termotolerantes-amostra-queijo

Site Sitio do Cedro

http://www.sitiodocedro.com.br/conteudo/ver/id/307

Site Ciência do Leite

 http://cienciadoleite.com.br/?action=1&type=1&a=48

Site Anvisa
http://www.anvisa.gov.br/alimentos/legis/especifica/aditivos.htm