CURSO DE BIOMEDICINA

Disciplina de Anlises
Toxicolgicas

Roteiro de aulas
prticas

1 semestre de 2014

0
 Execuo adequada das Anlises Toxicolgicas

Uso de avental obrigatrio em todas as aulas prticas. Uso de luvas sempre que for
manusear material biolgico e/ou limpar derrame do mesmo (utilizar soluo de hipoclorito
de sdio com 2% de cloro ativo).
Utilizar a capela para manuseio de material voltil, cidos e bases fortes
Ambiente em vidraria:
- Anlise qualitativa no exige ambiente.
- Anlise quantitativa, no faz-lo quando se tratar de material biolgico, cidos e bases fortes e
substncias volteis. Usar vidros de penicilina para o ambiente.
Pipetagem:
- No utilizar a boca para faz-lo; usar sempre o pipetador.
- Em anlises quantitativas, utilizar pipetas volumtricas e/ou automticas.
- Evitar, sempre, colocar a pipeta diretamente dentro do recipiente estoque de reagentes,
amostras e padro. Transferir quantidade suficiente para vidro de penicilina e s ento
realizar a pipetagem
Leituras no espectrofotmetro:
- Usar sempre 2 cubetas apenas, uma para leitura do branco e amostra e outra para as solues-
padro (partindo-se da soluo de menor para a de maior concentrao).
- Em casos especiais, quando for necessrio, utilizar uma terceira cubeta para a leitura do
branco.
- Utilizar um pedao de papel absorvente para limpar o lado externo da cubeta antes das leituras
e outro para retirar o excesso de lquido de dentro da cubeta, entre uma leitura e outra.

Lavagem do material utilizado em aula prtica

Bquer, vidros de penicilina e bales: passar gua de torneira, ench-los com gua e deix-
los dentro da bacia sobre a pia .
Pipetas: colocar em balde contendo gua e sabo.
Tubos de vidro: passar gua de torneira e deix-los dentro da bacia com gua e sabo.
Ponteiras: descart-las dentro de cuba com gua e hipoclorito de sdio.
Cubetas: lavar com gua corrente e gua destilada, emborcando-as no suporte de cubetas. Se
as cubetas apresentarem resduo, passar gua corrente e deix-las em cuba com gua e sabo.

CUIDAR DA VIDRARIA DO LABORATRIO PARA QUE VOC E SEUS COLEGAS

POSSAM TER, SEMPRE DISPONVEL, MATERIAL PARA A REALIZAES DAS
PRTICAS.
AO FINAL DE CADA PRTICA VOC DEVER VERIFICAR:
- SE A BANCADA DE TRABALHO EST ORGANIZADA
- SE O MATERIAL UTILIZADO EM COMUM FOI COLOCADO PARA LAVAR
- A ORGANIZAO, ATENO E CUIDADO AO TRABALHAR EVITAM
ACIDENTES. CUIDE-SE!
1
 1 - Teste para Identificao de Inalantes/Solventes por Via mida

1.1- INTRODUO

A palavra solvente significa substncia capaz de dissolver coisas, e inalante toda substncia
que pode ser inalada, isto , introduzida no organismo por aspirao pelo nariz ou pela boca. Em
geral, todo solvente uma substncia altamente voltil, ou seja, evapora-se muito facilmente,
por esse motivo pode ser facilmente inalada. Outra caracterstica dos solventes ou inalantes
que muitos deles (mas no todos) so inflamveis. Estas substncias atualmente so utilizadas
para fins de abuso, sendo que somente o cloreto de etila (lana-perfume) est enquadrado na
Portaria 344/98 da SVS/MS.

1.2. REAGENTES

- Resorcina;

- Hidrxido de sdio 40% (P/V) (POP 035);

- Clorofrmio;

- gua destilada;

- Carbonato de sdio 10% (POP 031);

- Iodo (cristais);

- lcool etlico;

- Piridina.

1.3. VIDRARIA E MATERIAL

- Tubos de ensaio;

- Grade para tubos;

- Esptulas;

- Provetas de 1 mL;

- Bquer de 250 mL;

- Fsforo;

- Cpsula de porcelana.

1.4. EQUIPAMENTO 2
- Balana;

- Placa de aquecimento;

- Capela.

1.5. PROCEDIMENTO

Teste da Resorcina:

- Em um tubo de ensaio contendo 1 mL da amostra a ser analisada adicionar

aproximadamente de 0,1 a 0,2 gramas de resorcina;

- Adicionar 1 mL de soluo de hidrxido de sdio 40% P/V;

- Fazer o mesmo teste para o padro positivo utilizando 1 mL de

clorofrmio e para o padro negativo utilizando 1 mL de gua destilada;

- Para resultados positivos para clorofrmio obtm-se colorao rosa.

Teste do Iodofrmio

- Em uma capela, adicionar aproximadamente 2 mL de carbonato de sdio

10% e 0,5 gramas de cristais de iodo em um tubo de ensaio contendo 1 mL de amostra a
ser analisada;

- Fazer o mesmo teste para o padro positivo utilizando 1 mL de lcool

etlico e para o padro negativo utilizando 1 mL de gua destilada;

- Para resultados positivos para lcool etlico obtm-se colorao amarela-

amarronzada (iodofrmio).

Teste da densidade

- Em um tubo de ensaio contendo 1 mL da amostra a ser analisada,

adicionar 2 mL de gua destilada.

- Para solventes clorados (com exceo do cloreto de etila), a fase da

amostra (fase de menor volume igual a 1 mL) ficar na camada inferior, enquanto para o
cloreto de etila e ter etlico (ou ter de petrleo), a fase da amostra (fase de menor
volume igual a 1 mL) ficar na camada superior da mistura heterognea.

Reao de Fujiwara-Ross

- Em um tubo de ensaio colocar 1 mL de piridina + 1 mL de amostra a ser

analisada + 1 mL de hidrxido de sdio 40% (P/V) (POP 035); 3
 - Agitar e colocar em banho maria fervente por 2 minutos.

- Leitura: Amarelo/laranja = cloreto de etila Vermelho = hidrocarboneto

halogenado Vermelho intenso = clorofrmio.

- Utilizar o mesmo teste para o padro positivo e para o padro negativo.

Teste da Inflamabilidade

- Em uma capela, colocar 2 mL da amostra a ser analisada em uma cpsula de porcelana

e adicionar um palito de fsforo aceso;

- Resultado: no inflamvel = hidrocarboneto halogenado (exceo clorofrmio);

inflamvel = cloreto de etila e ter etlico.

Teste do Ponto de Ebulio:

- Para resultados positivos para cloreto de etila no teste de densidade (Figura 46 A), colocar 2
mL do lquido problema em um tubo de ensaio. O resultado POSITIVO caracterizado pelo
resfriamento no tubo de ensaio, tendo em vista que o cloreto de etila entra em ebulio na
temperatura de aproximadamente 12oC. Para melhor visualizao da ebulio do cloreto de etila,
pode-se acrescentar ao tubo de ensaio, um grnulo de areia (ou sal de cozinha), que permitir a
formao de bolhas, semelhante a efervescncia

1.6. OBSERVAO

- Caso positivo para solventes orgnicos (com exceo do cloreto de etila), dever constar no
laudo: PRESENA DE SOLVENTE ORGNICO COM PONTO DE EBULIO MAIOR
QUE 12,5C;

- Para resultado positivo para cloreto de etila dever ocorrer a combinao de resultados
positivos para os TRS testes citados neste POP (teste de densidade (teste de ponto de ebulio
e teste de Fujiwara-Ross), devendo constar no laudo: PRESENA DE SOLVENTE CLORADO
COM PONTO DE EBULIO MENOR QUE 12,5C;

- Em caso de dvida aps a anlise por via mida, encaminhar o material para anlise por
CG/MS.

- CUIDADOS: estes procedimentos deve ser realizado com uso dos equipamentos de proteo
(jaleco, luvas e culos de segurana).

2 - Identificao da maconha - Testes coloridos

2.1 - Mtodo de extrao

4
 colocar cerca de 0,1 grama de folhas e/ou inflorescncia da planta suspeita em gral de vidro e
pulveriza-la,
adicionar sobre a amostra, 15 mL de ter de petrlio, tampar com vidro de relgio e deizar em
repouso por 10-15 minutos
filtrar o extrato em papel de filtro ou carvo ativado. Com o extrato, proceder s reaes de
identificao (item 2)

2.2 - Reaes de identificao

2.2.1 - Reao de Chamaravy

transferir uma alquota do extrato para cpsula de porcelana e evaporar at resduo, em banho
de gua fervente,
adicionar ao resduo, uma alquota do reativo de Chamaravy e aquecer por 2 minutos em
banho de gua fervente,
aps este tempo, adicionar gua destilada pelas paredes da cpsula,
Em caso positivo, haver o aparecimento de colorao violcea, que passa a azul.

OBS.: Preparo do Reativo:

p-dimetilaminobenzaldedo 3,0 g
cido sulfrico a 37% 100,0 mL

2.2.2 - Teste de Duquenois-Levine

- Adicionar amostra (ou ao extrato) aproximadamente 0,5 mL de reagente de Duquenois-

Levine e agitar.

- Sobre as paredes do tubo, adicionar 0,5mL de cido clordrico concentrado. Na presena de

canabinides, haver a formao de um anel de cor azul ou azul-violeta.

- Para realizar a distino de outros extratos vegetais, como de caf torrado, leo de Patchouli e
ch (folhas), adicionar aproximadamente 1mL de clorofrmio e observar a colorao das fases.
Cor violeta na fase de baixo (orgnica) e colorao azulada na fase aquosa indicam a presena
de canabinides vindos da Cannabis sativa L.. No se observa colorao violeta na fase de
clorofrmio com outros produtos naturais.

OBS.: Preparo do Reativo

Solubilizar 0,4 g de vanilina em 20,0 mL de lcool etlico a 95 e adicionar 4 gotas de
acetaldedo.

5
Observao: alteraes na colorao podem ser obtidas caso a amostra esteja muita concentrada
ou em amostras com baixo teor de canabinides. Nestes casos deve-se repetir o teste com uma
quantidade menor ou maior do extrato da amostra suspeita.

CUIDADOS: Este procedimento deve ser realizado com uso dos equipamentos de proteo
(jaleco, luvas e culos de segurana).

2.3. BIBLIOGRAFIA
a
- CLARKE, E. G. C. Clarke s Isolation and Identification of Drugs. 2 Ed.
London: The Pharmaceutical Press, 1986.

- UNITED NATIONS. Division of Narcotics Drugs. Recommended

Methods for Testing CANNABIS: Manual for Use by National Narcotics Laboratories.
New York, 1987.

3 - Identificao de cocana - Testes coloridos

Amostra: p (branco cristalino)

6
1 Reao de Marquis
1 mL de formaldedo a 40% em 20mL de H2SO4 conc.

Em uma lmina escavada de porcelana, colocar uma pequena poro de p e adicionar

gotas do reativo de Marquis
Levar ao aquecimento (+ se vermelho tijolo)

2- Reao com as solues de tiocianato de cobalto e cido clordrico

Reativos
Reativo I - tiocianato de cobalto: solubilizar 2,0 g de tiocianato de cobalto em 100 mL
de gua.

Reativo II - HCl concentrado

colocar em uma placa escavada de porcelana, pequena quantidade do p e gotas do reativo I.

Observar aparecimento de precipitado azulado.
sobre o precipitado formado, colocar gotas do reativo II. Em caso positivo para cocana, o
precipitado no sofrer alterao.
a dissoluo do precipitado indicar a presena de outras substncia como procana,
lidocana, metadona, entre outras.

OBS.: o reativo I poder ser preparado como se segue: Misturar partes iguais das solues de
tiocianato de potssio a 1 M e de nitrato de cobalto a 0,1 M.

3 - Reao com hipoclorito de sdio

em uma lmina escavada de vidro, ou em placa de Petri, colocar uma pequena poro do p e
adicionar gotas de hipoclorito de sdio.
na presena de cocana formar-se- um precipitado branco flocoso (reao positiva).

DETERMINAO ESPECTROFOTOMTRICA DA CREATININA URINRIA

1 - Referncia
Anlise realizada atravs do KIT da Bioclin
7
2 - Mtodo Analtico

Diluio da amostra: pipetar 0,1 mL da amostra de urina, transferir para um tubo de ensaio e
adicionar 2,4 mL de gua destilada (diluio 1:25). Agitar.
Rotular 3 cubetas de ensaio como Br (branco), Ad (amostra diluda), Pa (padro) e seguir a
sequncia seguinte:

Branco Amostra diluda Padro

reagente alcalino (mL) 2,0 2,0 2,0

gua destilada (mL) 0,25 - -
urina diluda (mL) - 0,25 -
soluo padro (mL) - - 0,25
cido pcrico (mL) 0,5 0,5 0,5

Agitar os tubos e deix-los em repouso por 20 minutos temperatura ambiente ou por 10

minutos a 37C.
Ler as absorbncias da amostra diluda (Ad1) e do padro em 510 nm, zerando o aparelho
com o branco.
Adicionar aos tubos Br e Ad, 100mL de acidificante, homogeinizar e deixar temperatura
ambiente por 5 minutos.
Ler a absorbncia da amostra diluda (Ad2) em 510 nm, zerando o aparelho com o branco.
Calcular a concentrao de creatinina, expressa em g/L com o auxlio do fator de calibrao
(fc), utilizando a seguinte frmula:
[Am] = fc x (AAd1 -AAd2) x 25 sendo:

[Am] = concentrao de creatinina na amostra fc = concentrao do padro

Ad1 = absorbncia 1 da amostra diluda absorbncia do padro
Ad2= absorbncia 2 da amostra diluda
25 = fator de diluio

Determinao do chumbo no sangue por absoro atmica em forno de grafite

1 Referncia

(Unit de Toxicologie Industrielle et Medicine du Travail - Universit Catholique de Louvain, 1998)

2 -Equipamentos e Reagentes

2.1 - Espectrofotmetro de absoro atmica com forno de grafite equipado com corretor
Zeeman e detector UV de comprimento de onda varivel.
2.2 - Lmpada de catodo co de Pb 8
2.3 - Centrfuga
2.4 - Agitador de tubo tipo Vortex
2.5 Soluo diluente: Triton X-100 0,4%, NH4H2PO4 0,2% em cido ntrico 0,2%.
2.6 Soluo de hipoclorito de sdio a 2%.

3 - Mtodo Analtico

3.1 - Preparo dos Padres

- Soluo padro estoque a 2,0mg/L
- Soluo padro intermediria: 20 mg/dL em soluo diluente e cido ntrico 0,2%.
Preparar 10 mL partir da soluo estoque de 2,0 mg/L.
- Solues padro de uso: 4, 8, 12 e 16 mg/dL preparadas em sangue (automao)

3.2 - Tcnica Analtica

Pipetar em tubo plstico com tampa 900 mL da soluo diluente

Homogeinizar a amostra por 1,0 minuto em agitador de tubo tipo vortex.

Pipetar 100mL da amostra previamente homogeinizada, limpar a ponteira suja de sangue, do

lado externo com o auxlio de papel absorvente e adicionar os 100mL no tubo plstico com
tampa contendo a soluo diluente. Lavar a ponteira com a soluo diluente, aspirando e
desprezando a soluo no prprio tubo. Desprezar a ponteira em soluo de hipoclorito de
sdio a 2%.
Agitar a mistura no vortex por 40 seg.

Centrifugar a 3.000 rpm por 10 min.

Transferir o sobrenadante para um vial e colocar o mesmo no carrossel do amostrador

automtico.
Iniciar as leituras.

3.3 - Condies do aparelho

Corrente: 5,0 mA
Comprimento de onda: 283,3 nm
Largura da fenda: 0,5 nm
Volume de amostra: 5 mL
Volume total injetado: 10 mL
Temperatura de injeo: 100oC
Velocidade de injeo: 15X menor
Condies do forno:

Passo Temperatura (oC) Tempo (seg) Fluxo (L/min)

1 150 20,0 3,0
2 250 20,0 3,0
3 600 10,0 3,0
4 600 5,0 3,0
5 850 10,0 3,0
6 850 3,5 3,0 9
 7 2300 0,7 0,0
8 2300 2,0 0,0
9 2500 6,0 3,0

4 - Interpretao

VR = at 40 mg/dL (quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

IBMP = 60 mg/dL(quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

Determinao espectrofotomtrica do cido delta aminolevulnico urinrio ( ALA-u)

1 Referncia
TOMOKUMI K; OGATA M - Clin. Chem., v. 18, p.1354-1356, 1972.

2 - Equipamentos e reagentes:
2.1 - Espectrofotmetro, regio visvel, duplo feixe
2.2 - Banho de gua fervente
2.3 - Agitador de tubos tipo Vortex
2.4 - Soluo padro estoque de ALA (50 mg/L)
Preparo da soluo: dissolver 0,0064 g de cloridrato de -ALA em H2O e completar
volume para 100 mL com gua destilada. Esta soluo estvel por cerca de 2 meses,
quando guardada sob refrigerao (4C).
2.5 - Solues-padro de uso (5 a 15 mg/L)
Preparo das solues: pipetar diferentes volumes da soluo padro estoque de -ALA10e
 diluir com gua destilada para volume de 10 mL. Preparar no momento do uso.
2.6 - Soluo tampo acetato - pH 4,6
Preparo da soluo: dissolver 13,6 g de acetato de sdio triidratado em 70 mL de gua
destilada e 5,7 mL de cido actico concentrado. Completar o volume para 100mL com
gua destilada.
2.7 - Reativo de Ehrlich modificado (preparar no momento do uso)
Preparo do reativo: dissolver 1 g de p-dimetilamino benzaldedo em 30 mL de cido
actico concentrado, adicionar 5 mL de cido perclrico 60%, 5 mL de gua destilada e
completar o volume para 50 mL com cido actico concentrado.
2.8 - Acetatoacetato de etila
2.9 - Acetato de etila

3 - Mtodo Analtico
3.1 - Curva de Calibrao
Para preparar a curva de calibrao, pipetar 1 mL das solues-padro de uso de
concentrao 2,5 mg/L, 5,0 mg/L, 7,5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L e trata-las de maneira idntica
amostra (item 3.3). As leituras das absorbncias sero feiras em 553 nm, zerando o aparelho com
um branco de reativo (1 mL de gua destilada) tratado de maneira idntica ao branco de urina
(item 3.3).

3.2 - Fator de Calibrao (Fc)

Caso no seja possvel construir a curva de calibrao, usar o Fc para a quantificao do
ALA nas amostras de urina, empregando-se o padro de 10 mg/L ou de 5,0 mg/L.

Clculos:
[Am] = fc x Aam fc = [Pa]
Apa
sendo:
[Am] = concentrao da amostra Aam = absorbncia da amostra
[Pa] = concentrao do padro Apa = absorbncia do padro

3.3 - Tcnica analtica

em 4 tubos de ensaio grandes, rotular amostra; padro; branco de urina e branco de reativo.
adicionar aos tubos:

amostra padro branco de urina branco de reativo

urina 1 mL - 1 mL -
H2O - - - 1 mL
sol. padres de uso - 1 mL - -
sol. tampo 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
acetoacetato 200 mL 200 mL - -

agitar os tubos por 5 segundos no agitador de tubos e aquece-los em banho de gua fervente
durante 10 minutos

11
 resfriar os tubos e adicionar 3 mL de acetato de etila em cada um deles. Agitar por 20
segundos no agitador de tubos. Quando der emulso, caso seja necessrio, centrifugar a 2500
rpm por 3 minutos.
transferir 2 mL da camada orgnica superior para tubos de ensaio mdios, limpos e secos e
adicionar 2 mL do reativo de Ehrlich modificado (item 2.7).
aps 10 minutos, fazer leitura da absorbncia do produto colorido em 553 nm. Zerar o
aparelho com o branco de reativo antes de ler a absorbncia dos padres, branco de urina e
amostra.
Subtrair a absorbncia encontrada no branco de reativo daquela medida na amostra e
quantificar a concnetrao de ALA-u com o auxlio da curva de calibrao.

4 - Interpretao

VR at 4,5 mg/g de creatinina (quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

IBMP = 10 mg/g de creatinina (quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

5 - Fundamento Qumico

COOH
CH2
O O
CH2
C C
C O
+ CH3 CH2 O CH 2 CH3
CH2
NH2 acetoacetato de etila

ALA R2 R3
H
CH 3 HOOC ( HC ) (CH2)2 COOH
O C N + 2 2
CH3
Ehrlich 3HC N
composto cclico
H

R2 R3

12
CH3
3HC N C N
CH
H 3

composto colorido
 Determinao da atividade da colinesterase plasmtica e eritrocitria
1 Referncia

MICHEL HO Electrometric method for the determination of red cells and plasma
cholinesterase activity. J. Lab. Clin. Med., v.34, p. 1564-8, 1949.

2 - Material Biolgico:
Sangue total colhido em tubo heparinizado

3 - Reagentes

3.1- Tampo I (para eritrcitos): barbital sdico (4,1236 g); KH 2PO4 (0,5446 g); KCl (44,730 g).
Dissolver em aproximadamente 900 mL de gua destilada, adicionar 28 mL de HCl 0,1 N
e completar o volume para 1L. O pH do tampo I 8,1 a 25C.

3.2- Tampo II (para plasma): barbital sdico (1,2371 g); KH 2PO4 (0,1361 g); NaCl (17,535 g).
Dissolver em aproximadamente 900 mL de gua destilada, adicionar 11,6 mL de HCl
0,1N e completar o volume para 1L. O pH do tampo II 8,0 a 25C.
13
3.3- Substrato acetilcolina para eritrcitos: cloridrato de acetilcolina (2,0 g em 100 mL de gua
destilada). Adicionar algumas gotas de tolueno e conservar em geladeira.

3.4- Substrato acetilcolina para plasma: cloridrato de acetilcolina (3,0 g em 100 mL de gua
destilada). Adicionar algumas gotas de tolueno e conservar em geladeira.

3.5- Soluo de saponina 0,01% (preparar no momento de uso).

3.6- Soluo de NaCl 0,9% (preparar no momento do uso).

4 - Mtodo

Coletar 5 mL de sangue em tubo de centrfuga (15 mL), devidamente heparinizado. Centifugar a

2000 rpm por 15 minutos e separar o plasma para outro tubo.

4.1- Determinao da colinesterase eritrocitria:

- Lavar os eritrcitos 2 vezes com 2 ou 3 volumes de NaCl 0,9%, desprezando as soluces de
lavagem (5 minutos a 2000 rpm).
- Colocar volume de NaCl 0,9% igual ao volume das clulas e misturar bem.
- Transferir 200 mL da suspenso de eritrcitos para um tubo de ensaio e acrescentar 4,8 mL de
saponina 0,01%.
- Transferir 2 mL desta soluo para um frasco de vidro.
- Adicionar 2 mL do tampo I
- Deixar o frasco em banho de gua a 25C por 10 minutos.
- Ler o pH1
- Acrescentar 0,4 mL de acetilcolina 2% e retornar o frasco para o banho de gua a 25 oC por
exatamente 1 hora
- Ler o pH2
4.2- Determinao da colinesterase plasmtica:
- Transferir 100 mL de plasma para um tubo de ensaio e acrescentar 4,9 mL de gua destilada
- Transferir 2 mL desta soluo para um frasco de vidro
- Adicionar 2 mL do tampo II
- Deixar o frasco em banho de gua 25C por 10 minutos.
- Ler o pHI
- Acrescentar 0,4 mL de acetilcolina 3% retornar o frasco para o banho de gua por exatamente 1
hora
- Ler o pH2
5 - Clculo
5.1- A atividade da colinesterase em unidades pH/h calculada atravs da frmula:
pH/h = (pH1 pH2 b) . f
T2 T1
onde: pH1 = pH inicial
pH2 = pH final
T1 T2 = tempo de incubao do tampo, substrato e enzima
b = correo da hidrlise no enzimtica 14
 f = correo das variaes em pH/h com alterao do pH durante a reao

Os valores b e f so dados na tabela abaixo:

pH2 colinesterase eritrocitria colinesterase plasmtica

b f b f
7,9 0,03 0,94 0,09 0,98
7,8 0,02 0,95 0,07 1,00
7,7 0,01 0,96 0,06 1,01
7,6 0,00 0,97 0,05 1,02
7,5 0,00 0,98 0,04 1,02
7,4 0,00 0,99 0,03 1,01
7,3 0,00 1,00 0,02 1,01
7,2 0,00 1,00 0,02 1,00
7,1 0,00 1,00 0,02 1,00
7,0 0,00 1,00 0,01 1,00
6,8 0,00 0,99 0,01 1,00
6,6 0,00 0,97 0,01 1,01
6,4 0,00 0,97 0,01 1,02
6,2 0,00 0,97 0,01 1,04
6,0 0,00 0,99 0,01 1,09

5.2 - Porcentagem de atividade da colinesterase calculada pela frmula:

% atividade de AChE = pH/h (amostra) x 100

pH/h (referncia)

onde: pH/h (referncia) no plasma = 1,01

pH/h (referncia) no eritrcito = 0,87

6 - Interpretao

IBMP para colinesterase plasmtica: depresso de 50% da atividade inicial da enzima (Quadro I,
NR-7, 1994, MT/Br)
IBMP para colinesterase eritrocitria: depresso de 30% da atividade inicial da enzima
(Quadro I, NR-7, 1994, MT/Br).

15
 Determinao de Metemoglobina no sangue

1 Referncia

HEGEST, E et al., Clin. Chim. Acta. V. 30, p. 679-82, 1970

2 -Equipamentos e Reagentes

2.1 - Espectrofotmetro, regio visvel, monofeixe

2.2 - Centrfuga
2.3 - Soluo de ferricianeto de potssio [K3Fe(CN)6] a 5%
Preparo da soluo: Pesar 5 g de K3Fe(CN)6 e diluir para 100 mL com gua destilada.
Conservar em frasco escuro e preparar mensalmente.
2.4 - Soluo tampo fosfato 0,5 M - pH=7,2
Preparo da soluo: misturar 7,0 mL de fosfato de sdio bibsico (Na 2HPO4) 0,5 M e
3,0 mL de fosfato monobsico de potssio (KH2PO4) 0,5 M.
2.5 - Reativo de ferricianeto-fosfato
Preparo de reativo: misturar 0,2 mL da soluo 2.3 com 3,5 mL da soluo 2.4 e
completar o volume para 10 mL com gua destilada. Preparar diariamente.
2.6 - Soluo de cianeto de sdio (ou potssio) a 10%, de preparo recente.
2.7 - Soluo de cido actico a 12%
2.8 - Soluo de cianeto de sdio neutralizada
Preparo da soluo: misturar 1 mL da soluo 2.6 com 0,9 mL da soluo 2.7. Esta
soluo tem validade de 6 horas.

16
3 - Mtodo Analtico

Colher de 3 a 5 mL de sangue usando heparina como anticoagulante

3.1 - Preparo da Amostra

Transferir 0,8 mL do sangue para um tubo de centrfuga contendo 2,2 mL de gua destilada.
Homogeinizar cuidadosamente e deixar em repouso por 2 minutos. Em seguida, adicionar 1 mL
de soluo tampo fosfato (nestas condies a amostra pode ser armazenada, sob refrigerao a
4C, por at 24 horas).

3.2 - Tcnica Analtica

Centrifugar a amostra (preparada em 3.1) a 2.000 rpm por 15 minutos;

Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de ensaio mdio, usando pipeta de

Pasteur de plstico
Pipetar 2,4 mL do sobrenadante para uma cubeta de vidro (I) e 200mL para outra cubeta (II),
esta ltima contendo 2,2 mL da soluo 2.5;
Aps 1 minuto, efetuar as leituras das absorbncias AI e AII em 632 nm, zerando o aparelho
com uma cubeta vazia (leitura contra o ar);
Adicionar 100mL da soluo 2.8 em cada cubeta, misturar e aps 1 minuto efetuar nova
leitura das absorbncias denominando-as AIII e AIV.
Calcular a concentrao de metemoglobina no sangue, expressando-a em porcentagem de
hemoglobina total,a partir da frmula seguinte:

% MeHb = AI - AIII x 100

(AII - AIV) x 12
sendo 12 o fator de diluio.

4 - Interpretao

VR = at 2% (quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

IBMP = 5% (quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

17
 Determinao dos Triclorocompostos Totais na urina (TCT-u)

1 Referncia

IMAMURA T; IKEDA M - Int. Arch. Abbeitsmed, v. 31, p.333-338, 1973.

2 - Equipamentos e Reagentes

2.1 - Espectrofotmetro, regio visvel, monofeixe

2.2 - Tubos de ensaio (20x20) fechados com rolha munida com condensador adaptado (tubo de
vidro de 10x0,3 cm)
2.3 Tubos de vidro de 10 x 1 cm
2.4 - Soluo padro estoque de cido tricloroactico (1 mg/mL)
2.5 - Solues-padro de uso
Preparo das solues: pipetar volumes adequados da soluo padro estoque de modo a
preparar 50 mL das solues de uso de concentraes 20, 40, 80 e 100mg/mL
2.6 - Soluo oxidante: dissolver 8 g de CrO3 em 5 mL de H2O e 15 mL de HNO3 conc.
2.7 - Soluo de KOH a 7,8 N
2.8 - Piridina destilada ou proveniente de vidro recm aberto

3 - Mtodo Analtico

pipetar 1 mL da amostra de urina e do branco (pool de urina) para 2 vidros de penicilina,

acrescentar 4 mL de gua destilada (diluio 1:5) em cada um e homogeneizar,
transferir 0,5 ml para 2 tubos de ensaio com condensador e rotula-los Amostra diluda (Adi) e
Branco (Br);
pipetar 1 mL das solues padro de uso (item 2.5) para 4 tubos de ensaio com condensador,
rotulados Pa20, Pa40, Pa80 e Pa100 18
 adicionar 0,5 mL da soluo oxidante em todos os tubos e adaptar os condensadores;
aquece-los em banho de gua fervente por 15 minutos, em seguida resfria-los sob gua
corrente, coloca-los em banho de gelo e adicionar 2,5 mL da soluo de KOH 7,8N;
ainda mantendo os tubos em banho de gelo, adicionar 4 mL de piridina e agitar fortemente;
adaptar os condensadores aos tubos e leva-los para banho de gua a 65 C por 30 minutos; em
seguida e coloca-los em banho de gelo;
transferir 3 mL da camada piridnica para novos tubos de ensaio contendo 0,5 mL de gua
destilada. Homogeneizar bem;
efetuar a leitura da absorbncia do produto colorido, em 530 nm, zerando o aparelho com o
branco de urina.
calcular a concentrao dos triclorocompostos totais na amostra, expressos como cido
tricloractico (TCA), com o auxlio da curva de calibrao
a concentrao encontrada dever ser multiplicada pelo fator de diluio e expressa em
funo da concentrao de creatinina urinria.

4 - Interpretao

VR no detectado em urina de indivduos no expostos

IBMP = 300 mg/g (quadro I NR-7,1994, MT/Br)
LTtricloroetileno = 75 ppm (NR-15, MT/Br)
TLVtricloroetileno = 100 ppm (ACGIH)

5 - Fundamento Qumico

19
 Reao de oxidao:

a) 2 CrO3 + H2O H2Cr2O7

anidrido crmico cido bicrmico

b) dissociao
H2Cr2O7 H2+ + Cr2O72-
em meio aquoso

c) 2 Cr2O72- + 3 CCl3CH2OH 3 CCl3COOH + 4 Cr3+ + 11 H2O

TCA

Provvel reao de colorao

Cl H
+ Cl C C OH
N Cl H N
piridina TCA CCl2
Cl
COOH

+ 3KOH KO C C N CCl2
N H H COOH
Cl CCl2 composto colorido
COOH
+ KCl2 + 2H2O + H+
INSTVEL
H H H H O
OU OK - C = C - C = C - C - H
funo aldedo
H H H H OH
KO C = C C = C - C - H2
- -

funo lcool

Noes bsicas sobre cromatografia

I Cromatografia em fase gasosa (CG)

1 Fundamentos e equipamento bsico

A cromatografia em fase gasosa, tambm denominada cromatografia gasosa (CG) uma

tccnica cromatogrfica que possibilita a separao, identificao e quantificao de
substncias volatilizveis, gases e vapores. Basea-se, como todas as tcnicas
20
 cromatogrficas, na diferente distribuio das substncias entre uma fase estacionria e
outra mvel.
Na CG, a fase mvel um gs e a fase fixa (estacionria) pode ser um lquido (embebido
em um slido denominado suporte) ou um slido. A fase estacionria est acondicionada em um
recipiente denominado coluna cromatogrfica, que por sua vez est conectada ao vaporizador ou
injetor (no seu incio) e ao detector (no seu final). O esquema de um aparelho CG est na figura
1 (extrado de trabalho de Fbio Augusto-UNICAMP, disponvel no endereo
http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/cagced_2/cagced_2.htm.)

1 - Cilindro do gs de arraste e
controlador da vazo
- Injetor ou vaporizador
3 - Forno com coluna cromatogrfica
4 - Detector
5 Registrador/Integrador
6-Cromatograma

Todo o aparelho CG est estabilizado em temperaturas elevadas, possibilitando que a

amostra ao ser introduzida no aparelho se volatilize e possa ser arrastada pela fase mvel. Assim,
a amostra injetada atravs do vaporizador (injetor), introduzida na coluna contendo a fase
fixa, por onde esta passando, continuamente a fase mvel. As substncias, de acordo com suas
propriedades e as das fases estacionrias, sero eluidas em um tempo maior ou menor atravs da
coluna ou seja, ficaro retidas por tempos determinados (tempo de reteno) e chegaro sada
da coluna em momentos diferentes. O uso de um detector acoplado ao final da coluna origina
um sinal eletrnico que enviado ao registrador, gerando o cromatograma (registro grfico
das substncias).
As substncias so representadas graficamente no cromatograma, na forma de picos ou
linhas cromatogrficas. No registrador, existi papel cromatogrfico que se movimenta 21 em
velocidade estabelecida previamente. Sobre este papel existe uma pena; assim, quando o sinal
eletrnico gerado pela substncia no detector enviado para o registrador, ocorre um impulso na
pena que comea a subir. Como o papel est em movimento, quando o sinal eletrnico decai e a
pena volta para a linha de base, forma-se o pico cromatogrfico. Caso a volta da pena ocorra
muito rapidamente, forma-se apenas a linha cromatogrfica (muito pouco frequente). A figura
2 esquematiza um cromatograma.

pico do subst. A
solvente
subst. B

subst. C

injeo

linha de base Figura 2 : Esquema de um cromatograma (ideal)

2 Classificao da cromatografia gasosa

De acordo com a fase estacionria usada, a cromatografia gasosa pode ser classificada em
cromatografia gs-slido ou gs-lquida.
cromatografia gs-slido: a fase estacionria um slido com grande rea superficial.
A separao baseia-se em mecanismos de adsoro das substncias neste slido. A
cromatografia g-slido usada principalmente na anlise de gases e compostos
apolares de baixa massa molecular.
cromatografia g-lquido: a fase estacionria um lquido pouco voltil, cobrindo um
suporte slido. A separao baseia-se em mecanismos de partio das substncias
entre as fases lquida e gasosa. Devido ao grande nmero de fases estacionrias
lquidas disponveis no mercado, a utilizao deste tipo de cromatografia corresponde
a cerca de 95% do total de aplicaes.

3 Condies Cromatogrficas
Uma vez que a separao e identificao das substncias depende da afinidade delas
frente s fases fixa e mvel, importante otimizar e padronizar as condies que podem
influenciar nesta afinidade, e, consequentemente, no resultado da anlise. So as chamadas
condioes cromatogrficas que podem, quando modificadas, alterar o tempo de reteno das
substncias. As principais esto a seguir:
Temperaturas de operaes: so trs estas temperaturas; a da coluna denominada
TC, a do injetor ou vaporizador denominada TV e a do detector ou TD.
Os fluxos dos gases: a fase mvel sempre um gs inerte como nitrognio ultra-
puro, hlio ou argnio. A alterao deste fluxo vai modificar o tempo de reteno
das substncias.
22
 O tipo de fase estacionria utilizada: existem inmeras colunas cromatogrficas
com fases fixas, cuja polaridade varia entre baixa, mdia e elevada.
Para os cromatgrafos que no possuem o acessrio denominado Integrador de reas, a
velocidade do papel cromatogrfico essencial, como ser visto nos prximos itens.

3 Tipos de Detectores
Os detectores podem ser seletivos ou universais. Os primeiros respondem apenas a uma
classe de substncias e o segundo s substncias em geral. Os seletivos apresentam uma
utilizao mais restrita, mas so mais sensveis que os universais.
Dentro do grupo dos detectores seletivos, destaca-se o Detector de Captura de Eltrons
(DCE) que identificam somente compostos que possuem molculas/grupos eletroflicos
(halognios, por exemplo). Neste detector gerada uma corrente de eletrons por uma fonte
radioativa (chamada corrente de fundo). Esta corrente ser diminuda pela captura dos eltrons
quando as substncias eletron-afins, injetadas no CG, alcanam o detector.
Dentre os detectores universais destacam-se o de Condutividade Trmica (DCT) e o
Detector de Ionizao de Chama (DIC). O mais usado, por ser universal e ter sensibilidade
elevada, o DIC. Este detector capaz de identificar todo o composto que, ao ser queimado,
produza uma corrente de ions elevada. Esta ionizao determina uma queda de voltagem no
interior do DIC que representa o sinal eletrnico enviado ao registrador. importante salientar
que, ao se trabalhar com o DIC necessrio utilizar os chamados gases auxiliares, ou seja, os
gases capazes de manter a chama do DIC acesa; correspondem, geralmente, ao hidrognio e
oxignio.

4 Anlise Qualitativa
A identificao de uma substncia feita, geralmente, comparando-se o Tempo de
Reteno (Tr) de um padro com o da substncias (amostra). Se o Tr do padro o mesmo do
composto presente na amostra pode-se concluir tratar-se de uma mesma substncia. Isto no
conclusivo porque duas substncias diferentes podem ter o mesmo Tr em determinadas
condies cromatogrficas.
O Tr pode ser calculado automatica ou manualmente. No primeiro caso necessrio
existir, acoplado ao CG, uma espcie de computador denominado Integrador de reas, que
realiza todos os clculos quali e quantitativos da anlise. O mtodo manual utiliza a frmula:
onde: Tr = tempo de reteno
dr = distncia de reteno (distncia medida no cromatograma, do
Tr = dr pice do pico ao ponto de injeo)
vp vp = velocidade do papel do registrador/integrador

5 Anlise Quantitativa
A quantificao analtica feita atravs da comparao da rea ou altura dos picos do
padro e amostra. Quando existe o integrador de reas h a quantificao automtica, caso
contrrio necessrio a quantificao manual. Esta feita atravs da altura ou rea dos picos.
Altura do pico: no pode ser utilizada para quantificar picos assimtricos ou de base
larga. a tcnica de escolha quando se trabalha com linhas cromatogrficas. As
alturas dos picos so medidas traando-se uma perpendicular linha de base passando
pela inflexo mxima dos picos.
23
 rea do pico: a tcnica manual mais utilizada, uma vez que a grande maioria
dos picos cromatogrficos so assimtricos. Utiliza-se, geralmente para tal
quantificao, a chamada Triangulao dos picos. Traa-se as tangentes dos
dois lados do pico e a interco destas com a linha de base. Forma-se um
triangulo cuja rea calculada pela frmula:
A = a x wb sendo A = rea do pico; a = altura do pico;
2 wb=largura do pico na linha de base

Quando o pico no assimtrico ou est muito distante da linha de base, aconselha-se

encontrar a largura do pico na base do prprio pico e no na linha de base.
As reas dos picos das solues-padro versus as concentraes correspondentes so
lanadas em um grfico, construindo-se a curva de calibrao atravs da qual se quantificar a
amostra.

6 Uso do Padro Interno (PI)

O uso do Padro Interno (substncia quimicamente semelhante ao composto de
interesse), permite a realizao de um controle de qualidade interno da anlise e mais, possibilita
minimizar os erros decorrentes de alteraes nas condies cromatogrficas. Muitas vezes, aps
a injeo e clculo do Tr da soluo padro, ocorrem modificaes nas condies
cromatogrficas estabelecidas previamente. Isto faz com que o Tr calculado para a amostra seja
muito diferente daquele encontrado para o padro, impossibilitando a identificao da substncia
de interesse.
Com o uso da padro interno, ao invs de se identificar a substncia pelo Tr, identifica-se
pelo clculo do Trr ou seja, Tempo de Reteno Relativo da substncia em relao ao
padro interno. O Trr calculado dividindo-se o Tr da substncia (e/ou do padro) pelo Tr
do padro interno.

II Cromatografia Lquida de alta eficincia

Apresenta quase todos os mesmos fundamentos do CG. Agumas diferenas so

As fases mveis so lquidos altamente puros sem oxignio e outors gases mistyrados (devem
ser filtradas e degaseificadas).
As fases mveis so impulsionadas e desenvolvidas ao longo das colunas, com o auxlio de
uma bomba de alta presso que deve proporcionar uma vazo contnua e sem pulsao ou
seja, em um fluxo contnuo
As colunas so geralmente de ao inxidvel, com 10 a 30 cm de cumprimento e 0,4 a 2,2 cm
de dimetro interno, e preenchidas com diferentes fases estacionrias. Essas fases so
geralmente ligadas quimicamente e, dependendo das modificaes nelas realizadas, podero
atuar no modo normal (polaridade da fase fixa maior do que a fase mbel), reverso
(polaridade da faze estacionria MENOR do que a da fase mvel) ou em ambos.
As determinaes analticas, em CLAE so, via de regra realizadas em colunas de fase
reversa (as mais comuns so as C18-octadecilslica) que operam com fases mveis aquosas..
As injees das amostras e padres so feitas em um injetor que possui uma ala (loop) com
duas posies: uma que prende a amostra injetada dentro dela (ou seja, a amostra preenche o
24
 loop) e a outra que libera as amostras para dentro da coluna. Existem alas de diferentes
volumes.
Um esquema de um cromatgrafo lquido apresentado a seguir:

Bibliografia Bsica:
Introduo a Mtodos Cromatogrficos - Carol H. Collins e Gilberto Braga. 2 a edio,
Editora da UNICANP, 1987.
Ana Luiza G. Degani, Quezia B. Cass, Paulo C. Vieira - Cromatografia um breve ensaio.
Qumica Nova na Escola. Cromatografia N 7, maio 1998.

Determinao do cido hiprico urinrio por cromatografia gasosa

1. Referncia

ALVAREZ LEITE EM, FRANA LS, MONTEIRO RB, CIOLETTI AG, BARROCA MM -
Toxicorama, Paris, v.VI, n.3, p.3-6, 1994, modificado

2. Equipamentos e reagentes

2.1 - Cromatgrafo a gs equipado com detector de ionizao de chama e coluna capilar HP1
com 12 m de comprimento, 0,2 mm de dimetro interno e filme interno de 0,33 mm
2.2 - Agitador de tubos tipo Vortex
2.3 - Banho de gua com tempeatura regulvel 25
2.4 - Hidrxido de trimetilfenilamneo (agente metilante)@
2.5 - cido heptadecanico 0,4 mg/mL (padro externo)
2.6 - HCL 6 mol/L (diluir 18,4 mL de HCl, d=1,19 g/L, para 1L de soluo)
2.7 - Acetato de etila
2.8 - Sulfato de sdio anidro

3. Mtodo Analtico

3.1 - Solues-padro
Soluo estoque de cido hiprico 10 mg/mL em metanol:gua 1:1
Soluo padro de uso de cido hiprico (AH) na concentrao 0,8 g/L. Prepara-las em pool
de urina
Soluo metanlica de cido heptadecanico-AHD 0,4 g/L (padro externo)

3.2 - Tcnica analtica

Transferir respectivamente 0,5 mL da amostra, de pool de urina (branco) e da soluo
padro de uso de AH (0,8 g/L) para tubos de vidro rotulados respectivamente A, Br, Pa.
Submeter todos os tubos seguinte sequncia analtica:
adicionar 200L de HCl 6 mol/L e 4 mL de acetato de etila,
agitar por cerca de 1 min em agitador mecnico (1500- 2000rpm) e transferir a 3,5 mL da fase
orgnica para outros tubos, limpos e secos.
adicionar 200 mg (uma ponta de esptula) de sulfato de sdio anidro, agitar e transferir 3,0
mL da fase orgnica para tubos de centrfuga,
adicionar 0,5 mL de soluo metanlica de cido heptadecanico-AHD (padro externo) e
evaporar at resduo em banho de gua a 70C, sob fluxo de nitrognio,
resfriar os tubos e adicionar 150mL de agente metilante (hidrxido de trimetilfenilamneo),
agitar os tubos por 1 min em agitador de tubos tipo vortex e injetar 1 mL no CG.

3.3 - Condies cromatogrficas:

- Temperaturas de operaes:
. coluna com programao de temperatura como se segue:
Temp. inicial: 200 C/ 3,5 min; Rampa: 25 C por min; Temp. final: 225C/1,5 min
. vaporizador (TV)= 225 C
. detector (TD) = 250 C
- Range: 0 (atenuao)
- Injetor: mdulo split, com razo de diviso igual a 1/25
- Velocidade do papel : 0,33 cm/min

3.4 - Quantificao do cido hiprico (AH)

Calcular a relao entre as reas dos picos de AH e AHD atravs da frmula:
rea do pico de AH
rea do pico de AHD

26
 Subtrair a relao de reas obtida aps anlise do branco, da relao de reas encontrada
para o padro, obtendo a relao real de reas do padro. Calcular a concentrao do AH com o
auxlio do Fator de calibrao (Fc):
Fc = concentrao do padro Conc. da amostra = relao de reas da amostra x Fc
Relao real de reas do Pa
A concentrao final de AH dever ser corrigida pela de creatinina da amostra.

4. Interpretao do resultado

VR at 1,5 g/g de creatinina (quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

IBMP = 2,5 g/g de creatinina (quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

NOTA: Sntese do agente metilante:

cristais de iodeto de N, N, N, trimetil N fenilamnio 236 mg
xido de prata 175 mg
metanol super seco 10 mL
Deixar 2 horas em agitador mecnico. Aps esse perodo recolher a fase superior
cuidadosamente, de modo a no retirar o depsito negro, guardando-a em vidro mbar a -20C

Sntese dos cristais de N, N, N, trimetil N fenilamnio

acetato de etila seco 79,86 mL
n,n dimetil anilina 12,67 mL (destilar se no estiver clara)
iodeto de metila 7,47 mL (passar por coluna de alumina antes do uso
para retirar excesso de iodo)

Deixar em repouso por 2 horas em ambiente escuro e a temperatura ambiente. Filtrar atravs de
funil de Buckner com papel Whatman n 1. Redissolver os cristais em etanol aquecido e
recristalizar em banho de gelo. Filtrar. Repetir a recristalizao 2 vezes.

Determinao do cido trans, trans-mucnico urinrio por cromatografia em fase

lquida de alta eficincia (CLAE)

1. Referncia

- DUCOS P; GAUDIN R; ROBERT A et al. - Int. Arch. Occup. Environ. Health, v. 62, p.529-
534, 1990, modificado por PAULA et al., RBCF., v. 39:p.63-69, 2003.

2. Equipamentos e reagentes

2.1 - Cromatgrafo Lquido da Hewlett Packard (HP), modelo 1100 equipado com detector
ultra violeta e termostato para coluna
2.2 - Coluna preparatria de troca inica (adosrvente:amnio quartenrio- 100mg)
2.3 - cido actico grau HPLC 27
2.4 Metanol grau HPLC

3. Mtodo Analtico

3.1 - Solues-padro de cido trans, trans-mucnico (ATTM)

Estoque: soluo metanlica a 200mg/mL
Intermediria: solues em fase mvel, concentraes de 0,2 mg/mL
Solues padro de uso: preparadas em pool de urina nas concentraes de 1,25; 1,0; 0,75;
0,5 e 0,25 mg/mL.

3.2 - Curva de Calibrao

Submeter as solues padro de uso e alquota de pool de urina (branco) ao mtodo de
extrao descrito em 3.4.
A curva de calibrao ser construda utilizando-se as reas dos picos cromatogrficos de
cada padro menos a rea do pico do branco versus as respectivas concentras de ATTM.
Se as amostras forem quantificadas com o auxlio do fator de correo (Fc), utilizar para este
clculo, o pico cromatogrfico obtido aps a anlise da soluo padro de uso de 0,75 mg/mL.

3.3 - Condies cromatogrficas:

Coluna cromatogrfica de fase reversa, Lichrosorb RP 18; 5,0 mm (Merck)
Fase mvel: cido actico 1% - metanol (90-10) - pH 2,72
fluxo = 1,2 mL/min
temperatura do termostato da coluna: 30 C.
volume de injeo (injetor automtico): 50 mL
: 264 nm
tempo total da corrida cromatogrfica: 13 min

3.4 - Tcnica de extrao

condicionar as colunas de troca inica com 1,5 mL de metanol e 1,5 mL de gua milli-Q,
adicionar 250 mL dos padres de uso, da amostra e do branco (pool de urina) s colunas
condicionadas e deixar em contato com o adsorvente durante 1 min.,
aps este tempo, eluir lentamente a urina, desprezando os eluatos,
lavar as colunas com 2 mL de soluo de cido actico a 1%, para eliminar as impurezas
retidas, desprezando os eluatos,
adicinar 1 mL de cido actico a 10% e deixar em contato com o adsorvente das colunas por 1
min.,
aps este tempo, eluir lentamente o cido pelas colunas, recolhendo o eluato em tubos limpos
e secos,
tranferir os eluatos para vial correspondente e leva-los para o amostrador automtico do
aparelho.

4 - Clculos e interpretao do resultado

28
 a concentrao do ATTM urinrio ser feita com auxlio da curva de calibrao ou do fator de
calibrao
a concentrao de ATTM encontrada dever ser corrigida pela creatinina urinria e expressa
em mg/g de creatinina.
Quantificao do ATTM pelo Fc

fc = [ Pa ] [Am] = fc x Aam, sendo:

Apa-Abr
[Am] = concentrao da amostra Apa = rea do pico do padro
[Pa] = concentrao do padro Abr = rea do pico do branco
Aam = rea do pico da amostra

No existe IBMP para esse biomarcador; os ndices biolgicos devem estar associados ao VRT do
benzeno no ar, seguindo a seguinte tabela

benzeno no ar (ppm) benzeno no ar (mg/m3) ATTM (mg/g creatinina)

0,3 1,0 -
0,6 2,0 1,3
0,9 3,0 -
1,0 3,3 1,6
2,0 6,5 2,5
4,0 13,0 4,2
6,0 19,5 5,8

29