I - Introdução

O termo “cromatografia” é atribuído ao botânico russo Mikhail Tswett, que, em 1906,

empregou este termo em dois de seus trabalhos, descrevendo suas experiências na separação
dos componentes de algumas misturas. Num desses trabalhos, ele separou vários pigmentos de
planta, como a clorofila e a xantofila, passando soluções destes compostos através de uma coluna
de vidro recheada com carbonato de cálcio finamente dividido. As espécies separadas
apareceram como bandas coloridas na coluna, o que levou a escolha do nome para o método (do
grego, chroma = cor e graphein = escrever).

A cromatografia é um método que utiliza diversas técnicas e tem como objetivo principal a
SEPARAÇÃO de substâncias de uma mistura, com fins analíticos ou preparativos. Os
componentes da mistura são distribuídos por duas fases imiscíveis, uma estacionária (sólida ou
líquida) e outra móvel (gasosa ou líquida), que estão em contato. A separação resulta das
diferentes velocidades com que os componentes são arrastados pela fase móvel de acordo com
as diferentes interações com a fase estacionária e, em alguns casos, com a fase móvel também.

A tabela abaixo mostra algumas combinações de fases estacionárias e fases móveis:

Fase Móvel Fase Abreviatura Mecanismo de Tipo de cromatografia
Estacionária separação
líquido sólido CLS adsorção cromatografia líquida
gás sólido CGS adsorção cromatografia gasosa
líquido líquido CLL partição cromatografia líquida
gás líquido CGL partição cromatografia gasosa

Cada uma dessas combinações envolve diferentes mecanismos de separação. Por

exemplo, na CLS acontece, em geral: adsorção na superfície do sólido e interação resultante da
troca iônica ou da formação de complexos. Na CGS também ocorre, de maneira geral, o
fenômeno da adsorção. Na CLL ocorre a partição definida pela solubilidade relativa do soluto nos
dois líquidos. Na CGL dá-se a partição do soluto definida pela pressão parcial de vapor do soluto
na solução.

A fase estacionária, de forma geral, é acondicionada nas chamadas colunas

cromatográficas, que na sua maioria são tubos de vidro ou metal de dimensões diversas. Quando
essa fase é um sólido, basta que a coluna seja preenchida com o mesmo, de acordo com técnicas
especiais. Por outro lado, quando a fase estacionária é um líquido, esse pode tanto revestir as
paredes da coluna, no caso de colunas capilares, quanto estar aderido a um suporte sólido com o
qual se enche a coluna.

A amostra é introduzida na coluna e a fase móvel carreia os diversos componentes dessa

amostra através da coluna e, dependendo do tipo de cromatografia, pode participar ou não da
separação. Assim, a separação dos diversos componentes será dada em função de uma maior ou
menor afinidade de cada um deles, por cada uma das fases. Logo, o componente com maior
afinidade pela fase estacionária fica mais tempo retido na coluna, enquanto aquele que tiver mais
afinidade pela fase móvel percorrerá a coluna com mais rapidez (fig. 1). Outras características
importantes na separação serão o tamanho da molécula, sua massa e, no caso da cromatografia
em fase gasosa, sua pressão de vapor (ou ponto de ebulição).
FIGURA 1 - Desenvolvimento da cromatografia: (a,b,c) - ilustração esquemática de uma separação
utilizando cromatografia líquida; (d) - gráfico representativo de frações coletadas durante a eluição.

II – As Classificações da Cromatografia

Segundo o sistema físico empregado

• cromatografia em coluna - fase estacionária colocada dentro de um tubo cilíndrico;

• cromatografia planar - fase estacionária disposta sobre uma superfície planar.

Segundo o estado físico da fase móvel

• cromatografia (em fase) gasosa – a fase móvel é um gás.

• Cromatografia (em fase) líquida – a fase móvel é um líquido.

Segundo o mecanismo de separação (processos físicos, químicos ou mecânicos)

• cromatografia por adsorção (líquido-sólido, CLS) - a adsorção do soluto ocorre na interface

entre a fase estacionária sólida e a fase móvel, devido à presença de grupos ativos na sua
superfície (figura 2-a);

• cromatografia por partição (líquido-líquido, CLL) - quando a fase estacionária é um líquido,

espalhado na superfície de um suporte sólido inerte, ou nas paredes do tubo
cromatográfico. O processo baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da
amostra na fase estacionária e na fase móvel (figura 2-b);

• cromatografia por troca iônica (CTI) - a fase estacionária é constituída de uma matriz onde
são adicionados grupos funcionais ionizáveis. Assim são obtidos os trocadores aniônicos
que têm sítios ativos carregados positivamente, retendo ânions, e os trocadores catiônicos
que têm sítios ativos carregados negativamente, retendo cátions. A fase móvel é,
geralmente, uma solução iônica com propriedades tamponantes e compatível com o tipo
de trocador utilizado. Dessa forma, se a fase estacionária retém cátions, a fase móvel deve
conter cátions capazes de substituí-los preferencialmente (figura 2-c);

• cromatografia por bioafinidade - a fase estacionária apresenta grupos com especificidade

biológica (antígeno, enzimas, etc.) quimicamente ligados a uma matriz. A eluição dos
componentes retidos pode ocorrer com uma mudança nas propriedades da fase móvel,

2
 como força iônica e pH, ou por deslocamento, usando outro grupo fortemente atraído
(figura 2-d);

• cromatografia por exclusão (permeação em gel ou peneira molecular) - baseia-se em

processo puramente mecânico. A fase estacionária é uma matriz de composição inerte,
com partículas com forma, tamanho e porosidade uniformes. As diferentes moléculas da
amostra são separadas de acordo com sua capacidade de penetrar nos poros da matriz,
conforme seu tamanho e sua forma; as menores ficam mais tempo retidas porque entram
nos poros (figura 2-e).

FIGURA 2 - Esquema dos mecanismos cromatográficos de a: adsorção; b: partição; c: troca iônica; d:

bioafinidade e e: exclusão.

3
III – Cromatografia Planar

Na cromatografia planar, a fase móvel, proveniente de um reservatório, passa através do

ponto de partida da amostra ("spot") e arrasta seus componentes durante o processo de
desenvolvimento. Define-se por dr a distância percorrida pelos componentes e por dm a distância
percorrida pela fase móvel.

FIGURA 3 - Cromatograma típico desenvolvido por cromatografia planar.

A análise qualitativa de uma substância realiza-se através de seu fator de retenção (Rf)
que se determina utilizando-se a expressão:

Rf = dr / dm

O Rf é uma constante física de uma determinada substância desde que permaneçam

constantes as condições da análise cromatográfica.

Existem dois tipos de cromatografia planar:

• Cromatografia em Papel - é uma técnica simples, que utiliza pequena quantidade de

amostra, de fácil reprodução de Rf e aplica-se, principalmente, na separação e
identificação de compostos polares. Classifica-se como cromatografia planar por partição
líquido-líquido.

A água, um líquido bastante polar, tem grande afinidade pelas hidroxilas da estrutura da
celulose, formando pontes de hidrogênio. Por isso fica retida, funcionando como fase
estacionária. Os líquidos menos polares (solventes orgânicos) são repelidos por essa
estrutura e funcionam como fase móvel (partição entre a água e o solvente orgânico).

Normalmente, as substâncias separadas são incolores, necessitando artifícios externos

para serem observadas. São utilizados métodos químicos e físicos para detectar as
substâncias separadas.

QUÍMICOS: solução reveladora ou agente cromogênico.

4
 FíSICO: muitas substâncias orgânicas absorvem radiações de luz ultravioleta tornando-se
fluorescentes.

• Cromatografia em Camada Delgada - consiste na separação dos componentes de uma

mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido
sobre uma superfície plana. É uma técnica de fácil execução, que fornece separações em
breve espaço de tempo, versátil, de boa reprodutibilidade e de baixo custo.

O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção.

Entretanto, usando fases estacionárias tratadas, pode ocorrer também por partição ou
troca iônica, o que permite maior versatilidade.

Os adorventes mais usados são sílica, alumina, celulose e poliamida.

Após o desenvolvimento do cromatograma as placas são secas e reveladas. Assim como

na cromatografia em papel, também podem ser utilizados agentes cromogênicos ou luz
UV, de acordo com a amostra analisada. Para compostos orgânicos é muito utilizada a
exposição da “cromatoplaca” a vapores de iodo em recipiente fechado, resultando em
manchas marrons (iodo é adsorvido por compostos orgânicos). A grande vantagem desse
método é que o iodo, na maioria dos casos, pode ser eliminado posteriormente através de
aquecimento brando.

5
 IV – Cromatografia em Coluna

Para facilitar o entendimento dos parâmetros aplicados à cromatografia em coluna,

usaremos como exemplo a cromatografia clássica em fase líquida. No entanto, os mesmos podem
ser aplicados a qualquer técnica cromatográfica realizada em coluna.

Os métodos líquido-sólido (adsorção), líquido-líquido (partição), troca iônica e exclusão

podem ser realizados numa coluna recheada. A cromatografia em coluna por adsorção é, em
geral, a primeira a ser realizada porque é tecnicamente mais simples, não exigindo
instrumentação esmerada. Dependendo do tamanho da coluna usada é facilmente aplicada para
fins preparativos, devendo ser monitorada, principalmente, por cromatografia em camada delgada.

FASE MÓVEL

AMOSTRA

FASE DIREÇÃO DO
ESTACIONÁRIA FLUXO DA
FASE MÓVEL

COLUNA (METAL
OU VIDRO) BANDAS
SEPARADAS

MATERIAL DE
RETENÇÃO ELUIÇÃO DAS
BANDAS
SEPARADAS

r
e
s
p

d
e
t
e
c
t
o
r
tempo ou volume

Ordem de retenção: C>B>A

FIGURA 4 - Eluição de três compostos em mistura por cromatografia em coluna e cromatograma típico de
cromatografia em coluna.

6
 A cromatografia clássica em coluna tem a desvantagem de produzir cauda (efeito de
difusão, resultando num pico não simétrico) e, além disso, não apresenta boa reprodutibilidade.

Na cromatografia líquida a escolha do eluente (fase móvel) é um dos passos mais

importantes, pois este não deve interagir com a fase estacionária e deve promover a separação
dos componentes da amostra. Muitas vezes é necessária a utilização de misturas de solventes ou
de diferentes solventes em seqüência.

No caso da cromatografia por adsorção, deve-se seguir uma série gradual de eluentes, do
menos polar para o mais polar, e as substâncias eluirão da coluna segundo a sua polaridade. Se o
eluente mais polar for utilizado primeiro, este será capaz de eluir todas as substâncias do interior
da coluna.

Parâmetros Cromatográficos

Coeficiente de Partição

O equilíbrio de distribuição que ocorre durante o processo cromatográfico é descrito por

uma simples equação que envolve a transferência do analito entre uma fase móvel e uma
estacionária. Para o analito A, tem-se:

AFM ↔ AFE

A constante K para esse equilíbrio é chamada de coeficiente de partição e é definida como:

K = [A]FM / [A]FE

Tempo de Retenção - tR

O tempo de retenção é o tempo que cada soluto leva para percorrer a coluna e no qual o
pico correspondente ao soluto vai aparecer. É a soma do tempo gasto entre a fase estacionária e
a fase móvel. Quanto mais forte é a interação entre o soluto e a fase estacionária, maior será seu
tempo de retenção.

Tempo Morto (tempo de retenção para um composto não retido) – tM

O tempo morto é o tempo que um composto que não interage com a fase estacionária leva
para percorrer a coluna, fazendo isto à mesma velocidade que a fase móvel. Esse valor é o
mesmo para todos os compostos numa mesma corrida cromatográfica.

Fator de Capacidade ou Fator de Retenção - k

É um importante parâmetro empregado para descrever as velocidades de migração dos

analitos nas colunas. É a razão entre o tempo gasto pelo soluto na fase estacionária e na fase
móvel, calculado pela equação:

k = (tR - tM) / tM = t'R / tM

7
 Quando k é muito menor que 1, a eluição ocorre tão rapidamente que pode não ser
possível a determinação do tempo de retenção. Quando k é muito grande, o tempo de eluição ode
ser muito longo. Um composto não retido apresenta k = 0.

Fator de Seletividade - α

O fator de seletividade de uma coluna para duas espécies A e B é definido como:

α = kB / k A

Onde kB é o fator de capacidade da espécie mais fortemente retida, B, e kA é o fator de

capacidade da espécie mais rapidamente eluída, A. Por definição α é sempre maior que 1.
Quanto maior que 1, mais seletivo é o sistema.

α = k2 / k1

α = tr2 – t0 / tr1 – t0
FIGURA 5 - Esquema para o cálculo da seletividade de um sistema cromatográfico para dois compostos.

Eficiência da Coluna

A eficiência de uma coluna cromatográfica é medida em termos de pratos teóricos. Um

prato teórico pode ser considerado equivalente a uma etapa de equilíbrio entre as duas fases,
análogo aos pratos teóricos da teoria de destilação, e é definido como:

N = L/H

onde N é o numero de pratos, H é a altura do prato e L é a altura da coluna (geralmente em cm).

Quanto maior o número de pratos e/ou quanto menor a altura do prato, mais etapas de equilíbrio
existirão, maior será a eficiência e, portanto, melhor a separação. A eficiência de uma coluna está
relacionada à obtenção de picos estreitos no menor tempo possível.

A coluna cromatográfica é tratada como se fosse composta de numerosas estreitas

camadas, dispostas de maneira contínua, chamadas pratos teóricos. Em cada prato, o equilíbrio
das espécies entre as fases móvel e estacionária acontece. O movimento do analito através da
coluna é tratado como se ele fosse transferido da fase móvel de um prato teórico para outro.

Avaliação experimental de N e H:

N = 16(tR/W)2

H=L/N

8
onde W é a largura da base do pico cromatográfico correspondente. Para que esses números
tenham significado comparando-se duas colunas, é essencial que eles sejam determinados para
um mesmo composto.

Resolução (Rs)

A resolução de um sistema cromatográfico é uma medida da habilidade de separar dois

analitos. Quanto maior a resolução, menor será a sobreposição entre dois picos. A resolução leva
em conta a posição (tR) e a largura dos picos (w).
FIGURA 6 - Esquema para o cálculo da resolução entre dois picos.

Rs = 2[(tR)2 - (tR)1]
W1 + w2

A finalidade mais importante de qualquer separação cromatográfica é a de resolver os

componentes da amostra. Portanto, deve-se considerar os parâmetros experimentais que
influenciam a resolução. A figura 8 mostra três cromatogramas, destacando as contribuições da
eficiência e da seletividade na resolução. Assim, má eficiência e má seletividade resultam em má
resolução (figura 7-a). Quando a seletividade é boa, pode-se compensar a má eficiência (figura 7-
b). O ideal é boa resolução conquistada com boa eficiência e boa seletividade, (figura 7-c).

FIGURA 7 - Cromatogramas ilustrando a relação entre resolução, seletividade e eficiência.

9
 A resolução de um sistema cromatográfico pode ser considerada adequada para Rs ≥ 1,5.
Para a otimização da resolução, algumas atitudes podem ser tomadas:

• aumentar N ⇒ aumento no tamanho da coluna ⇒ aumenta tempo.

• diminuir H ⇒ diminuindo o tamanho das partículas que constituem a fase estacionária.

• otimização do fator de capacidade ⇒ valores para relação ótima entre resolução e tempo
gasto: k = 1 a 5.

• otimização do fator de seletividade ⇒ pode ser otimizado por mudanças na composição da

fase móvel, incluindo pH e força iônica, temperatura da coluna, etc.

V - Exercícios

1) (Sec. de Estado de Saúde - RJ 1995) distância de 18cm e as substâncias A e B

Duas substâncias X e Y foram submetidas à
cromatografia de partição em papel, usando-
se tiras de 20cm de comprimento. O
deslocamento do eluente foi de 16cm e os
valores encontrados de Rf foram 0,5 e 0,3,
respectivamente. Logo, as presenças de X e
Y foram observadas a uma distância do
"spot" igual a:
(a) 2,5 e 1,5.
(b) 5 e 3.
(c) 8 e 4,8.
(d) 10 e 6.
(e) 16 e 9,6.
2) (Sec. de Estado de Saúde - RJ 1995) As
substâncias A e B foram submetidas à
análise cromatográfica em camada fina e
apresentaram valores de Rf iguais a 0,38 e
0,62, respectivamente. Com esse resultado,
chega-se à conclusão de que:
(a) B é menos retida que A.
(b) A é menos retida que B.
(c) A e B têm igual polaridade.
(d) A e B pertencem à mesma função
química.
(e) A ficou no "spot" e B localizou-se no
"front".
3) (Prefeitura Municipal de Campos dos
Goytacazes 1996) A análise cromatográfica
em camada fina de uma solução contendo as
substâncias A e B foi feita utilizando-se placa
de 20cm. O eluente deslocou-se a uma
foram observadas distantes do "spot" a 4,5 e
5,4cm, respectivamente. O Rf medido para
as referidas substâncias apresentou como
respectivos valores:
(a) 0,225 e 0,27.
(b) 0,25 e 0,30.
(c) 0,775 e 0,73.
(d) 1,12 e 1,17.
(e) 4,0 e 3,33.
4) (PETROBRAS) Utilizando-se uma análise
qualitativa por cromatografia em fase gasosa,
de uma amostra de hidrocarbonetos, obteve-
se o seguinte cromatograma:
min
0 2 4 6 8 10 12
Em relação a essa análise, podemos afirmar
corretamente que:
(a) o cromatograma revela a presença de
quatro componentes na amostra e o
tempo de retenção é dado pela altura de
cada pico correspondente.
(b) os componentes presentes na amostra
podem ser identificados com absoluta

10
 certeza, comparando-se seu tempo de 7)
retenção com os registros na literatura.
(c) os tempos de retenção dependem da
temperatura e da reprodutibilidade das
condições de análise. Em conseqüência,
não podem ser identificados com
absoluta certeza os componentes da
amostra somente com um
cromatograma.
(d) o método é absoluto na comprovação da
presença de determinada substância,
devido ao tempo de retenção e à forma
do pico.
(e) o método não é absoluto para a
comprovação da ausência de
determinada substância, porque os
tempos de retenção e formas dos picos A figura acima mostra dois métodos
podem coincidir. para melhorar a separação de uma mistura
hipotética de dois componentes, onde em (a)
5) (Casa da Moeda do Brasil 1997) A temos o cromatograma original, com os picos
característica fundamental da cromatografia sobrepostos. Com relação à cromatografia e
por permeação em gel é a: à figura acima, julgue os itens abaixo (certo
(a) distribuição das moléculas do soluto ou errado).
entre duas fases líquidas imiscíveis,
de acordo com as solubilidades (__) Em (b) as condições foram alteradas de
relativas. modo que o primeiro componente migrasse
(b) separação das substâncias em mais lentamente e o segundo mais
virtude dos respectivos tamanhos e rapidamente através da coluna.
formas moleculares. (__) Em (b) houve melhora na separação em
(c) partição de uma amostra entre uma conseqüência de uma melhor seletividade.
fase gasosa móvel e uma delgada (__) Em (c) houve diminuição no
camada de líquido não volátil. espalhamento das bandas.
(d) partição de uma amostra entre uma (__) Somente em (b) os picos estão
fase gasosa móvel e um sólido com resolvidos.
grande área superficial como fase (__) Em (c) uma boa resolução foi obtida com
estacionária. boa eficiência e boa seletividade.
(e) fase estacionária ser apolar e a fase
móvel polar.
8)

6) (Skoog - p.594) As substâncias A e B

apresentaram tempos de retenção de 16,40 e
17,56min, respectivamente, em uma coluna
de 30,0cm de altura. Espécies não retidas
saíram da coluna em 1,30min. As larguras
dos picos (na base) são 1,11 e 1,21min,
respectivamente. Calcule:

(a) a resolução da coluna;

(b) a altura do prato, supondo o número
médio de pratos da coluna igual a 3,0
x 103.

A figura acima mostra o efeito da

variação dos solventes sobre cromatogramas

11
obtidos para uma mesma amostra. Com
relação à cromatografia líquida e a figura
acima, julgue os itens abaixo (certo ou
errado).
(__) Para a maioria das situações, as
condições utilizadas na obtenção do
cromatograma (c) seriam as mais indicadas
porque este apresenta resolução adequada
num breve tempo de análise.
(__) Em (c) não podemos afirmar que os
cincos componentes estejam resolvidos.
(__) Modificações na composição da fase
móvel podem promover melhor seletividade
e, conseqüentemente, melhorar a resolução.
(__) Para separações envolvendo ácidos ou
bases ionizáveis, alterações no pH da fase
móvel podem resultar numa separação mais
eficiente.
(__) Em cromatografia, quando se verifica
melhores resultados com a manipulação da
polaridade da fase móvel, podemos afirmar
que o mecanismo de separação em
desenvolvimento é o de troca iônica.
9)
A figura acima mostra cromatogramas
hipotéticos para uma mistura de seis
componentes, ilustrando um problema geral
de eluição em cromatografia. Com relação à
figura acima, julgue os itens abaixo (certo ou
errado).
(__) Nenhuma das condições utilizadas foi
capaz de separar os seis componentes.
(__) No cromatograma (b) as condições
foram otimizadas para separar os
componentes 5 e 6.
(__) Uma solução para o problema de
separar os seis componentes em menos
tempo seria utilizar as condições de (a) e,
imediatamente após a eluição dos
componentes 1 e 2, utilizar as condições de
(c).
(__) A resolução em (c) foi melhor que em
(a).
(__) O componente 1 é o mais retido na fase
estacionária.
10) O tipo de cromatografia no qual o
mecanismo de separação é sempre o de
partição é:
(a) cromatografia em coluna.
(b) cromatografia em papel.
(c) cromatografia em camada fina.
(d) cromatografia líquida.
(e) cromatografia gasosa.
11) Sobre a cromatografia por troca iônica é
correto afirmar que:
(a) a fase estacionária é inerte.
(b) ela é muito utilizada na separação
dos componentes do petróleo.
(c) os solutos retidos na fase estacionária
podem ser eluídos por deslocamento,
utilizando-se outros íons de carga
oposta.
(d) a eluição dos componentes da
mistura se faz com solventes de
diferentes polaridades.
(e) a fase estacionária é altamente
carregada.
12) O conhecimento da distribuição de
massas moleculares de um polímero é a
melhor maneira de predizer suas
propriedades físicas como força, flexibilidade
e rigidez. O tipo de cromatografia mais
empregado para separação e determinação
da massa molecular de polímeros é:
(a) cromatografia por exclusão.
(b) cromatografia por bioafinidade.
(c) cromatografia por adsorção.
(d) cromatografia por partição.
(e) cromatografia gasosa.
12
VI - Bibliografia
1. Skoog, Douglas A., Principles of instrumental Analysis, 3a. ed., Philadelphia: Saunders
College Publishing, 1985.

2. Collins, Carol H., Braga, Gilberto L. e Bonato, Pierina S., Introdução a Métodos
Cromatográficos, 6a ed., Campinas: Editora da UNICAMP, 1995.

VII - Gabarito
1C 2A 3B
4C 5B 6 (a)1,0
(b)0,01cm
7ECCEC 8CECCE 9ECCEE
10 B 11 E 12 A

13