MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO/MAPA

SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA/SDA Código: IT POA 033

COORDENAÇÃO GERAL DE APOIO LABORATORIAL/CGAL
LABORATÓRIO NACIONAL AGROPECUÁRIO EM GOIÁS/LANAGRO-GO
Revisão: 03

INSTRUÇÃO DE TRABALHO Emissão: 14/03/12

Análise de Proteína por Titulometria
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Nome Função Assinatura Data

Elaboração: Patrícia Elias Barbosa RQ

Análise crítica: Alex Ferreira Villas Boas Colaborador

Aprovação: José Eduardo França RT

1. Objetivo

Descrever a metodologia para quantificar o teor de proteína em amostras de produtos

cárneos ou lácteos.

Baseia-se na transformação do nitrogênio da amostra em sulfato de amônio através

da digestão com ácido sulfúrico p.a. e posterior destilação com liberação da amônia,
que é fixada em solução ácida e titulada. Podem-se expressar os resultados em
protídeos, multiplicando-se a porcentagem do nitrogênio total por fatores específicos.

2. Aplicação

Este método é aplicado em produtos cárneos e lácteos no laboratório POA do

Lanagro-GO.

3. Referências Normativas e/ou Bibliográficas

- BRASIL. Instrução Normativa n° 20, de 21 de julho de 1999. Aprova o Manual de

métodos analíticos oficiais físico-químicos para controle de carnes, produtos
cárneos e seus ingredientes, sal e salmoura. Diário Oficial da União, Brasília, DF,
9 set. 1999.

- BRASIL. Instrução Normativa n° 68, de 12 de dezembro de 2006. Oficializa os

Métodos analíticos oficiais físico-químicos, para controle de leite e produtos
lácteos, em conformidade com o anexo desta Instrução Normativa, determinando
que sejam utilizados nos Laboratórios Nacionais Agropecuários. Diário Oficial da
União, Brasília, DF, 14 dez. 2006. Seção 1, p.8-30.

4. Termos e Definições

FOR Formulário
IT Instrução de Trabalho
Lanagro-GO Laboratório Nacional Agropecuário em Goiás
POA Laboratório de Análises Físico-Químicas de Alimentos de Origem Animal e
Água
RQ Responsável pela Qualidade
RT Responsável Técnico
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UGQ Unidade de gestão da Qualidade

5. Descrição da Instrução de Trabalho

5.1. Material

5.1.1. Equipamentos

- Aparelho ou bloco digestor e destilador macro ou micro-Kjeldahl

- Balança analítica

5.1.2. Vidrarias e outros materiais

- Balão de Kjeldahl de 800mL ou tubo de Kjeldahl de 100mL

- Béquer de 250mL
- Buretas de 25 ou 50mL
- Erlenmeyers de 125 ou 250mL
- Espátula
- Gral de porcelana com pistilo
- Papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrogênio)
- Papel indicador universal de pH
- Pipeta graduada de 1mL
- Pipetas volumétricas de 2 e 10mL

5.1.3. Reagentes e soluções

- Ácido sulfúrico (H2SO4) p.a.;

- Anti-espumante (talco, parafina ou silicone);
- Indicador misto: Pesar 0,132 g de vermelho de metila (C15H15N3O2) e 0,06 g de
verde de bromocresol (C21H14Br4O5S). Dissolver em 200mL de álcool etílico a 70%
(v/v). Filtrar se necessário e guardar em frasco âmbar;
- Mistura catalítica: Misturar (a) e (b) na proporção de 10:1, triturando em gral de
porcelana até obter um pó fino:
a) Sulfato de potássio (K2O4) p.a., sulfato de sódio anidro (Na2SO4) p.a. ou
bissulfato de potássio (KHSO4) p.a.;
b) Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O) p.a.;
- Solução de ácido bórico (H3BO3) a 4% (p/v): Pesar 4 g de ácido bórico p.a.,
transferir para um béquer de 250mL, adicionar 80mL de água e aquecer sob
agitação branda até dissolução. Resfriar, transferir para balão volumétrico de
100mL e completar com água. Filtrar se necessário;
- Solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 50% (p/v).
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Nota 1: O indicador misto poderá ser incorporado à solução de ácido bórico a 4% na

proporção de 8mL por litro.

- Solução padrão de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,1 N ou solução padrão de ácido

clorídrico (HCl) 0,1 N.

Registrar o preparo das soluções no FOR UGQ 056 – Controle de preparo de

soluções.

5.1.3.1. Padronização das soluções de Ácido Sulfúrico (H2SO4) 0,1N ou Ácido

Clorídrico (HCl) 0,1 N

a) Preparo da solução padrão de Ácido Clorídrico (HCl) 0,1 N

- Medir 8,5 mL de ácido clorídrico p.a. e transferir para balão volumétrico de 1000
mL contendo 500 mL de água. Esfriar e completar o volume.
- Fatoração com Tris (Hidroximetilaminometano): deixar o reativo Tris
(Hidroximetilaminometano) (C4H11NO3) p.a., padrão primário, por 24 horas em
dessecador, ao abrigo da luz. Pesar 0,1211g, adicionar 20 mL de água,
acrescentar 3 gotas da solução de vermelho de metila a 0,2% (m/v) e titular com
a solução de ácido clorídrico 0,1 N. Calcular o fator de correção usando, no
mínimo, a média de três determinações.

Cálculos:

Fator de correção = _______m_______

0,12114 x V x N
Onde:
m = massa de Tris, em gramas;
V = volume da solução de ácido clorídrico 0,1 N gastos na titulação, em mL;
N = normalidade esperada da solução.

Registrar o preparo das soluções no FOR UGQ 056 – Controle de preparo de

soluções, e a padronização no FOR UGQ 079 – Padronização de soluções.

b) Preparo da solução padrão de Ácido Sulfúrico (H2SO4) 0,1N

- Transferir 3,0 mL de ácido sulfúrico p.a. para balão volumétrico de 1000 mL

contendo cerca de 500 mL de água. Esfriar e completar o volume.
- Fatoração com Tris (Hidroximetilaminometano): deixar o reativo Tris
(Hidroximetilaminometano) (C4H11NO3) p.a., padrão primário, por 24 horas em
dessecador, ao abrigo da luz. Pesar 0,1211g, adicionar 20 mL de água,
acrescentar 3 gotas da solução de vermelho de metila a 0,2% (m/v) e titular com
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a solução de ácido sulfúrico 0,1 N. Calcular o fator de correção usando, no

mínimo, a média de três determinações.

Cálculos:

Fator de correção = _______m_______

0,12114 x V x N

Onde:
m = massa de Tris, em gramas;
V = volume da solução de ácido sulfúrico 0,1 N gastos na titulação, em mL;
N = normalidade esperada da solução.

Registrar o preparo das soluções no FOR UGQ 056 – Controle de preparo de

soluções, e a padronização no FOR UGQ 079 – Padronização de soluções.

5.2. Descrição da Metodologia

5.2.1. Pesagem da amostra

Quantidades a serem pesadas, depois que as amostras foram preparadas de acordo

com a IT POA 032 – Características sensoriais e preparo de amostras de
produtos lácteos e IT POA 052 – Características sensoriais e preparo de
amostras de produtos cárneos e pescado:

- Produtos de salsicharia, enlatados e gelatina:

Micro-kjedahl: 0,25g;
Macro-Kjedahl: 1,00 g

- Produtos lácteos:

a) Leite fluído, bebida láctea:

Micro: 2,0 g;
Semi: 5,0 g;
Macro: 10,0 g.

b) Leite desidratado, caseína, caseinatos e soro desidratado:

Micro: 0,25 g;
Semi: 0,5 g;
Macro: 1,0 g.

c) Queijos:
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Micro: 0,25 g;
Semi: 0,5 g;
Macro: 1,0 g.

d) Creme de leite:
Micro: 1,0 g;
Semi: 3,0 g;
Macro: 6,0 a 10,0 g.

e) Doce de leite:
Micro: 0,25 g;
Semi: 0,5 g;
Macro: 1,0 g.

f) Leite fermentado:
Micro: 1,5 g;
Semi: 3,0 g;
Macro: 6,0 g.

5.2.2. Micro-Kjeldahl

Digestão ou mineralização:
- Pesar em balança analítica a amostra conforme o item 5.2.1, transferir para tubo
de Kjeldahl e anotar os dados brutos na ficha de análise correspondente ao
produto que está sendo analisado;
- Adicionar 2,5 g de mistura catalítica e 7mL de ácido sulfúrico p.a.;
- Aquecer em bloco digestor, a princípio lentamente, mantendo a temperatura de
50ºC por uma hora ou dependendo das instruções do fabricante do bloco
digestor. Em seguida, elevar gradativamente até atingir 400ºC. Quando o líquido
se tornar límpido e transparente, de tonalidade azul-esverdeada, retirar do
aquecimento;
- Deixar atingir a temperatura ambiente e adicionar 10mL de água.

Nota 2: Para produtos muito gordurosos, digerir a amostra com adição de um anti-
espumante.

Destilação:
- Acoplar ao destilador o erlenmeyer contendo 20mL de solução de ácido bórico a
4% com 4 ou 5 gotas de solução de indicador misto;
- Adaptar o tubo de Kjeldahl ao destilador e adicionar a solução de hidróxido de
sódio a 50% até que a mesma se torne negra (cerca de 20mL);
- Proceder à destilação, testando com papel indicador de pH até que não ocorra
mais reação alcalina. A solução receptadora deve ser mantida fria durante a
destilação;
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- Titular com solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido clorídrico 0,1 N
até a viragem do indicador.
- Registrar o volume gasto na titulação na ficha de análise correspondente ao
produto que está sendo analisado.

5.2.3. Macro-Kjeldahl

Digestão ou mineralização:
- Pesar em balança analítica a amostra, conforme o item 5.2.1, transferir para tubo
de Kjeldahl e anotar os dados brutos na ficha de análise correspondente ao
produto que está sendo analisado;
- Adicionar 5g de mistura catalítica, 20mL de ácido sulfúrico p.a.;
- Aquecer no digestor, a princípio, lentamente e depois fortemente até emissão de
vapores brancos. Quando o líquido se tornar límpido, de tonalidade azul-
esverdeada, retirar do digestor;
- Deixar atingir a temperatura ambiente.

Destilação:
- Adicionar ± 80mL da solução de hidróxido de sódio a 50% ou até que a solução a
ser destilada se torne negra;
- Receber o destilado em erlenmeyer de 250 mL com 25mL de solução de ácido
bórico a 4% e 4 a 5 gotas de solução de indicador misto;
- Titular com solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido clorídrico 0,1 N
até a viragem do indicador.
- Registrar o volume gasto na titulação na ficha de análise correspondente ao
produto que está sendo analisado.

5.3. Cálculos e expressão de resultados

% Proteína = V x N x f x F x 0,014 x 100

P

Onde:
- V = mililitros de solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido clorídrico
0,1N gastos na titulação, após a correção do branco;
- N = normalidade teórica da solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido
clorídrico 0,1 N;
- f = fator de correção da solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido
clorídrico 0,1 N;
- P = massa da amostra em gramas;
- F = fator de conversão da relação nitrogênio/proteína, de acordo com o produto:
- Carnes e derivados F = 6,25;
- Gelatina F = 5,55;
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- Produtos lácteos = 6,38.

5.4. Controle de Processo

- Fazer uma prova em branco com os reagentes;

- Verificar as condições do aparelho de destilação com Solução Padrão de Sulfato
de Amônio 0,4% ((NH4)2 SO4) de acordo com a IT POA 053 – Operação e
controle do aparelho de nitrogênio total.

6. Controle de Registros

FOR UGQ 056 – Controle de preparo de soluções

FOR UGQ 079 – Padronização de soluções

7. Controle das Alterações

Item Revisão Data da

Descrição da alteração
alterado alterada alteração
Quadro de Alterado colaborador responsável pela análise
02 05/03/12
aprovação crítica desta revisão.
2 02 05/03/12 Alterada expressão “setor” para “laboratório”.
Inclusão de “e/ou bibliográficas” para título do
3 02 05/03/12
item; Adequação de citação das referências.
4 02 05/03/12 Adequação da nomenclatura do laboratório.
5.2.3 02 05/03/12 Inclusão de volume para solução específica
Inclusão de concentração da solução de
5.4 02 05/03/12
verificação de condições do aparelho

Anexos

Item não se aplica a este documento.