Departamento de Química Orgânica

IQ-UFBA 2018.1
QUI-B37 – Química Orgânica Básica Experimental I-A

RELATÓRIO DE ATIVIDADES

Título: Identificação de substâncias orgânicas coloridas por cromatografia em coluna

e cromatografia em camada delgada
Data: 26 de Abril de 2018
Autor (*): Caroline de Sousa Farias

1. Introdução

1.1 Objetivos

 Conhecer os fundamentos da técnica de cromatografia em coluna (CC) e cromatografia

em camada delgada (CCD);
 Utilizar a técnica de cromatografia em camada delgada para identificar os compostos
presentes numa mistura;
 Determinar índices de retenção para uma série de amostras e relacionar esses valores
com a polaridade das mesmas;
 Conhecer métodos utilizados para visualização de diferentes amostras em cromatografia
em camada delgada;
 Escolher sistemas de solvente adequados para a separação de cada mistura de
substancias;
 Realizar a separação de componentes orgânicos em mistura por cromatografia em
coluna;
 Analisar qualitativamente as frações obtidas na cromatografia em coluna.

1.2 Fundamentação teórica

Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido à

facilidade com que se efetua a separação, identificação e quantificação de componentes
químicos, por si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de analise como a
espectrofotometria ou espectrometria de massas. Definida como uma técnica utilizada para
analisar, identificar ou separar componentes de uma mistura, a cromatografia é constituída
basicamente por dois componentes, uma fase estacionária e uma fase móvel. Essa técnica
permite a separação físico-química dos componentes de uma mistura através da distribuição de
componentes em duas fases que estão em contato íntimo. Uma das fases permanece
estacionária, enquanto a outra se move através dela. Durante a passagem da fase móvel sobre
a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases de tal forma
que cada um deles é seletivamente retido pela fase estacionária, o que resulta em migrações
diferenciais desses componentes.

Existem várias formas de realizar o processo cromatográfico. Os critérios mais usados para a
classificação das diferentes modalidades de cromatografia são aqueles relacionados à técnica
empregada, ao mecanismo de separação envolvido e aos diferentes tipos de fases utilizadas. A
forma física do sistema de cromatografia define a técnica geral: a fase estacionária pode ser
colocada em um tubo cilíndrico ou disposta sobre uma superfície planar. Baseando-se nisso, a
cromatografia pode ser dividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar.
Considerando-se o estado físico da fase móvel, distingue-se a cromatografia gasosa, na qual a
fase móvel é um gás inerte, a cromatografia líquida, na qual a fase móvel é um líquido que pode
interagir com os solutos, participando da separação, e a cromatografia supercrítica, na qual se
usa como fase móvel um vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima do seu ponto
crítico. A cromatografia líquida em coluna divide-se em dois grupos: cromatografia liquida
“clássica”, feita com colunas de vidro, sob pressão atmosférica com o fluxo da fase móvel mantido
pela força da gravidade, e cromatografia líquida que normalmente utiliza colunas metálicas e
pressões de fase móvel elevadas, obtidas com auxílio de uma bomba de alta pressão.
O estado físico da fase estacionária pode ser líquido ou sólido. O líquido pode estar simplesmente
espalhado sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre este. A imobilização pode envolver
ligações químicas entre os líquidos e o suporte ou somente entre as cadeias do próprio líquido.

Uma classificação importante se baseia na polaridade relativa das fases. Na cromatografia

líquida, tanto na planar quanto em coluna, as polaridades de ambas as fases são essenciais para
o desenvolvimento da técnica. Os compostos presentes em uma mistura adsorvem-se as
partículas de sólido devido a interação de diversas forças intermoleculares. Uma molécula terá
uma maior ou menor retenção, dependendo das forças de interação presentes. Essas interações
podem ser do tipo: formação de sais > coordenação > ligações de hidrogênio > dipolo-dipolo >
London (dipolo induzido). Chama-se de “cromatografia líquida com fase normal” quando a fase
estacionária é mais polar do que a fase móvel, e “cromatografia com fase reversa” quando se
tem fase móvel mais polar e a fase estacionária mais apolar. Entretanto, considera-se que uma
das classificações mais importantes em cromatografia se baseia no mecanismo de separação,
que pode se dar por processos físicos, químicos ou mecânicos. Os processos físicos são de
sorção-adsorção ou absorção (partição), fundamentadas principalmente em atrações dipolares
(forças de Van der Waals) ou coulômbicas, incluindo a forma de ligação de hidrogênio. Quando
se trata de um sólido como a sílica ou a alumina como fase estacionária, a adsorção do soluto
ocorre na interface entre o sólido e a fase móvel, devido à presença de grupos ativos em sua
superfície. Esse mecanismo é comumente encontrado em cromatografia em camada delgada
(CCD). Já quando a fase estacionária é um líquido, espalhado na superfície de um suporte sólido
e inerte, ou nas paredes do tubo cromatográfico, o processo é intrafacial: ocorre por absorção ou
partição e baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase
estacionária. Esse mecanismo é encontrado na cromatografia em papel (CP), na cromatografia
gás-líquido (CGL) e na cromatografia liquido-liquido (CLL). A cromatografia ainda pode ser do
tipo sólido-líquido (coluna, camada fina, papel), líquido-líquido (HPLC), gás-líquido (CG). Uma
das técnicas mais comuns são a cromatografia em camada delgada e a cromatografia por
adsorção (em coluna).

A cromatografia em camada delgada consiste na separação dos componentes de uma mistura

através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente (fase estacionária)
retido sobre uma superfície plana. Logo, o processo de separação está fundamentado,
principalmente no fenômeno de adsorção. O grande desenvolvimento dessa técnica é
consequência natural das múltiplas vantagens que ela oferece, tais como fácil compreensão
execução, separação em breves espaços de tempo, versatilidade, grande repetibilidade e baixo
custo. Pode ser de aplicação analítica ou preparativa, cuja escala está na dependência da
espessura da camada de adsorvente e na quantidade da amostra a ser analisada. O processo
de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção na CCD. O mercado
dispõe de uma grande variedade de adsorventes para a fins cromatográficos, os quais podem
ser adquiridos para a confecção de placas no próprio laboratório ou com placas pré-fabricadas.
Entre os adsorventes mais utilizados em CCD estão a sílica, a alumina, a celulose e a poliamida.
Em geral, dá-se preferência a placas cromatográficas pré-fabricadas, pois, apesar de serem mais
caras, dispensam a fase de preparação e são bem mais uniformes e homogêneas. Essas duas
últimas características auxiliam no rendimento da corrida cromatográfica, melhorando a
separação e tornando os valores de Rf (fator de retardamento) mais reprodutíveis. Cabe destacar
que o fator de retardamento, também chamado de fator de retenção, é um parâmetro
frequentemente utilizado em cromatografia. Ele é definido como a razão entre a distância
percorrida pela mancha do composto e a distância percorrida pelo eluente. Portanto:

Rf = dc / ds

Onde: dc = distância percorrida pelo composto da mistura (analito).

ds = distância percorrida pelo eluente.

O solvente ou mistura de solventes a serem utilizados na fase móvel devem ser escolhidos de
maneira cuidadosa, já que desempenham um papel fundamental na separação dos componentes
da mistura. Entende-se que há uma competição entre as moléculas da fase móvel e da amostra,
pela superfície adsorvente. Portanto, na escolha da fase móvel deve-se considerar a natureza
química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel. Toma-se como base
a “série eluotrópica” dos solventes, na qual são ordenados segundo a sua polaridade, as quais
estão diretamente ligados ao poder de eluição. Além disso, vale destacar que as amostras devem
ser aplicadas nas cromatoplacas (placas cromatográficas) na forma de soluções com solventes
bastante voláteis, que possam ser facilmente eliminados após a aplicação. Para a aplicação da
amostra, podem ser utilizadas micropipetas, microseringas e capilares, que permitem determinar
a quantidade de substâncias colocadas na placa. A amostra é introduzida na parte inferior da
placa de CCD, através de aplicações sucessivas de uma solução da amostra, devendo se formar
uma pequena mancha circular. À medida que o solvente sobe pela placa, a amostra é empurrada
para cima pela fase móvel ao mesmo tempo que é retida pela fase estacionária. Durante este
processo, os diversos componentes da mistura são separados, de acordo com suas estruturas
químicas. Cabe ressaltas que as gotas/ manchas devem ser aplicadas acima do nível da borda
da placa, evitando assim que fiquem mergulhados na fase móvel durante a eluição.

Existem algumas formas diferentes de desenvolvimento de um cromatograma, utilizadas sempre

com o objetivo de melhorar a obtenção da separação de componentes da mistura. Cromatograma
ascendente é o método mais utilizado, podendo ser considerado a técnica básica. A fase móvel
deve cobrir todo o fundo de uma cuba cromatográfica, até uma altura que seja inferior àquelas
das manchas na placa. As placas são colocadas na cuba em posição vertical, apoiadas no fundo
e inclinadas em direção às paredes laterais da cuba. Tão logo a fase móvel atinja a parte superior
das placas, estas são retiradas e secas rapidamente, ao ar livre ou com um secador. Após o
desenvolvimento dos cromatogramas e secagem das placas, estas são reveladas. Essa última
etapa consiste em tornar visível as substâncias incolores presentes nos compostos. Tal
visualização pode ser feita por meio de métodos físicos, químicos ou biológicos. Quando se
tratam de substâncias coradas, a visualização pode ser feita a olho nu, porém normalmente se
utilizam para a revelação de cromatoplacas a luz ultravioleta e a câmara de iodo, sendo este
último reagente com muitos compostos orgânicos formando complexos de cor café ou amarela.

Já quando a modalidade de cromatografia se utiliza de uma coluna recheada com um sólido (fase
estacionária) e uma fase móvel liquida onde a sorção isotérmica (adsorção) se refere a um
aumento da concentração do soluto entre as superfícies das fases móvel e estacionária trata-se
de cromatografia por adsorção. Empiricamente, essa cromatografia em coluna é tecnicamente
mais simples não exigindo instrumentação muito complexa. Muitos dos adsorventes empregados
em cromatografia em coluna também são usados em CCD como a sílica e a alumina. Neste caso,
a separação ocorre basicamente pela capacidade de adsorção e solubilidade das moléculas. As
fases sólidas mais comuns são a sílica gel (SiO 2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de pó.
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo. Em primeiro lugar,
a fase móvel tem a função de solvente propriamente dito (devem ser levadas em consideração
as relações de solubilidade dos componentes da mistura; devem ter baixo ponto de ebulição para
serem evaporadas facilmente). Em segundo lugar, tem função de promover o desenvolvimento
dos componentes da mistura na coluna e remover ou dessorver esses componentes do
adsorvente seletivamente (nesse último caso chamado de eluente). A seleção desses eluentes
podem ser feitas através de CCD, usando o mesmo adsorvente que será empregado no
enchimento da coluna. Quando mais uniforme for o enchimento da coluna, maior será a eficiência.
Com fases estacionárias polares, a dessorção é facilitada quando o eluente é polar e dificultada
quando a polaridade é menor.

Uma coluna cromatográfica deve ser posicionada na forma vertical para que a eluição se
processe por ação da gravidade (mais conveniente). Além disso, a posição vertical evita a
formação de canais, Geralmente a eluição se dá em etapas, com modificação gradual das fases
móveis. A fase móvel quando está passando através do adsorvente na coluna, arrasta consigo
os componentes da mistura que está sendo separada. A velocidade de movimento descendente
de um componente depende de sua adsorção pela fase estacionária, isto é, quanto mais
fracamente o componente for adsorvido, mais rápida será sua passagem pela coluna. Quanto
maior a diferença entre os coeficientes de adsorção, mais completa será a separação do
composto. Para ocorrer uma completa separação a fase móvel deve: ser fracamente adsorvido
pela fase estacionária; não ser afetada quimicamente; possibilitar realmente o desenvolvimento
de uma corrida cromatográfica. Geralmente, a mistura a ser separada é colocada em uma coluna
com um eluente (solvente) menos polar e vai se aumentando gradativamente a polaridade do
eluente e, consequentemente, o seu poder de arraste de substâncias mais polares. Uma
 sequência de eluentes normalmente utilizada é a seguinte: hexano, acetato de etila, clorofórmio,
etanol, metanol, água e ácido acético. Além disso, o fluxo de solvente na coluna deve ser
contínuo, com ou sem pressão. À medida que os compostos da mistura são separados, bandas
ou zonas móveis começam a ser formadas, sendo que cada banda deve conter somente um
composto para obter-se uma separação ideal. É muito importante escolher adequadamente as
fases estacionárias e móveis, pois se a fase estacionária escolhida interagir fortemente com todos
os compostos da mistura, ela não se moverá, e consequentemente uma separação não ocorreria.

2. Parte experimental

2.1 Resumo do experimento

2.1.1. Na cromatografia em coluna (CC) serão separados os componentes de uma mistura

colorida de fluoresceína e vermelha de metila (Vide figura 1) em uma coluna cromatográfica,
contendo sílica gel como fase estacionária.

2.1.1.1 Preparo da coluna:

 Encheu-se, com o auxílio de um funil de vidro, a coluna de vidro em 2/3 de sílica gel ;
 Transferiu-se a massa de sílica gel para um erlenmeyer e adicionar hexano;
 Transferiu-se a mistura do erlenmeyer para a coluna de vidro e aguardou-se o
empacotamento através da abertura da torneira;

2.1.1.2 Preparo de amostra:

 Adicionou-se 1 gota de metanol e 1 gota de diclorometano na mistura de fluoresceína e
vermelho de metila;
 Transferiu-se uma pequena quantidade de sílica, algumas gotas de diclorometano e gotas
da amostra para um frasco de penicilina;
 Colocou-se a amostra para secagem na capela.

2.1.1.3 Aplicação da amostra e aplicação na coluna cromatográfica:

 Transferiu-se a amostra seca para a coluna cromatográfica com o auxílio de um funil de vidro.
 Com auxílio de uma proveta de 25mL, preparou-se uma solução de 20% de diclorometano e
80% de hexano;
 Homogeneizou-se a solução;
 Adicionou-se lentamente e continuamente a solução na coluna cromatográfica e observar;
 Com auxílio de uma proveta de 25mL, preparou-se uma solução de 96% de hexano e 4%
de metanol;
 Homogeneizou-se a solução;
 Adicionou-se lentamente e continuamente a solução na coluna cromatográfica e observar;
 Com auxílio de uma proveta de 25mL, preparou-se uma solução de 91% de clorofórmio e
9% de metanol;
 Homogeneizou-se a solução;
 Adicionou-se lentamente e continuamente a solução na coluna cromatográfica e observar;
 Com auxílio de uma proveta de 25mL, preparou-se uma solução de 60% de clorofórmio e
40% de metanol.

2.1.2. Na cromatografia em camada delgada (CCD) analisou-se e identificou-se os componentes

coloridos na mistura de vermelho de metila (VM) e 4-Carboximetil-(9)10H-acridinona (ACR) (vide
figura 1) comparando-os com padrões. Seguiu-se as seguintes etapas:

 Preparação das amostras e placa: Realizou-se uma linha na placa cromatográfica de sílica
gel utilizando um lápis / grafite para determinar onde foram aplicadas as amostras. Nos
frascos com padrões (substância pura) e mistura, adicionou-se aproximadamente 0,5mL de
clorofórmio em cada frasco para diluir o material, adicionando 1 gota de metanol;
 Aplicação das amostras: Aplicou-se as amostras na distância de 1,0 cm da base inferior da
placa cromatográfica usando um capilar e aplicando-se 4 vezes cada local. Limpou-se o
 capilar após cada mudança de alíquota com auxílio de um algodão e de uma solução
clorofórmio:metanol preparado no experimento 2.1 ;
 Preparação da câmara cromatográfica: Transferiu-se 3mL do eluente (clorofórmio) em uma
câmara cromatográfica e fechou-se com uma tampa de vidro. Adicionou-se ao frasco um
pedaço de papel de filtro (Vide figura 4). Em seguida repetiu-se esse procedimento usando
uma mistura de solventes, preparado adicionando-se 0,5 mL de acetona em uma proveta,
completando o volume para 5 mL com clorofórmio;
 Eluição: Depois de preparado os frascos com os eluentes, usou-se uma pinça para colocar
as placas com a mistura aplicada na câmara cromatográfica, colocando os pontos de
aplicação para baixo;
 Obtenção do Ds: Monitorou-se a ascensão do solvente em ambas as placas cromatográficas,
interrompendo a eluição antes que o solvente alcance o limite superior da camada de gel de
sílica (vide figura 5)
 Obtenção do Dc. Com um lápis ou grafite marcou-se até que ponto o solvente alcançou nas
placas. Na sequência, observou-se a presença de manchas coloridas a olho nu, marcando
o centro dessas manchas com lápis (vide figura 5).
 Revelação: Visualizou-se as manchas coloridas formadas com o auxílio do olho nu. Em
seguida, colocou-se a segunda placa cromatográfica preparada dentro da câmara escura
com luz ultravioleta (UV)
 Determinação dos valores de Rf: Documentou-se todas as placas de CCD, calculando-se os
valores de Rf (fator de retenção) para cada um dos componentes das misturas;

Figura 1: Estruturas químicas os componentes das misturas utilizadas na CC e CCD, respectivamente

2.2 Desenho da aparelhagem

Figura 2: Representação de uma separação em cromatografia em coluna.

 Figura 3: Placas de CCD antes e depois de eluídas.

Figura 4: Passo a passo para a corrida cromatográfica com CCD

Figura 5: Placas de CCD representando Ds e Dc

2.3 Materiais

i) Reagentes e solventes
 Hexano
 Sílica gel
 Clorofórmio
 Acetona
 Metanol
 Vermelho de Metila (VM)
 Fluoresceína (FLC)
 4-Carboximetil-(9)10H-acridinona (ACR)
ii) Vidraria;
 Coluna de vidro
 Béquer
 Capilar de vidro
 Conta-gotas
  Bastão de vidro
 Funil de vidro
 Proveta
 Frasco de penicilina

iii) Materiais diversos;

 Placas de cromatografia de 7,5 x 2,5 cm
 Pinça
 Régua
 Lápis
 Papel de filtro
 Algodão

iv) Equipamentos.
 Câmara de luz ultravioleta (UV)

2.4 Tabela de propriedades físicas

d Tf Te T Solubilidade (g/L)
Substância MM
g/mL o
C o
C n D H2O EtOH CHCl3 Et2O
Hexano 86,18 0,66 -95 62-74 -- Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel
Clorofórmio 119,5 1,474 -63,5 61,2 -- 8 Solúvel Solúvel Solúvel
Diclorometano 84,93 1,330 - 95 40 -- Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel
Acetona 58,08 0,792 - 94,9 56,2 Solúvel. Solúvel Solúvel Solúvel
Pouco
Vermelho de Metila 269,31 0,989 178-182 -- -- solúvel -- -- --
Fluoresceína 332,31 -- 320 -- -- 500 -- -- --

4-Carboximetil-(9)10H-
acridinona -- -- -- -- -- -- -- -- --

Metanol 32,04 0, 792 - 97,8 64,7 -- Solúvel -- -- Solúvel

Sílica gel 60,09 -- 1.710 2.230 -- Insolúvel -- -- --

2.6. Tabela de propriedade toxicológicas

Substância Propriedades (riscos à saúde, inflamabilidade, reatividade)
Provoca irritação à pele com ressecamento e vermelhidão. Provoca irritação
aos olhos com lacrimejamento, dor e vermelhidão. Pode causar dermatite
com ressecamento por exposição repetida ou prolongada. Não é esperado
que provoque sensibilização respiratória. Pode provocar defeitos genéticos.
Hexano Pode provocar leucemia.
Nocivo por Ingestão. Irritante para a pele. Possibilidade de efeitos
irreversíveis. Risco de efeitos graves para a saúde em caso de exposição por
inalação e ingestão. Decomposição ocorre sob efeito de aquecimento ou em
contato com a chama livre. Possibilidade de efeitos cancerígenos. Reage
violentamente com oxidantes fortes.
Clorofórmio
Pode ser perigoso se for inalado. Pode causar uma irritação do aparelho
respiratório. Pode ser perigoso se for engolido. Pode ser perigoso se for
absorto pela pele. Pode causar uma irritação da pele. Pode causar uma
Diclorometano irritação dos olhos.
 Quando inalados os vapores causam irritação da mucosa. Em altas
concentrações os vapores inalados têm efeito narcótico e anestésico. Em
concentrações muito altas podem provocar até o coma. Quando ingerido
provoca problemas gastro-intestinais, dor-de-cabeça, náuseas, vômito,
narcoses e até o coma. A aspiração do produto nos pulmões pode causar
pneumonite até a morte pela dificuldade de respiração. O contato com a
pele causa o ressecamento, podendo provocar irritações e dermatites.
Causa irritação dos olhos, conjuntivite e queimadura química (líquido).
Reação violenta no contato com álcalis concentrados e metais alcalinos e
Acetona alcalinos terrosos. Muito volátil e muito inflamável.
Essa substância não é classificada como perigosa pela ONU. Quando em pó,
Vermelho de Metila em caso de vazamento pode causar irritação nas mucosas nasais.
Substância não considerada como perigosa de acordo com GHS. Pode ser
Fluoresceína perigoso se for engolido.
4-Carboximetil-(9)10H-
acridinona Não é inflamável
Líquido e vapores altamente inflamáveis. Fatal se ingerido. Pode prejudicar
a fertilidade ou o feto

A ingestão, mesmo de pequenas quantidades (30 a 100 ml) pode causar

cegueira ou morte. Os efeitos de doses sub-letais podem ser náuseas, dores
de cabeça, dores abdominais, vômitos e perturbações visuais, desde visão
enevoada à sensibilidade à luz. Em contato com os olhos pode causar
irritação dos olhos, lacrimejar e queimaduras. Reage com oxidantes fortes,
minerais fortes ou ácidos orgânicos e bases fortes.

Metanol
Sílica gel Produto não perigoso

3. Resultados, discussão, observações e conclusões

3.1 Observações
Com relação ao desenvolvimento da corrida cromatográfica com a cromatografia em coluna,
primeiramente foi realizada a preparação do adsorvente. Neste caso foi utilizado a sílica gel
como fase estacionária, fase essa que adsorve os componentes da mistura que foi colocada
nas etapas posteriores. Assim, pode-se inferir que a fase estacionária empregada neste caso
é polar, sendo a adsorção da mistura de corantes ocorrida na interface entre o sólido e a fase
móvel, devido à presença de grupos hidroxilas ativos em sua superfície (Figura 6):

Figura 6: Estrutura química da superfície da sílica gel

Disponível em: <http://qnint.sbq.org.br/qni/popup_visualizarMolecula.php?id=boN24Kcn7e6-1nZwD-
0U--RWDC00HA5ejETh55Jk4g0MbupxiziRCvtyRVxK6i9VhC49_gE2CJ6vMIeDSzlwNg>
Após encher 2/3 da coluna com a fase estacionária, colocou-se a sílica seca no erlenmeyer
e adicionou-se hexano. Isso é necessário para se evitar a formação de bolhas na fase
estacionária, bolhas estas que podem dificultar a separação das camadas através da
formação de caminhos preferenciais. Após a transferência do sistema sílica/solvente para a
coluna, obteve-se o seguinte conjunto (Figura 7), dando início ao empacotamento da sílica.

Figura 7: Empacotamento da sílica na coluna cromatográfica

Foi percebido que após a transferência, a superfície da fase estacionária ficou nivelado, o que
é uma característica necessária para o desenvolvimento correto da corrida cromatográfica.
Com o empacotamento adequado, demonstrado também pela não percepção de bolhas ou
rachaduras, deu-se início a preparação da amostra. Para tal, utilizou-se algumas gotas da
amostra, uma porção de sílica e uma porção de diclorometano. Isso porque, como a fase
estacionária é a sílica, e é necessário que a amostra esteja uniformemente distribuída sob a
camada mais superficial da fase estacionária, utilizou-se a própria sílica para que adsorvesse
a mistura de vermelho de metila e fluoresceína, se valendo do diclorometano como solvente
para promover essa adsorção. O diclorometano é um bom solvente para tal função pois este
é volátil, permitindo então que, após a sua evaporação, se apresente a mistura de cor
vermelha retida na sílica seca. Assim, depois da evaporação, foi aplicado a amostra na
coluna, obtendo-se o seguinte conjunto (Figura 8):

Figura 8: Coluna cromatográfica após aplicação da amostra

Para dar início à corrida cromatográfica, procedeu-se a escolha do solvente ou mistura de
solventes adequada. Como esta cromatografia se trata de uma cromatografia em fase normal
(fase estacionária mais polar), utilizou-se a série eluotrópica (figura 9) de solventes como
base para efetuar a escolha. Como não se sabia qual a melhor opção, escolheu-se
inicialmente uma mistura de solventes com o clorofórmio e hexano, numa proporção de 20%
de clorofórmio para 80% de hexano. Assim, foi utilizado inicialmente uma mistura de solventes
de característica mais apolar. Após adicionar lenta e continuamente a mistura de solventes
na coluna, com o intuito de evitar a ressuspensão da sílica, percebeu-se que não houve a
separação das fases. Isso porque, observando-se a estrutura molecular do vermelho de
metila e fluoresceína (figura 1), pode-se perceber que estes possuem muitos grupamentos
polares. Esses compostos estabelecem principalmente ligações de hidrogênio, uma vez que
possuem grupos hidroxilas em ambas as moléculas. Esses grupamentos fazem com que
ambos os compostos se adsorvam efetivamente na superfície da sílica que tem caráter polar,
não sendo então baixa polaridade da mistura de solventes capaz de superar essa adsorção
e carrear os compostos.

Figura 9: Série eluotrópica de solventes

Disponível em: <http://ptdocz.com/doc/1287745/guia-sbq-ccd-regua_2015--cian-gr%C3%A1fica-2-.>

Em seguida, ao substituir o eluente por uma mistura de hexano e metanol, numa proporção
de 96% de hexano e 4% de metanol, percebeu-se a separação das fases, como pode ser
observado a seguir (figura 10). Nesse caso, observou-se que o vermelho de metila foi
arrastado pela fase móvel, evidenciado pela descendência da coloração vermelha, enquanto
que a fluoresceína permaneceu mais adsorvida na fase estacionária, evidenciada pela
presença da coloração verde na parte superior da coluna.
Figura 10: Separação das fases na coluna cromatográfica após adição de solvente hexano:metanol

Isso ocorre porque, com a adição de metanol quando comparado com eluente anterior, há a
aumento da polaridade da mistura de solventes. Isso devido ao fato de metanol ser um
composto da extremidade polar da série eluotrópica. Contudo, como na mistura tem uma
maior proporção de hexano, que é apolar, pode-se inferir que a mistura de solventes é
predominantemente apolar. Como o vermelho de metila descendeu mais rapidamente na
coluna, pode-se inferir que este é mais apolar que a fluoresceína, que por sua vez fica mais
retido na sílica. Isso porque, o vermelho de metila estabelece interações com o hexano e com
o metanol, porém mais interação com o hexano dado a sua característica mais apolar. Já a
fluoresceína estabelece interações com o metanol presente, do tipo ligação de hidrogênio e
pouca interação com hexano, que por estar em maior quantidade não consegue vencer a
competição com a sílica. A fluoresceína é mais dificilmente arrastada, devido à pouca
afinidade com a fase móvel.

Já quando se substitui o eluente por uma mistura de clorofórmio e metanol, numa proporção
de 91% de clorofórmio e 9% de metanol, percebeu-se a separação das fases, como pode ser
observado a seguir (figura 11). Nesse caso, observou-se que a fluoresceína foi mais arrastada
pelo eluente, evidenciado pela descendência da coloração verde pela coluna cromatográfica,
se aproximando da fase que continha vermelho de metila.

Figura 10: Separação das fases na coluna cromatográfica após adição de solvente
clorofórmio:metanol (91% : 9%)
Isso ocorre porque, com a adição de clorofórmio e aumento da proporção do metanol em
relação ao eluente anterior, há a aumento da polaridade da mistura de solventes. Isso porque
o clorofórmio é um composto mais polar que o hexano. Dessa forma, com a mistura mais
polar há o arraste da fluoresceína, que tem mais afinidade com o solvente do que com a sílica.
Como o eluente vence a competição com a sílica, a fluoresceína descende na coluna. Vale
destacar que foi observado, durante esse processo, que na parte superior da coluna se
apresentavam estruturas mais escuras que não foram arrastadas. Isso se deve ao fato de a
fluoresceína se encontrar impura, sendo essas partículas provavelmente estruturas oxidadas
do composto. Devido ao pouco tempo hábil, não houve a separação com uma grande
distância entre as frações, que se encontraram próximas entre si.

Quando se substitui o eluente por uma mistura de clorofórmio e metanol, porém numa
proporção de 60% de clorofórmio e 40% de metanol, percebeu-se a descendência da
fluoresceína mais rapidamente. Assim pode-se recolher as fases, com auxílio de erlenmeyer
como pode ser observado a seguir (figura 11 e 12). Isso ocorre pois com o aumento da
proporção de metanol, a interação do eluente com o fluoresceína aumenta, fazendo com que
essa fase descenda na coluna rapidamente. Vale ressaltar que, ao recolher a fração que
continha vermelho de metila, pode-se perceber a mudança da coloração de vermelho para
laranja. Isso ocorre pelo fato de o vermelho de metila ser um indicador de pH, ficando
alaranjado em meios com pH acima de 6,2.

Figura 11: Separação das fases após a Figura 12: Fração referente ao
adição do sistema de solventes com vermelho de metila após separação das
clorofórmio:metanol (60% : 40%) fases

No que concerne a cromatografia em camada delgada, após a etapa de preparação das

amostras e das placas, preocupou-se com a aplicação das amostras. Para tal utilizou-se um
capilar, aplicando-se 4 vezes no mesmo local para que houvesse a concentração do
composto na mancha. Aplicou-se na seguinte ordem: Padrão de ACR (4-Carboximetil-(9)10H-
acridinona), Mistura de ACR e VM, Padrão de VM (vermelho de metila), como pode ser
observado na figura a seguir (figura 13):
Figura 13: Manchas de padrão de ACR (amarelo), mistura de ACR com VM (vermelho) e padrão de
VM (laranja)

Após essa etapa, colocou-se a placa na cuba de vidro contendo primeiramente 3 mL de

clorofórmio, sendo esse a fase móvel. Como não se sabia o comportamento da amostra e
dos padrões frente as solventes, escolheu-se por iniciar a corrida com um solvente de
polaridade intermediária da série eluotrópica. Cabe destacar que foi colocado um papel de
filtro na cuba para facilitar a vaporização/saturação da mesma com os vapores do solvente.
Após colocar a placa na cuba e esperar alguns minutos para que o clorofórmio ascendesse
na placa (Figura 14), obteve-se o seguinte padrão de manchas (Figura 15):

Figura 15: Placa cromatográfica 1 após

Figura 14: Placa cromatográfica 1 o final da corrida cromatográfica com
durante a eluição do clorofórmio clorofórmio
Neste caso percebeu-se que o clorofórmio não possui uma polaridade adequada para o
arraste dos componentes, uma vez que entre as manchas não houve uma grande separação.
Isso implica que a interação com a sílica é mais forte do que a interação dos componentes
com o eluente, necessitando assim de um solvente ou sistema de solventes com uma
polaridade maior, porém não tão grande a ponto de chegar ao fim da corrida e arrasta-los
completamente. Por essa razão repetiu-se o procedimento anterior, substituindo o eluente por
um sistema de solvente com 10% de acetona (mais polar) e 90% de clorofórmio (mais apolar),
obtendo-se o seguinte resultado (Figura 16):

Figura 16: Placa cromatográfica 2 após o final da corrida cromatográfica com mistura de solventes
(acetona e clorofórmio)

Nesse caso pode-se perceber que o sistema de solventes utilizado foi adequado para a
separação dos compostos dos padrões e da mistura, obtendo-se manchas separadas entre
si. Isso porque, a mistura de solventes consegue ter uma maior afinidade com os
componentes do que os componentes com a sílica. Foi percebido, para a mistura, a
separação em 2 manchas em maiores proporções: uma amarela e outra vermelha, sendo
que cada uma delas corresponde a um composto distinto. Além disso, pode-se perceber
que algumas manchas do padrão tiverem comportamento semelhante com a da mistura.
Sabendo-se que a primeira mancha, da esquerda para a direita trata-se de padrão de ACR,
pode-se perceber que esta possui uma mancha amarela na parte superior da placa que se
assemelha com a mancha amarela presente na corrida referente a mistura (círculos
vermelhos na figura 16). Isso também ocorre com as manchas vermelhas da mistura e do
padrão de VM , que foram semelhantes em altura e em coloração (círculos pretos na figura
16). Isso indica que o composto amarelo presente no padrão de ACR é o mesmo
apresentado na mancha amarela da mistura; e que a mancha vermelha do padrão de VM
tem o mesmo composto que é apresentado na mancha vermelha mistura. Para que isso
fosse confirmado, realizou-se os cálculos dos fatores de retenção para cada uma dessas
manchas. Sabendo-se que o total de comprimento da corrida foi 5,1 cm, tem-se:
 5,1 cm
3,35 cm 3,4 cm

2,0 cm

Figura 17: Esquematização para obtenção do Ds e Dc

Rf para padrão de ACR: 3,4/5,1 = 0,66

Rf para mancha amarela na mistura: 3,35/5,1 = 0,656 ~ 0,66
Rf para padrão de VM: 2,0/5,1 = 0,39
Rf para mancha vermelha da mistura: 2,0/5,1 = 0,39

Assim, pode-se inferir que, como os padrões de ACR e VM apresentaram o mesmo Rf da

mistura, pode-se afirmar que os compostos apresentados nas manchas amarelas são
iguais, e os compostos apresentados nas manchas vermelhas são iguais. Logo há a
comprovação que de fato, na mistura se apresentava o ACR e o VM. Vale ressaltar que,
também foi possível se perceber manchas alaranjadas e amareladas entre os pontos de
interesse. Isso é indicativo da presença de impurezas tanto nos padrões quanto na mistura.
Para a confirmação ainda do padrão de eluição das manchas na placa, realizou-se a
revelação da placa na câmara de UV, que revela os compostos que apresentam grupos
cromóforos capazes de exibir fluorescência, obtendo-se o seguinte resultado (Figura 18):

Figura 18: Placa durante a revelação na câmara UV

Com essa revelação foi possível confirmar a semelhança entre os comportamentos das
manchas dos padrões com o comportamento das manchas da mistura.
3.2 Conclusões

Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que a cromatografia em coluna e em
camada delgada são técnicas que permitem separar diferentes substâncias, uma vez que
permitiu separar a fluoresceína do vermelho de metila em uma mistura e separar o 4-
Carboximetil-(9)10H-acridinona do vermelho de metila em outra mistura. Também pode-se
perceber a importância em se escolher adequadamente os solventes a serem empregados
em cada técnica, sendo essa seleção por vezes a diferença entre uma separação bem
sucedida e uma mal sucedida. Isso pode ser observado na separação inadequada de 4-
Carboximetil-(9)10H-acridinona e vermelho de metila com clorofórmio. Também pode-se
concluir que a cromatografia em camada delgada é uma técnica útil para a identificação de
compostos em uma mistura, uma vez que se for comparada com um padrão pode-se inferir
se aquela mistura se trata ou não dos compostos que se suspeitam. Desta forma, conclui-se
que a cromatografia em camada delgada e em coluna são técnicas polivalentes, havendo um
grande destaque para a sua versatilidade e amplitude de aplicações, além de serem de baixo
e de fácil execução.

4. Respostas do questionário

1. Cite os principais tipos de forças que fazem com que os componentes de uma
mistura sejam adsorvidos pelas partículas de um sólido.
Os principais tipos de forças são de sorção-adsorção ou absorção (partição),
fundamentadas principalmente em atrações dipolares (forças de Van der Waals) ou
coulômbicas, incluindo a forma de ligação de hidrogênio.

2. Cite as características que um solvente deve apresentar para lavar ou arrastar os

compostos adsorvidos na coluna cromatográfica.
O solvente deve possuir interações com os grupos funcionais dos compostos que devem
ser separados de maneira mais eficiente que a interação destes compostos com a fase
estacionária e de preferência devem ser voláteis.

3. Por que se deve colocar papel filtro na parede da cuba cromatográfica?

Para que haja a saturação dos vapores do eluente na cuba cromatográfica e facilitar a
ascensão do solvente na placa.

4. Se os componentes de uma mistura, após a corrida cromatográfica, apresentam

manchas incolores, qual o processo empregado para visualizar estas manchas na
placa?
Pode ser utilizado uma câmara de iodo ou uma câmara de ultravioleta. Isso porque os
vapores de iodo são capazes de reagir com muitos compostos orgânicos formando
complexos de cor café ou amarela. Pode ser usado, ainda nitrato de prata, para derivados
halogenados, 2 ,4 -dinitrofenilhidrazina, paracetonas e aldeídos, verde de bromocresol
para ácidos, ninhidrida para aminoácidos Já a câmara de UV revela os compostos que
apresentam grupos cromóforos capazes de exibir fluorescência

5. O que é e como é calculado o Rf?

Chamado de fator de retardamento, é definido como a razão entre a distância percorrida
pela mancha do composto e a distância percorrida pela mancha do composto e a distância
percorrida pelo eluente. É calculado pela fórmula:
Rf = dc / ds
Onde: dc = distância percorrida pelo composto da mistura (analito)
ds= distância percorrida pelo eluente

6. O valor de Rf pode ser considerado absoluto na caracterização de uma amostra?

Sim, pois quando as condições práticas são completamente especificadas, o valor de Rf
é constante para qualquer composto dado e correspondente a uma propriedade física.
 7. Quais os usos mais importantes da cromatografia de camada delgada (CCD)?
Os usos mais importantes para a cromatografia em camada delgada são para a separação
rápida e análise qualitativa de pequenas quantidades de material. Usada também para
determinar a pureza de um composto, identificar componentes de uma mistura e
acompanhar o curso de uma reação a través do desaparecimento do(s) reagente(s)
limitante(s) e aparecimento do(s)produto(s).

8. Quais compostos são os mais polares entre os pares C1, C2 e C3?

No par C1, a fluoresceína é mais polar. Já no par C2 o DNB é o mais polar. No par C3, o
vermelho de metila é o mais polar.

9. Nas análises de CCD deve-se buscar sempre que o Rf da amostra fique entre 0,45 e
0,55, ou seja, preferencialmente no meio da placa cromatográfica. Explique porque não
é desejável que uma mancha fique muito próxima da base ou da Ds.
Isso porque se a mancha ficar muito retida as machas não irão se separar adequadamente,
podendo ficar compostos coeluídos. Nessa situação fica dificultada a identificação de cada
composto, pois eles podem ficar unidos em uma só mancha.

10. Bibliografia
 COLLINS, C.H., BRAGA, G.L., BONATO, P.S. Fundamentos da cromatografia.
Campinas. Editora da Unicamp, 2006

 Ficha de segurança (FISPQ), Sigma- Aldrich. Diclorometano, 2010. Disponível em:

<http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/Diclorometano.pdf>. Acesso em: 26 abril. 2018

 Ficha de segurança (FISPQ), Chemco, Acetona, 2011 Disponível em: <

http://www.hcrp.fmrp.usp.br/sitehc/fispq/Acetona.pdf>. Acesso em: 26 abril. 2018

 Ficha de segurança (FISPQ), Sigma-Aldrich, Clorofórmio, 2009 Disponível em: <

http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/Cloroformio.pdf>. Acesso em: 26 abril. 2018

 Ficha de segurança (FISPQ), Sigma-Aldrich, Hexano, 2011 Disponível em: <

http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/Hexano.pdf>. Acesso em: 26 abril. 2018

 Ficha de segurança (FISPQ), Sigma-Aldrich, Metanol Disponível em: <

http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/Alcool%20metilico.pdff>. Acesso em: 26 abril. 2018

 Ficha de segurança (FISPQ), Anidrol, Vermelho de metila, 2015 Disponível em: <
http://www.anidrol.com.br/fispq/VERMELHO%20DE%20METILA%20A-1450.pdf >. Acesso
em: 26 abril. 2018

 Ficha de segurança (FISPQ), EEL, Fluoresceína, 2010 Disponível em: <

http://www.qeelquimica.com.br/fispqs/FISPQ-%20Fluoresceina%20Sodica.pdf >. Acesso
em: 26 abril 2018

 Ficha de segurança (FISPQ), Labysinth, Sílica gel, 2010 Disponível em: <
https://www.fca.unicamp.br/portal/images/Documentos/FISPQs/FISPQ-
%20Silica%20Gel.pdf>. Acesso em: 26 abril 2018