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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E

TECNOLOGIA TRINGULO MINEIRO - CAMPUS ITUIUTABA.

PRTICAS DE ANLISE DE LEITE

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Determinao da densidade a 15C


A determinao da densidade uma das operaes que permite saber se o leite em anlise foi ou no
adulterado (molhagem). Entretanto, o resultado desta determinao deve ser encarado com reservas,
pois podem ocorrer casos em que o leite foi adulterado, mas foi tambm adicionado de substncias
corretoras da densidade.
Material necessrio para a anlise
- Termolactodensmetro
- Cilindro graduado de 250 ml
Procedimento
Transfira para um cilindro graduado de 250 ml uma quantidade da amostra que permita mergulhar o
termolactodensmetro (Figura 1). A temperatura do leite poder variar de 14 a 20C. Introduza,
lentamente, o termolactodensmetro evitando que o mesmo encoste nas paredes do cilindro graduado.
Espere que a coluna de mercrio do termmetro e o densmetro estabilizem-se. Preda a leitura da
densidade e da temperatura. Expresse a densidade a 15C, servindo-se da tabela em anexo.

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Determinao de Lipdios
O teor de gordura do leite bovino varia em funo da raa do animal; entretanto, 3,5% podem ser
considerados como um valor mdio. O mtodo mais comumente utilizado para a determinao de
lipdios no leite o do butirmetro de GERBER.
Material necessrio para anlise
- butirmetro de Gerber
- Pipeta de 11 ml
- Pipeta de 10 ml
- Pipeta de 1 ml
Reagentes
- cido sulfrico (D = 1,820)
- lcool amlico
Procedimento
Transfira, com auxlio de uma pipeta adaptada a uma "pera" de borracha, 10 ml de cido sulfrico para
um butirmetro de Gerber (Figura 2). Adicione, lentamente, com uma pipeta, 11 ml da amostra e 1 ml
de lcool amlico (estas adies devem ser feitas sem molhar internamente o gargalo do butirmetro).
Arrolhe e agite at completa dissoluo. Coloque o butirmetro em um banho a 75C (rolha para baixo)
e espere at que haja completa separao da camada oleosa. A seguir, centrifugue a 3.000 rpm durante
5 min em centrfuga de GERBER (Figura 3). Manejando a rolha, coloque a camada amarelo-clara dentro
da haste graduada do butirmetro. O nmero de ml ocupado pela camada oleosa dar diretamente a
porcentagem de lipdios.

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Determinao do extrato seco


Material necessrio para a determinao
- Disco de Ackermann
Procedimento
Determine o resduo seco fazendo coincidir as graduaes dos crculos internos e mdios do disco de
Ackermann (Figura 4) correspondentes densidade e gordura, respectivamente. A posio da seta
indicar, no crculo externo, o valor do resduo seco em porcentagem (p/v).
Obs.: - Esta determinao pode ser feita, tambm, atravs do uso de tabela apropriada.

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Determinao da acidez
A determinao da acidez no leite frequentemente utilizada e, inclusive, considerada como prova de
rotina nas indstrias de laticnios, pois fornece indcios sobre o estado de conservao do produto. No
caso de o leite ter sido ordenhado e estocado de forma inadequada, o nmero de microrganismos
presentes ser bastante elevado, gerando uma acidez acima dos limites considerados normais.
A acidez do leite pode ser expressa das seguintes maneiras:
1) Acidez em graus Dornic (D)
Material necessrio para a anlise
Reagentes
- Pipeta de 10 ml
- Erlenmeyer de 50 ml
- Bureta de 25 ml

- Soluo de hidrxido de sdio N/9


- Soluo alcolica de fenolftalena 1%

Procedimento
Transfira, com auxlio de uma pipeta, 10 ml da amostra para um erlenmeyer de 50 ml. Adicione 2 gotas
de indicador fenolftalena. Titule com soluo de NaOH 1/9 N at o aparecimento de uma colorao
rsea.
Clculo
V x 10 = acidez D
V = volume de NaOH 1/9 N gasto na titulao
Obs.: - A partir desta titulao (utilizando NaOH 1/9 N) pode-se, tambm, expressar a acidez do leite em
% de cido ltico, fazendo-se os seguintes clculos:
100 ml de sol. de NaOH 1/9 N ---------------- 0,44 g de NaOH
X ml gastos na titulao ---------------- Z g NaOH
1 mol de NaOH reage com 1 mol de cido ltico
40 g de NaOH --------------------------- 90 g de cido ltico
Z g de NaOH ---------------------------- Y g de cido ltico
Para se obter o resultado em porcentagem:
10 ml de leite (quantidade de amostra) -------- Y g de cido ltico
100 ml de leite ----------------------------------- W g de cido ltico
W = % de cido ltico

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2) Acidez em soluo normal e porcentagem de cido ltico


Material necessrio para a anlise
Reagentes
- Pipeta de 10 ml
- Erlenmeyer de 50 ml
- Bureta de 25 ml

- Soluo de hidrxido de sdio 0,1 N


- Soluo alcolica de fenolftalena 1%

Procedimento
Transfira, com auxlio de uma pipeta, 10 ml da amostra para um erlenmeyer de 50 ml. Adicione 2 gotas
do indicador fenolftalena. Titule com uma soluo de hidrxido de sdio 0,1 N at o aparecimento de
uma colorao rsea.
Clculo
a) em soluo normal

b) em cido ltico

3) Prova do Alizarol
No fornece resultados quantitativos, mas apenas indica se o leite est cido, normal ou alcalino. Este
frequentemente utilizado pela indstria no momento de recepo do leite.
Material necessrio para a anlise
- Pipeta de 5 ml
- Tubos de ensaio de 20 ml

Reagentes
- Soluo de Alizarol

Procedimento
Transfira, com auxlio de uma pipeta, 5 ml de leite para um tubo de ensaio. Adicione 5 gotas da soluo
de alizarol.

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Resultados possveis
- colorao vermelho-tijolo ------------ leite normal
- colorao amarelada ------------------- leite com acidez alta
- colorao azulada ---------------------- leite alcalino

Determinao do ndice crioscpico


A gua, que se congela a uma temperatura superior ao ponto de congelamento do leite (-0,55C),
adicionada a ele vai forosamente elevar seu ponto de congelamento. Assim, se a molhagem (adio de
gua) fosse levada ao infinito ter-se-ia gua pura, que congela a 0C, isto , 55 centsimos de grau acima
do ponto de congelamento do leite normal. Desta forma, um centsimo de grau de diferena, no ponto
de congelamento do leite, corresponde a 1,82% de molhagem. A crioscopia , portanto, uma prova
importante para determinar a fraude da molhagem.

Determinao de conservantes
Como j foi dito anteriormente, um leite ordenhado e estocado em condies no adequadas,
provavelmente apresentar, aps algumas horas, uma contagem microbiana bastante elevada, gerando
no produto uma acidez acima dos limites permitidos pela legislao. Este fato certamente far com que
o produto seja rejeitado ao chegar ao laticnio. Numa tentativa de evitar que isto ocorra, o produtor
pode fazer a adio de substncias que impedem o desenvolvimento microbiano acentuado. Essas
substncias so conhecidas como conservantes. Dentre elas, temos: cido brico e boratos; cido
saliclico e salicilatos; gua oxigenada; formaldedo e antibiticos. Entretanto, deve-se salientar que a
adio de qualquer uma dessas substncias no leite considerada ilegal segundo a legislao vigente
em nosso pas.
1) gua oxigenada
Fundamento: baseado na seguinte reao:
H2O2 + 2 KI

2KOH + I2

O I2 liberado na reao produzir uma colorao amarelada na amostra.


Material necessrio para a anlise
- Pipeta de 1 e 5 ml
- Tubo de ensaio de 30 ml

Reagente
- Soluo de iodeto de potssio 40%

Procedimento
Transfira 5 ml da amostra para um tubo de ensaio e adicione 2 ou 3 gotas de soluo de KI 40%. O
aparecimento de uma colorao amarelada indicar a presena de H2O2.

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2) Antibiticos
Material necessrio para a anlise

Composio do meio de cultura

- Pipeta estril de 1 ml
- Placas de petri estreis
- Meio de cultura
- Cultura B. subtilis

Peptona de casena ----------------------- 5,0 g


Extrato de levedura ----------------------- 2,5 g
D (+) glucose ------------------------------ 1,0 g
Agar-Agar ----------------------------------- 11,5 g
(pH = 6.9 - 7.1)

Procedimento
Colocar 0,5 ml da suspenso de B. subtilis em uma placa de petri estril. Em seguida colocar 15 ml do
meio de cultura, esterilizado e resfriado a +/- 40C. Deixar solidificar. Embeber discos de papel
(previamente esterilizados) em leite e colocar sobre o meio. Repetir o mesmo procedimento, s que
embebendo os discos em leite contendo antibitico. Incubar a 37C/24 horas. Observar a formao do
halo de inibio ao redor dos discos embebidos com leite contendo antibitico.
3) Formol
Fundamento: reao que ocorre entre aldedo e fenol, resultando no aparecimento de uma colorao
salmo.
Material necessrio para a anlise

Reagentes

- Pipetas de 1, 2 e 10 ml.
- Tubo de ensaio de 30 ml

- Soluo de floroglucina a 1%
- Soluo de hidrxido de sdio a 10%

Procedimento
Transfira 10 ml da amostra para um tubo de ensaio e adicione 1 ml da soluo de floroglucina 1% e 2 ml
da soluo de NaOH 10%. Agite. Na presena de formaldedo, aparecer uma colorao salmo.
4) cido Brico e Boratos
Fundamento: chama de colorao verde, caracterstica do boro.
Material necessrio para a anlise
Reagentes
- Pipeta de 1, 10 e 25 ml.
- Cpsula de porcelana
- Erlenmeyer de 100 ml
- Tubo de vidro dobrado em ngulo reto
- Banho-maria

- Soluo de hidrxido de sdio a 10%


- cido sulfrico (D = 1,84)
- lcool metlico

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Procedimento
Mea 25 ml da amostra e transfira para uma cpsula de porcelana. Adicione 3 gotas de soluo de NaOH
10%. Aquea at carbonizao e transfira o resduo para um erlenmeyer. Adicione 1 ml de H2SO4 (D =
1,84). Aquea em banho-maria por 10 minutos. Esfrie e adicione 10 ml de lcool metlico. Adapte, ao
frasco, uma rolha atravessada por um tubo de vidro dobrado em ngulo reto. Aquea o frasco e Inflame
os vapores observando a colorao da chama. Reao positiva chama com colorao verde.

Determinao de espessantes
Existem substncias que podem ser adicionadas intencionalmente ao leite com a finalidade de mascarar
a adio de gua, fazendo com que o mesmo tenha a sua densidade corrigida. Essas substncias so
chamadas de espessantes. Neste grupo, as substncias mais comumente utilizadas e, portanto,
pesquisadas, so: amido, sacarose, urina e gelatina.
1) Amido
Fundamento: esta determinao se baseia no fato de que o amido reage com o iodo produzindo uma
colorao azul.
Material necessrio para a anlise
- Pipeta graduada de 10 ml
- Tubo de ensaio de 50 ml

Reagentes
- Soluo saturada de iodo

Procedimento
Mea 10 ml da amostra em uma pipeta, transfira para um tubo de ensaio e aquea at a ebulio em
bico de Bunsen. Resfrie em gua com gelo. Adicione 2 gotas de uma soluo saturada de iodo. Na
presena de amido aparecer uma colorao azul.
2) Sacarose
Fundamento: a determinao de sacarose se baseia no fato de que os acares em presena de cidos
concentrados sofrem desidratao produzindo furfurais, os quais se condensam com fenis. Como
resultado dessa reao aparece uma colorao avermelhada.
Material necessrio para a anlise
- Pipeta graduada
- Tubo de ensaio de 50 ml
- Banho-maria

Reagentes
- cido clordrico
- Resorcina

Procedimento
Mea 15 ml da amostra com auxlio de uma pipeta e transfira para um tubo de ensaio de 50 ml.
Adicione 1 ml de cido clordrico e 0,1 g de resorcina. Agite e aquea em banho-maria por 5 minutos. Na
presena de sacarose, aparecer uma colorao avermelhada.

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PADRO PARA AS ANLISES DE LEITE


DETERMINAO

MTODO DE
ANLISE

Densidade

Lactodensmetro

Acidez

Dornic

Lipdios

Butirmetro

Resduo seco

Disco de
Ackermann

Ponto de
congelamento

Crioscopia

Amido

Reao c/ iodo

Sacarose
Formol

Condensao de
furfural + fenol
Reao de aldedo
+ fenol

H2O2

Reao com KI

cido Brico

Anlise da chama

Antibitico

Crescimento de
microrganismos

INDICAO
Fraude por adio
de gua ou
desnatagem
Estado de
conservao do
leite
Fraude por adio
de gua ou
desnatagem
Fraude por adio
de gua
Fraude por adio
de gua
Fraude por adio
de gua
Fraude por adio
de gua
Estado imprprio
de conservao
Estado imprprio
de conservao
Estado imprprio
de conservao
Estado imprprio
de conservao

LIMITES
1,028 - 1,032

16 20D

3% mnimo
8,5% mnimo
-0,54 - 0,56C
No permitido
No permitido
No permitido
No permitido
No permitido
No permitido

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PROVAS ENZIMTICAS
A pesquisa da peroxidase e fosfatase, duas enzimas normalmente presentes no leite, til no sentido de
fornecer informaes a respeito do processo de pasteurizao, indicando se o mesmo foi ou no
realizado adequadamente.
A peroxidase uma enzima que tem capacidade de desdobrar a gua oxigenada. destruda quando o
leite submetido s temperaturas de 70 a 80C, dependendo do tempo de aquecimento. Portanto, a
peroxidase ser inativada, caso a temperatura de pasteurizao tenha sido ultrapassada o que tornar o
leite inadequado ao consumo, bem como, produo de queijo.
A fosfatase, enzima que inativada nas temperaturas de pasteurizao, no deve ser detectada em leite
adequadamente pasteurizado. Caso contrrio (fosfatase positiva) deve-se suspeitar de uma relao
tempo/temperatura insuficiente no processo de pasteurizao, ou ento, de uma mistura de leite
pasteurizado com leite cru.
de costume, tambm, se pesquisar em leite, outra enzima: a redutase. A pesquisa da redutase fornece
indicaes quanto ao estado de higienizao do leite, sendo, portanto, uma prova bastante utilizada (no
Brasil) para se fazer a classificao do leite em tipo "A", "B" e "C", uma vez que tal classificao feita
basicamente em funo da populao microbiana do produto. A prova de redutase fundamentada na
capacidade que apresentam os microrganismos de reduzir o azul de metileno. Deve-se salientar que o
tempo de reduo inversamente proporcional ao nmero de microrganismos presentes no leite.
1) Prova de Redutase
Material necessrio para a anlise
Reagente
- Tubo de ensaio de 30 ml
- Pipeta de 1 e 25 ml

- Soluo de azul de metileno 2,5%

Procedimento
Em um tubo de ensaio estril, coloque 20 ml de leite e adicione 0,5 ml de soluo aquosa de azul de
metileno 2,5%. Feche o tubo, misture e leve a estufa a 37oC, at completa descolorao. Observar o
tempo decorrido desde a mistura do leite com o corante at o completo descoramento. Qualificar o
leite de acordo com a seguinte tabela:
Excelente
Bom
Aceitvel
Mdio
Mau
Pssimo

conserva a cor por mais de 7 horas


conserva a cor por mais de 5 horas
conserva a cor por mais de 4 horas
conserva a cor por mais de 2 horas
Conserva a cor por menos de 2
horas
Perde a cor em aproximadamente
30 minutos

2) Prova de fosfatase
Esse teste pode ser realizado por meio de kit especfico facilmente encontrado no mercado
especializado. As recomendaes de uso feitas pelo fabricante devem ser rigorosamente observadas.
Leites adequadamente pasteurizados devem apresentar resultados negativos para a fosfatase.

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3) Prova de Peroxidase
Material necessrio para a anlise

Reagente

- Tubo de ensaio de 20 ml
- Pipeta de 2 e 10 ml

- Soluo de guaiacol 1%
- gua oxigenada de 10 vol.

Procedimento
Transfira 10 ml da amostra para um tubo de ensaio, adicione 2 ml de soluo de guaiacol e 2 a 3 gotas
de gua oxigenada. Agite. O aparecimento de uma colorao salmo indica que o leite no foi aquecido
alm de 75C por mais de 15 minutos.

PADRO PARA PROVAS ENZIMTICAS


TESTE
Peroxidase
Fosfatase
Redutase

INDICAO
Condies de
pasteurizao
Condies de
pasteurizao
Estado de higienizao

RESULTADOS ESPERADOS
Positivo
Negativo
Tempo mnimo de 3 horas
e 30 minutos para leite
tipo "B"

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Anlises Microbiolgicas
COLHEITA E PREPARO DA AMOSTRA PARA ANLISES MICROBIOLGICAS
Para a colheita de leite cru de lates ou de tanque de resfriamento deve-se proceder a homogeneizao
do leite com equipamentos adequados e em seguida passar o leite para frasco esterilizado.
Para leite beneficiado deve-se colher o leite em suas embalagens prprias e ntegras sendo que em
qualquer caso, a amostra deve ser mantida sob refrigerao at o momento das anlises que devem ser
realizadas o mais rpido possvel. Todo o material a ser utilizado em anlises microbiolgicas deve estar
rigorosamente limpo e esterilizado.
Planos de amostragem
Pode-se trabalhar com amostra indicativa ou com amostra representativa, sendo a primeira quela
composta por um nmero de unidades amostrais inferiores ao estabelecido em plano de amostral
constante na legislao especfica.
A amostra representativa aquela constituda por um determinado nmero de unidades amostrais
estabelecidos de acordo com o plano de amostragem determinado em legislao. Assim, para amostras
representativas, estabelecida, no caso do leite fludo, a colheita aleatria de 5 (cinco) amostras do
mesmo lote deve-se utilizar os quadros 1, 2, 3,4 e 5 conforme o microrganismo analisado e quando
tratar-se de amostra indicativa utilizar o valor de m constantes nestes mesmos quadros como padro
microbiolgico aceitvel.
Preparo das diluies das amostras
A partir da amostra integral, prepara-se a diluio -1 pipetando-se 1ml de leite em 9ml de soluo salina
0,85%; a partir da diluio 10 -1 (1:10) prepara-se as diluies necessrias, 10 -2 (1:100), 10 -3 (1:1000), e
assim sucessivamente transferindo 1ml da amostra para tubos contendo 9ml de soluo salina a 0,85%,
sempre homogeneizando.

Figura: Preparo das diluies (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:
http://www.sbrt.ibict.br).

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CONTAGEM PADRO EM PLACAS (AERBIOS MESFILOS)


Princpio
Determina o nmero de microrganismos viveis presentes no leite sendo que altas contagens no leite
cru podem indicar falhas de higiene na obteno e comprometimento da qualidade; no produto final
indica falhas no beneficiamento e comprometimento da vida de prateleira do produto; ainda preciso
atentar-se para o fato de que em alimentos, todas as bactrias patognicas em alimentos so mesfilas.
Procedimento
Distribuir 1 ml de cada diluio no centro de placas de Petri estreis e identificadas em duplicatas
(Figura 3), e adicionar a cada placa 10 ml de gar Padro para Contagem (PCA), previamente fundido e
mantido a 45C; homogeneza-se cuidadosamente e, aps a solidificao, incuba-se as placas invertidas
a 35 1C / 48 horas (Figuras 4 e 5).
Para a contagem escolhe-se o par de diluies que apresentou crescimento de 25 a 250 colnias,
multiplicando a mdia do nmero de colnias contadas pelo fator de diluio correspondente e
expressando o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC) por ml de leite.
Exemplo: se o par de diluies selecionado para contagem foi o correspondente a diluio 10-2 (1:100)
e as placas apresentaram crescimentos de 150 e 148 colnias, deve-se calcular a mdia destas placas=>
150 + 148 = 298 / 2 = 149; em seguida deve-se converter o resultado para 1ml, ou seja, retornar ao fator
de diluio: 149 x 100 = 14900 UFC/ml que ser o resultado final da contagem de aerbios mesfilos.

Crescimento de aerbios mesfilos em gar Padro para Contagem (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para
Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).

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Esquema representando a semeadura em duplicata de cada diluio (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para
Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).

Figura: Esquema de semeadura e crescimento de aerbios mesfilos (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para

Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).

Quadro 1. Critrios microbiolgicos para aerbios mesfilos em leite fludo.

.
Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br

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NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES 30/35C (NMP)


Princpio
A presena destes microrganismos em contagens acima dos padres estabelecidos indica contaminao
ambiental e possvel presena de microrganismos patognicos; quando em leite beneficiado pode
indicar falhas no processamento trmico (pasteurizao) e/ou recontaminao.
Procedimento:
Utilizam-se as diluies previamente preparadas; semear 1 ml em trs sries de trs tubos, utilizando as
diluies 100, 10-1 e 10-2 em Caldo Verde Brilhante Bile 2% Lactose (CVBL), contendo tubos de
fermentao (Durham) obtendo-se ao final, nove tubos semeados; homogeneza-se cuidadosamente e
incuba-se a 35C 1 por 24 a 48 horas.
A leitura dos tubos positivos (turvao do meio e presena de gs nos tubos de Durham) em cada uma
das trs sries de trs tubos feita em 24 horas e 48 horas (figura 7). Calcula-se o NMP/ml, utilizando-se
a tabela conforme Anexo III da Instruo Normativa 62/2003 para verificar se o produto encontra-se
dentro dos padres estabelecidos (Quadro2).

Semeadura para coliformes totais em CVLB em triplicata e Resultado positivo para coliformes totais em CVBL com turvao e formao de gs nos tubos de
Durham (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).

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Quadro 2. Critrios microbiolgicos para Coliformes totais ou Coliformes a 30/35oC em leite fludo.

.Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br

NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES A 45C (NMP)


Princpio
Altas contagens destes microrganismos indicam condies sanitrias inadequadas devido presena de
matria fecal e a possvel presena de enteropatgenos, sendo inaceitvel em alimentos e indicadores
de graves falhas de higiene; ainda o consumo de alimentos com altas contagens pode significar riscos de
toxinfeo, pois o principal representante a bactria Escherichia coli que pode causar doenas severas
nos seres humanos.
Procedimento
A partir de cada um dos tubos positivos no NMP de coliformes totais, semear uma a duas aladas em
tubo contendo caldo EC e em tubo contendo caldo Triptona; incubar ambos a 44,5C ( 0,5C), por 24-48
horas em banho-maria com agitao; aps a incubao verificar:
a) Fermentao da lactose com presena de gs nos tubos de Durham.
b) Teste da presena do Indol: adiciona-se ao tubo com caldo triptona, 0,3ml de reativo de Kovacs; o
aparecimento de colorao vermelho-escura na camada representa uma reao positiva (Figura 8).
Considera-se como coliforme a 45C quando ambas as provas apresentarem resultados positivos.
Calcular o NMP de coliformes a 45C atravs do nmero de tubos confirmados e verificar se o produto
encontra-se dentro dos padres estabelecidos (Quadro 3).

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Quadro 3. Critrios microbiolgicos para Coliformes termotolerantes ou a 45C em leite fludo.

.Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br

Resultados positivos para coliformes termotolerantes no caldo EC com formao do anel vermelho (A) e formao de gs em tubo de Durham no caldo
triptona (B) (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:
http://www.sbrt.ibict.br).

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS PSICROTRFICOS


Princpio
Microrganismos psicrotrficos so aqueles que crescem sob temperaturas de refrigerao,
extremamente deteriorantes, pois produzem enzimas denominadas de termoestveis, ou seja, resistem
ao tratamento trmico da pasteurizao e at ultra alta temperatura permanecendo, portanto no leite e
derivados mesmo aps a destruio dos microrganismos; estas enzimas degradam as gorduras
provocando o sabor e o odor de rano, e degradam tambm as protenas do leite diminuindo o valor
nutricional e resultando em prejuzos para a indstria e para o consumidor.

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Aspecto de leite com fermentao natural sem contaminao por microrganismos deteriorantes (A) e com fermentao por microrganismos psicrotrficos
(B) (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).

Procedimento
As trs diluies selecionadas devem ser semeadas em gar padro para contagem (PCA) previamente
distribudo nas placas (aproximadamente 15 ml), utilizando o plaqueamento em superfcie com auxlio
de ala de Drigalsky espalhando todo o inculo por toda a superfcie do meio at que todo o excesso de
lquido seja absorvido. O volume a ser semeado de cada diluio de 0,1ml, tambm em duplicata e a
incubao deve ser em temperatura baixa que pode ser de 7C/10dias, de 18C/45 horas ou de
21C/25horas com as placas invertidas. Para a contagem, deve-se seguir o mesmo procedimento
utilizado para aerbios mesfilos, porm multiplicar o resultado por 10 (dez) para levar em conta o
volume dez vezes menor inoculado no plaqueamento em superfcie. O nmero de psicrotrficos no
deve exceder a 10% do total de aerbios mesfilos.
CONTAGEM DE Staphylococcus COAGULASE POSITIVA (*)
Princpio
A contagem de estafilococos coagulase positiva pode ser feita com dois objetivos, sendo um relacionado
sade pblica para confirmar o envolvimento desta bactria em surtos de intoxicao alimentar, e
outro com o controle da qualidade higinico sanitria do processo de produo do leite e derivados, e
neste caso da bactria serve como indicador de manipulao inadequada e falhas na higienizao de
equipamentos.
Procedimento
Utiliza-se o meio gar Baird-Parker (IN 62/2003). Antes de o uso fundir e resfriar a 50C; adicionar para
cada litro do meio base 50 ml de emulso de gema de ovo a 50% e 3 ml de soluo aquosa de telurito de
potssio a 3,5% esterilizada por filtrao; homogeneizar bem e distribuir em placas, submetendo teste
de esterilidade (incubar a 35C/24h); o plaqueamento deve ser por superfcie inoculando-se 0,1ml de
cada diluio selecionada, inclusive 0,1ml da amostra integral (sem diluio); incubar as placas
invertidas a 36C 1 por 30-48 horas; selecionar placas que contenham entre 10-150 colnias; contar as

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colnias tpicas, negras brilhantes com anel opaco, rodeado por um halo claro transparente,
destacando-se sobre a opacidade do meio; contar tambm as colnias atpicas, acinzentadas ou negras
brilhantes sem halo ou com apenas um dos halos.

Crescimento de colnias tpicas de estafilococos em gar Baird-Parker (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para
Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).

Aps a seleo de 3-5 colnias tpicas e atpicas de cada placa, semear em tubos contendo caldo
crebro-corao (BHI), incubados a 35C por 24 horas; a partir deste caldo deve-se efetuar a prova para
pesquisa da presena de coagulase.
Para a pesquisa da presena de coagulase deve-se transferir 0,2 ml de cultivo para tubos contendo
0,5ml de plasma de coelho oxalatado; incubar a 35C por 6 horas e verificar a presena de coagulao
(reao positiva); quando negativa reincubar at 12 horas.

Prova da coagulase para estafilococos sendo A um resultado positivo (coagulao) e B negativo. (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises
Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).

(*) a IN 51/2002 no prev a contagem de estafilococos coagulase positiva em leite fludo, mas sim, nos derivados do leite.

DETECA DE PRESENA/AUSNCIA DE SALMONELLA SPP.


Princpio
obrigatria a anlise para deteco de salmonella spp. no leite j que a mesma responsvel por
diversos surtos de doenas de origem alimentar; a bactria S. Typhi e a paratifoide so, normalmente,
septicmicas e produzem febre tifoide ou doenas semelhantes em seres humanos; outras formas de
salmoneloses produzem sintomas mais brandos; os sintomas caractersticos de doenas alimentares
causadas por Salmonella incluem diarreia, nusea, dor abdominal, febre e at vmitos, dores de cabea
e fraqueza; a infeco geralmente dura de 2 a 7dias.

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Procedimento
Adicionar 25 ml da amostra em 225 ml de caldo lactosado (pr-enriquecimento) e manter em
temperatura de 35C/18-24h; aps esta fase de pr-enriquecimento, transferir 1,0mL para 10,0mL de
caldo tetrationato (TT) e 1,0mL para 10,0mL de caldo selenito cistina (SC) incubando ambos a
35C/24h0, que corresponder fase de enriquecimento seletivo; aps esta fase deve-se proceder ao
plaqueamento diferencial em meios de cultura especficos e para isso deve-se inocular uma alada do
caldo TT em placas contendo gar entrico de Hektoen (HE), gar bismuto sulfito (BS) e gar xilose lisina
desoxiciolato (XLD); repetir esse procedimento com o caldo SC e incubar todas as placas invertidas a
35C/24he verificar se h desenvolvimento de colnias tpicas de Salmonella.
Para identificar as colnias tpicas devem-se observar as morfologias desenvolvidas nos meios de
crescimento:
- gar HE: colnias transparentes verde-azuladas com ou sem centro preto;
- gar BS: colnias marrons ou pretas com ou sem brilho metlico;
- gar XLD: colnias transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem centro preto.

Meios de cultura utilizados no plaqueamento diferencial e crescimento de Salmonella. (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises
Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).

Quando presentes, pelo menos duas colnias tpicas devero ser semeadas em gar Lisina Ferro (LIA) e
gar Trplice Acar Ferro (TSI), incubados a 35 C/ 24h, e verificando-se reao tpica para Salmonella
(Figura 14). Para a identificao das culturas positivas podem ser submetidas ao kit API 20E para de
Salmonella ou realizarem-se as provas bioqumicas tradicionais. Deve-se ter de Salmonella spp. em leite
fludo.

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Confirmao preliminar de colnias tpicas de Salmonella em LIA e TSI. (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para
Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).

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BIBLIOGRAFIA
INSTITUTO ADOLFO LUTZ, So Paulo. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. So Paulo, 2005, 371p.
ROSSI, ELIZEU ANTONIO, Prticas de anlise e processamento de leite: material didtico destinado s
aulas prticas da disciplina de tecnologia de laticnios -1 edio. - Araraquara: [s.n.], c2010. 1 CDROM; 4 3/4pol.
Instruo Normativa No. 62/2004. Oficializa os Mtodos Analticos Oficiais para Anlises Microbiolgicas
para
Controle
de
Produtos
de
Origem
Animal
e
gua.
Disponvel
em:
http://extranet.agricultura.gov.br/sislegisconsulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=28
Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, Centro de
Apoio ao Desenvolvimento Tecnolgico da Universidade de Braslia CDT/UnB, 2007, disponvel em:
http://www.respostatecnica.org.br/dossie-tecnico/downloadsDT/NjM=