Determinação de Coliformes Totais e Fecais

 As águas de abastecimento apresentam o risco

de serem poluídas por águas residuárias e
excretos de origem humana ou animal
podendo, desta forma, conter organismos
patogênicos, tornando-se assim um veículo de
transmissão de doenças. Por isso, impõe-se a
necessidade de exames rotineiros das mesmas,
para determinar seu grau de segurança do
ponto de vista bacteriológico.
 A qualidade de uma água de abastecimento é
avaliada usando organismos indicadores. A
probabilidade de existência das doenças na
água passadas a ela por fezes do indivíduos
doentes, se faz por contagem de
microorganismos não patogênicos, produzidos
em grande numero no intestino, sendo uma
referência, ao invés de uma contagem
verdadeira de patógenos, mais difíceis de
identificar. Os organismos usados como
referência pertencem a um grupo de bactérias
chamados Coliformes dividido em dois sub-
grupos: coliformes totais, coliformes fecais.
 Definições
 Coliformes Totais: O grupo de Coliformes totais
inclue as bactérias na forma de bastonetes Gram
Negativos, não esporogênicos, aeróbios ou
anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a
lactose
 Coliformes Fecais:
 N.M.P. – Número mais provável é a estimativa
da densidade de bactérias em uma amostra,
calculada a partir da combinação de resultados
positivos e negativos, obtidos mediante a
aplicação da técnica dos tubos múltiplos.

 C.L.T. - Caldo Lauril Triptose: meio de

enriquecimento para bactérias do grupo
coliforme, em que o lauril-sulfato de sódio atua
como agente seletivo, com supressão do
crescimento de bactérias esporuladas
produtoras de gás, reduzindo a ocorrência de
resultados falso-positivos no ensaio presuntivo
para detecção de coliformes.
 C.L.V.B.B. - Caldo lactosado verde brilhante
bile 2% é um meio seletivo em que se obtém
inibição de bactérias Gram-positivas e de
esporos fermentadores da lactose, permitindo
um bom desenvolvimento de bactérias do
grupo coliforme.

 E.C. - Meio seletivo para detecção de coliforme

fecal, em que os sais biliares inibem o
crescimento de formas esporuladas e de
bactérias gram-positivas. A incubação a 44,5 
0,5ºC impede o desenvolvimento de coliformes
que não são de origem fecal.
 Esporos - São estruturas especializadas que se formam
em certas bactérias, sob condições de nutrição
inadequadas. Os esporos não apresentam atividade
metabólica e são muito mais resistentes aos efeitos do
calor, dessecação, congelamento, drogas deletérias e
radiações, que as próprias células formam. Ocorrem em
bactérias da família Bacillacene (gênero Bacillus,
Sporolactobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum e
Sporosarcina) e no gênero Oscillospira.

 Bacilo - Designação dada às bactérias que apresentam

forma cilíndrica.
Técnica Tubos Múltiplos - É utilizada para
determinação do NMP de bactérias em uma dada
amostra. Está técnica consiste na inoculação de
volumes decrescente da amostra (diluições
decimais consecutivas) em meio de cultura
adequada, sendo que cada volume é inoculado em
série de 5 tubos.

Coloração de Gram - Coloração diferencial,

através da qual as bactérias são classificadas em
Gram-positivas, dependendo da retenção ou não
de corante cristal-violeta.
 Principios:

A razão da escolha desse grupo de bactérias como

indicador de contaminação da água deve-se aos
seguintes fatores:
 Estão presentes nas fezes de animais de sangue
quente, inclusive os seres humanos;
 Sua presença na água possui uma relação
direta com o grau de contaminação fecal.
 São facilmente detectáveis e quantificáveis por
técnicas simples e economicamente e viáveis,
em qualquer tipo de água;
 São mais recistentes à ação dos agentes
desinfetantes do que os germes patogênicos.
 Preservação da Amostra
 Adicionar 0,1mL de solução de tiossulfato de
sódio a 10% por 100mL de amostra, para
possível interferência de cloro residual e 0,3mL
de EDTA a 15% por 100mL de amostra, para
possível interferência de metais pesados.
 Colocar uma tira de papel alumínio entre a
boca e a tampa do frasco;
 Envolver a boca e tampam do frasco em papel
alumínio
 Autoclavar durante 15 minutos em
temperatura estável de 121ºC.
 Após a coleta, os frascos devem ser etiquetados
com todas as informações sobre a amostra
(número da amostra, data, ponto de amostragem,
hora da coleta e outras informações necessárias
para que os resultados possam ser interpretados
corretamente).
 Após a coleta, a amostra deve ser entregue
imediatamente ao laboratório.
 O tempo máximo recomendado entre a coleta e o
início da inoculação deve ser de 8 horas.
 Quando não for possível iniciar a inoculação no
tempo limite recomendado, manter a amostra em
temperatura a 4ºC no tempo máximo de 24 horas.
 Coleta de amostra
 Colete as amostras em frasco de borossilicato (pirex)
ou plástico autoclavável, previamente esterilizado
contendo os agentes adequados para preservação da
amostra.
 Lavar as mãos com água e sabão e em seguida colocar
luvas anti-germicidas;
 Limpar a torneira do usuário com um pedaço de
algodão embebido em álcool;
 Abrir a torneira e deixar escorrer a água durante 5 à 6
minutos;
 Flambar a torneira;
 Coletar a amostra de água;
 Encher pelo menos 34 de seu volume;
 Procedimento
Aparelhagem:
 Estufa de esterilização e secagem - deve ser
equipada com um termômetro e um termostato
e operar normalmente a uma temperatura de
170ºC - 180ºC. O tempo de esterilização para a
maior parte das vidrarias é de 2 horas.

 Autoclave - deve ter tamanho suficiente para

permitir a circulação do vapor ao redor do
material a ser esterilizado. Deve ser equipada
com válvula de segurança, com um manômetro,
cujo bulbo ficará na direção da linha de escape
do vapor condensado (dreno).
 É normalmente operada a uma pressão de
vapor de 15 libras por polegada quadrada,
produzindo, em seu interior, uma temperatura
de 121,6ºC ao nível do mar.
 Deve-se observar, em seu funcionamento, a
substituição por vapor de todo o ar existente na
câmara. A operação total de uma autoclave
deve durar no máximo uma hora, sendo
recomendado o acompanhamento dos ciclos de
operação e os registros de tempo-temperatura.
É recomendável que a autoclave atinja a
temperatura de esterilização de 121ºC em 30
minutos e mantenha essa temperatura durante
o período de esterilização.
 Incubadora bacteriológica - Deve ser equipada com
termostato e projetada de tal forma que a temperatura
em todas as partes utilizadas seja 35  1ºC, com
capacidade suficiente para permitir a circulação do ar ao
redor de todas as culturas, quando o material de
trabalho estiver sendo incubado.
 Balança - Com sensibilidade de, no mínimo, 0,1 ao pesar
150g.
 Frasco para coleta de amostras - Capacidade mínima de
125mL, com boca larga e tampa a prova de vazamento.
 Pipetas tipo Mohr - capacidades 5 e 10mL, com
graduação de 1/10 e erro de calibração inferior a 2,5% e
com bocal para tampão de algodão. É guardado ser
embrulhadas individualmente em papel alumínio. São
esterilizadas por calor seco a 170-180ºC, durante duas
horas.
 Bico de Bunsen ou similar
 Tubos de Ensaio - 18 mm x 180 mm, 16 mm x 150
mm e de 12 mm x 120 mm.
 Placas de Petri - devem ser de borossilicato
(pyrex) ou vidro neutro de boa qualidade, com
fundo perfeitamente plano, sem ranhuras e bolhas
de ar, com 15mm de altura x 100m de diâmetro.
 Tubos de Durham - devem ser de borossilicato
(pyrex) ou vidro neutro, com diâmetro não inferior
a 40% do diâmetro do tubo de ensaio em cujo
interior serão utilizados. Usualmente são
empregados tubos de Durham de 7mm x 45mm
(para tubos de ensaio de 18mm x 180mm e 16mm x
150mm) e de 5mm x 40mm (para tubos de ensaio
de 12mm x 120mm).
 Reagentes
Acetona
Agar
álcool etílico a 70%
Azul de metileno
Cloreto de magnésio ( MgCl2 ) p.a.
Cristal violeta
EDTA (ácido etileno diamino tetra-acético) p.a.
Fosfato dipotássio ( K2HP04 ) p.a.
Lauril sulfato de sódio
Oxalato de amônia hidratado
Tiossulfato de sódio (Na2S203) p.a.
Verde brilhante
 Meios de Cultura Desidratados

 Lactose Broth (caldo lactosado)

 Lauril Tryptose Broth (Caldo Lauril Triptose)
 Brilliant Green Bile Broth (caldo lactosado
verde brilhante bile a 2%)
 E.C. Medium “(Meio EC)”.
 Nutriente Agar (Agar nutriente).
 Água de Diluição

 Solução estoque A
 Fórmula:
 Fosfato monopotássico...34,0g
 Água ultrapurificada.......1000,0mL

 Solução Estoque B
 Fórmula:
 MgS04.7H20..............50g
 Cloreto de magnésio......38g
 Água ultrapurificada........1000mL
 Fórmula:

 Solução estoque A.......1,25ml

 Solução estoque B........5,00ml
 Água ultrapurificada...1000,0mL
 Preparação da Amostra
 Preparar os tubos de caldo Lalryl exigidos para a
prova e dispô-los em estante em fileiras de 5 tubos.
Para as inoculações das provas de 10mL da amostra,
usar o caldo Lalryl em concentração dupla.
 Proceder à marcação dos tubos que deve conter o
nome do cliente, o volume selecionado da amostra a ser
inoculada e a data. Esta marcação poderá ser feita
somente no primeiro tubo à direita na primeira fileira.
Nos primeiros tubos das fileiras seguintes, pode-se
simplificar a marcação, colocando apenas o volume da
amostra a ser inoculado. Identificar, também, os
frascos de água de diluição.
 Homogeneizar a amostra no mínimo 25 vezes,
inclinando o frasco, formando um ângulo de,
aproximadamente, 45º entre o braço e antebraço.
 Com a mesma pipeta, semear 10mL da amostra em
cada um dos tubos de caldo Lalryl de concentração
dupla, quando este volume for requerido para o teste.

 Inocular 1mL da amostra em cada um dos cinco tubos

correspondentes a essa quantidade de inoculo.
 Inocular 1mL da primeira diluição decimal (10-1) em
cada um dos cinco tubos

 Proceder dessa maneira nas seqüências de diluição

desejada (10-3, 10-4, 10-5.......... 10-8..........).

 Ordenar os frascos contendo as diluições, mantendo

seqüência decrescente das mesmas.
 Após a inoculação de todos os volumes da amostra
e/ou das diluições requeridas para o ensaio, colocar
a estante contendo os tubos inoculados em
incubadora a 35 ( 1ºC), durante 24 ( 2 horas).

 Após esse período de incubação, retirar os tubos da

incubadora para efetuar a primeira leitura dos
resultados. Para isso, agitar delicadamente cada
tubo, e examiná-los quanto à produção de gás.
Retirar os tubos com resultado positivo (produção
de qualquer quantidade de gás, retirada no tubo de
Durham) e anotar os resultados. Retornar à
incubadora os tubos com resultado negativo, por
um período adicional de 24( 1 hora).
 A segunda leitura (48  3 horas) será feita nas mesmas
condições, sendo que os tubos de caldo Lalryl com
resultado positivo serão separados e dos negativos serão
agora descartados.
 Para a realização do ensaio confirmativo, todos os tubos
com resultado positivo em caldo Lalryl nas leituras de
24 ( 2 horas) e 48 ( 3 horas) serão submetidos à
confirmação imediatamente após as respectivas leituras.
Como procedimento alternativo, quando várias
diluições semeadas deram resultados positivos, pode-se
submeter à confirmação somente a última série de tubos
correspondentes à maior diluição que apresentou
resultados positivos em todos os tubos em 24 ( 2 horas)
e os tubos positivos das séries seguintes.
 Desprezar as séries seguintes. Desprezar as séries
antecedentes de tubos com resultados positivos,
considerando para as mesmas resultado confirmado
positivo. Todas as culturas com resultado presuntivo
positivo em 48 ( 3 horas) são submetidos à
confirmação.
 Este procedimento alternativo só é aplicável para
amostras de águas poluídas e residuárias em relação às
quais se tem comprovação anterior consistente sobre a
confirmação dos resultados presuntivos positivos.
 O ensaio confirmativo é efetuado utilizando-se o
C.L.V.B.B. para determinação de coliforme totais.
 Confirmação para coliforme em C.L.V.B.B.
 Marcar tubos de C.L.V.B.B. correspondentes,
respectivamente, a cada tubo de C.L.T. (ou C.L.) com
resultados presuntivos positivos.
 Agitar bem cada tubo de C.L.T. (ou C.L.) com
resultado presuntivo positivo e, com uma alça de
níquel-cromo , retirar o material e inocular no tubo
de C.L.V.B.B. correspondente, evitando a película
superficial que pode se formar no C.L.T. (ou C.L.)
presuntivo positivo.
 Incubar todos os tubos de C.L.V.B.B. inoculados
durante 48 ( 3 horas) a 35  1 ºC;
 Proceder à leitura após 48 (  3 horas),
considerando o teste confirmativo positivo para
coliformes totais todos os tubos que apresentarem
formação de gás no tubo de Durham invertido.
Anotar os resultados e calcular o NMP a partir dos
dados obtidos.
 Diferenciação para Coliformes Fecais
 Esta diferenciação é feita a partir dos tubos
positivos de Caldo Lauril Triptose ou Caldo
Lactodaso.
 Efetuar a marcação de tubos de E.C com os
números correspondentes a cada tubo do meio
presuntivo (caldo Lalryl ) em que se verificou
formação de gás;
 Agitar bem cada tubo de C.L.T. (ou C.L.) com
resultado presuntivo positivo e, com uma haste de
madeira estéril ou alça de níquel-cromo, colher um
inóculo da cultura e transferi-lo para o tubo de
E.C. correspondente, evitando a película
superficial que pode se formar na cultura
presuntiva positiva.
 Incubar todos os tubos de E.C., inoculados, no
máximo até 30 minutos após a inoculação, em
banho-maria a 44,5  1ºC.
 Proceder à leitura considerando como resultado
positivo para o teste todos os tubos que
apresentarem formação de gás do tubo de
Durham.
 Com os dados obtidos, calcular o NMP de
coliformes fecais.
 Controle de Qualidade
 Para o teste de controle de esterilidade do meio de
cultura cuja utilização será feita nos ensaios presuntivo e
confirmativo na Técnica de Tubos Múltiplos, bem como
no controle de esterilidade da água de diluição, falhas nos
processos de esterilização e/ou contaminação após
esterilização, proceder da seguinte forma:
 Preparar tubos contendo 10mL do meio de cultura C.L.T
de concentração Dupla e Simples;
 Incubar tubos de C.L.T para teste de esterilidade, dois
para concentração dupla e dois para concentração
simples;
 Incubar dois tubos contendo 10mL de C.L.V.B.B e dois
tubos com 5mL de E.C para teste de esterilidade
(Controle do meio);
 Com uma pipeta estéril de 10mL e obedecendo
aos cuidados de assepsia, semear dois tubos de
C.L.T. de concentração dupla com 10mL da
água de diluição á ser utilizada ;
 Incubar todos os tubos inoculados durante 48
3 horas a 35 1ºC , juntamente com as
amostras a serem analisadas;Após o período de
incubação, efetuar a leitura dos resultados
obtidos e registrar no controle de meio de
cultura.
 Critério de Aceitação

 Os resultados são considerados satisfatórios quando

verificada ausência de crescimento de microrganismo
nos tubos incubados. Se for verificada contaminação
(resultados de culturas positivas) o ensaio deve ser
descartado, e o resultado expresso como “acidente
de Laboratório”, sendo necessário a analise dos
fatores que possam tê-la determinado tais como :
checagem do meio de cultura , estufa de incubação,
autoclave, capela , etc. Caso seja necessária a
desinfecção do ambiente, efetuar a limpeza em toda
sala usando uma solução de hipoclorito de sódio
comercial. Por fim é feita uma nova amostragem.
 Observação importante: Para o preparo dos
meios de cultura, é utilizado meio desidratado,
visando maior uniformidade dos mesmos, de
procedência idônea e com data de validade no
rótulo do reagente. Pode-se, no entanto,
prepará-los em laboratório, sendo que os
reagentes a serem utilizados devem ser de grau
bacteriológico, apresentar odor, cor e
consistência inalterados, ser livres de elementos
bactericidas ou bacteriostáticos inespecíficos e
outros carboidratos fermentáveis que não os
em teste, e fornecer os nutrientes necessários
para os organismos pesquisados.
Esquema do Resultado de Coliformes Totais e
Fecais