Cromatografia (Livro)

SUMRIO 1 - Introduo, 1 1.1. Histrico, 1 1.2. Classificao, 1 2 - Tipos de Processos Cromatogrficos, 3 2.1. Cromatografia de adsoro, 3 2.2.
Cromatografia de partio, 4 2.3. Cromatografia em fase lquida, 6 2.4. Fatores que influem na separao, 7 2.5. Cromatografia em fase gasosa, 11 3 - Tratamento terico da Cromatografia, 14 3.1. Equao de Van Deemter, 14 3.2. Fase estacionria, 14 3.3. Suporte, 15 3.4. Coluna, 16 3.5. Fase mvel, 16 4 - O Cromatgrafo, 18 4.1. O Cromatgrafo a Gs, 18 4.2. O Cromatgrafo a Lquido, 20 4.3. Detetores, 23 5 - Anlise Qualitativa, 30 6 - Anlise Quantitativa, 31 6.1. Introduo, 31 6.2. Medio de rea, 31 6.3. Mtodos de clculo, 33 6.4. Seleo do melhor mtodo de clculo, 37 7. Otimizao do processo analtico, 39 7.1. Parmetros analticos, 39 7.2. Projetando um mtodo analtico, 41 7.3. Validao de um mtodo analtico, 43 8. Tcnicas adicionais de identificao, 50 8.1 Tempo de reteno e reteno relativa, 50 8.2. ndice de reteno, 50
8.3. Equivalncia entre fases estacionrias, 51 9. Bibliografia, 52 10. Apndice 1 (Caractersticas Bsicas dos Detetores), 53 10.1. Sensibilidade, 53 10.2. Nvel de rudo, 53 10.3. Limite de Deteco, 53 10.4. Faixa de Linearidade Dinmica, 54 11. Apndice 2 (Tcnicas de introduo da amostra), 55 12. Apndice 3 (Sistemas de aquisio de dados), 57 13. Apndice 4 (O desenvolvimento cromatogrfico), 58 14. Apndice 5 (Outros detetores utilizados em Cromatografia), 60 15. Apndice 6 (Estatstica), 64
Alexandre Schuler - Cromatografia 1 - INTRODUO 1.1. Histrico Cromatografia um termo genrico, aplicado a um processo de separao fsico-qumico, o qual baseado nos fenmenos de adsoro e partio. Este termo foi escolhido porque as primeiras separaes foram realizadas com substncias coloridas. Entretanto, o processo cromatogrfico no restrito a essa classe de substncias, constituindo-se na atualidade no mtodo mais eficiente de separao, com aplicaes na Qumica Analtica Qualitativa e Quantitativa, para compostos orgnicos e inorgnicos, independentemente de seu estado fsico. 1.2. Classificao Num processo cromatogrfico so envolvidas uma fase mvel e uma fase estacionria. A fase estacionria um slido ou um lquido (Figura 1.1). No segundo caso, este fica impregnado em um slido (suporte) e o fenmeno mais atuante a partio. No primeiro caso, tem predominncia a adsoro. Assim, pode-se classificar a Cromatografia em dois tipos gerais: Cromatografia de Adsoro e Cromatografia de Partio.
Figura 1.1 - O Processo Cromatogrfico .
A Fase Mvel transporta a amostra atravs da Fase Estacionria. A velocidade mdia das partculas da amostra depende da sua natureza. Desse modo, cada componente atingir o final da coluna em um instante diferente.
A fase mvel pode ser um lquido ou um gs. No primeiro caso, denominase o processo de Cromatografia em Fase Lquida e no segundo caso de Cromatografia em Fase Gasosa, ou simplesmente Cromatografia a Lquido e Cromatografia a Gs. A Cromatografia pode ainda ser classificada em funo da tcnica empregada: Cromatografia em Papel Cromatografia em Camada Delgada Cromatografia em Coluna Clssica Cromatografia em Fase Gasosa
Alexandre Schuler - Cromatografia Cromatografia em Fase Lquida de Alto Desempenho
Esta ltima mais conhecida pela iniciais de seu nome em ingls (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) e constituem-se variantes suas as seguintes tcnicas: Cromatografia de Permeao em Gel (GPC) Cromatografia de Troca Inica (IEC) GPC (do ingls Gel Permeation Chromatography) empregada na anlise de polmeros, enquanto a IEC (do ingls Ion Exchange Chromatography) empregada na anlise de ons (ctions e nions).
Alexandre Schuler - Cromatografia 2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRFICOS 2.1. Cromatografia de Adsoro
Adsoro um fenmeno fsico-qumico atravs do qual um slido (adsorvente) fixa em sua superfcie um lquido ou um gs, por meio de interaes semelhantes s foras de Van Der Waals. Chama-se coeficiente de adsoro relao
ka =
Na Nn
onde Na e Nn so respectivamente o nmero de moles adsorvidos e no adsorvidos de uma determinada substncia. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka, estes variando com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vrios componentes forada a passar atravs de um tubo contendo um adsorvente (coluna cromatogrfica), cada componente necessitar de um intervalo de tempo diferente para transpor a coluna. Esse intervalo de tempo denominado tempo de reteno (Tr). A Figura 2.1a ilustra um processo de Cromatografia por Adsoro. A substncia mais fortemente adsorvida mais dificilmente arrastada pela Fase Mvel.
a) Cromatografia de Adsoro
b) Cromatografia de Partio
Figura 2.1 - Diferena entre Cromatografia de Adsoro e Cromatografia de Partio. 2.2. Cromatografia de Partio
Alexandre Schuler - Cromatografia
Se uma substncia adicionada a um recipiente contendo dois lquidos no miscveis, ela se dissolver parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a relao C1 / C2, onde C1 e C2 so as concentraes da substncia em cada um dos dois lquidos. Denomina-se coeficiente de partio relao
kp =
podemos escrever
C1 C2
Se M0 a massa total da substncia e M1 a massa dissolvida no solvente 1,
M1 V1 kp = ( M 0 M 1)
logo,
= V2
M1 V2 V 1 M 0 M1
(eq. 1)
M 1 = M 0.
k pV 1 V 2 + k pV 1
Se a substncia estava inicialmente dissolvida no solvente 1, M1 a massa que permanece neste solvente aps adio do solvente 2, o qual extraiu a massa (M0 - M1). Se as duas fases forem separadas (com auxlio de um funil de separao, por exemplo), a adio de outra quantidade do solvente 2 vai extrair a massa (M1 - M2), onde
M 2 = M 1.
k pV 1 V 2 + k pV 1
(eq. 2)
Substituindo na eq. 2 o valor de M1 (eq. 1 ), fica M2 = Mo [kpV1/(V2 + kpV1)]2 A eq. 3 pode ser generalizada para Mn = Mo [kpV1/(V2 + kpV1)]n (eq. 4) (eq. 3)
que d a massa Mn que permanece no solvente 1 aps n extraes com o solvente 2. D-se ao processo agora descrito o nome de extrao. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de, por exemplo, 2 componentes, com kp kp ' , um dos componentes ficar preferencialmente no solvente 1 e o outro no solvente 2. Assim sendo, medida que n cresce, cada fase ficar mais pura em um dos componentes. No caso anterior (extrao), a poro de lquido 1 era sempre a mesma, renovando-se apenas o lquido 2. Agora, ambos so renovados. O Esquema 2.1, onde o lquido 1 o superior, ilustra o processo, que pode ser visualizado a nvel molecular na Figura 2.1.b.
Sejam duas substncias A e B, onde kA maior que kB. Isto significa que o lquido 1 vai se enriquecendo de A e o lquido 2, relativamente, vai se enriquecendo de B, a cada etapa do processo. Os nmeros da esquerda, em cada quadrcula, indicam a frao de A e os da direita indicam a frao de B. Do mesmo modo, os nmeros superiores indicam a frao de A e de B no lquido 1 e os inferiores indicam a frao de A e de B no lquido 2. No exemplo, foi utilizada uma mistura com quantidades iguais de A e de B, cujos coeficientes de partio valem, respectivamente, 3 e 1/3. Para este segundo tipo de procedimento, a eq. 4 no vlida. Em seu lugar, pode ser deduzida, de modo semelhante, a eq. 5, onde Mn a massa extrada aps n etapas. A partir dos valores de MAn e MBn, pode-se calcular a composio da mistura (ou o grau de pureza de cada componente) em cada solvente, aps n etapas (n parties).
Esquema 2.1 - Distribuio (partio) de duas substncias (A e B), em dois lquidos (1 e 2) no miscveis. Mn = Mo [V2/(V2 + kpV1)]n (eq. 5)
A partio, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo cromatogrfico. O nmero de equilbrios (etapas) que ocorrem dentro de uma coluna (n) conhecido como o nmero de pratos tericos, prato terico sendo um ponto de equilbrio (entre uma fase e outra). A distncia entre dois pontos de equilbrio consecutivos chama-se altura equivalente a um prato terico (H). Os parmetros n e H sero novamente discutidos mais adiante. IMPORTANTE ! Se kB tambm for maior que a unidade, a perda de B ser muito grande e tambm a purificao de A ser muito demorada (exigir maior nmero de etapas). 2.3. Cromatografia em Fase Lquida
O exemplo mais simples de cromatografia a lquido a separao em uma camada delgada de slica-gel depositada sobre uma placa de vidro (Cromatografia em Camada Delgada). A Figura 2.2 ilustra o processo. O lquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os componentes de uma mistura binria (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicao). Quando o solvente se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta removida da cuba que contm o solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posio vertical e a um nvel abaixo do ponto de aplicao. As razes de frente, Rf A = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 so caractersticas de cada substncia, dependendo da natureza da fase mvel e da fase estacionria. A Cromatografia em Camada Delgada a mais empregada em Anlise Qualitativa ou semi-Quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra utilizada, menos indicada para fins preparativos, quando ento se emprega a Cromatografia em Coluna Clssica. Neste segundo tipo de processo, a fase estacionria colocada em um tubo de vidro (coluna cromatogrfica) colocado na posio vertical. A coluna dotada de uma torneira na extremidade inferior (Fig. 2.3), que utilizada para controlar a vazo da fase mvel, que desce por gravidade. Fig. 2.2 - Cromatografia em Camada Delgada.
Neste exemplo, a amostra contm dois componentes, A e B, que so identificados pelos respectivos valores de Rf
A necessidade de se controlar a vazo da fase mvel e a temperatura da coluna, alm da impossibilidade (naquela poca - anos 50) de se bombear um lquido com fluxo constante e contnuo, levaram os projetistas a abandonar essa tcnica, passando a utilizar um gs como fase mvel (1956). O ponto A indica o nvel da fase estacionria e o ponto A indica o nvel da fase mvel. A diferena A - A deve ser o menor possvel, para evitar a diluio do material a ser cromatografado, o que resultaria em zonas (na Fig. 2.3, as faixas 1, 2 e 3) mais largas. Ao se fazer a eluio (passagem da fase mvel), os componentes afastam-se do ponto de aplicao (topo da coluna) a uma distncia d tal que d/l = Rf ( l o comprimento da coluna), obtendo-se assim uma coluna desenvolvida. A partir da, continuando-se a eluio, cada componente pode ser coletado isoladamente, quando atingir o final da coluna. Denomina-se Volume de Reteno (V r) o volume de fase mvel necessrio para a eluio completa de um componente. Desse modo, tem-se V r = V1 / Rf, onde V 1 o volume ocupado pela fase mvel dentro da coluna. A partir da pode ser calculado o volume total de solvente
Figura 2.3
Alexandre Schuler - Cromatografia Cromatografia em Coluna
necessrio para a eluio de todos os componentes da amostra. No Apndice 4, so discutidos mais detalhes sobre o desenvolvimento da coluna.
2.4. Fatores que influem na separao Independentemente do processo envolvido na separao cromatogrfica (adsoro ou partio), esta funo de uma srie de fatores, a saber: Natureza da fase estacionria Concentrao da fase estacionria Natureza da fase mvel Vazo da fase mvel Temperatura Granulometria e geometria do suporte
A polaridade da fase estacionria um fator importante a se considerar. Em princpio, quando se tem uma fase estacionria no polar, os diversos componentes da amostra eluem na ordem crescente de seus pontos de ebulio e o processo assemelha-se bastante a uma destilao (Figura 2.4). Quando a fase estacionria apresenta polaridade, essa ordem de eluio em funo do ponto de ebulio fica alterada (Figura 2.5) e s obedecida quando os componentes apresentam polaridade de mesma ordem de grandeza (componentes A-C e D-G da Figura 2.6). Em alguns casos, a diferena de polaridade pode ser equilibrada com a diferena de ponto de ebulio, fazendo com que dois componentes distintos eluam juntos (Figura 2.7). Nesses casos, outros fatores podem auxiliar na separao, como a ponte de hidrognio entre os componentes D-G da Figura 2.6.
FE: Esqualano (um hidrocarboneto de baixssima polaridade)
FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)
A Benzeno (ponto de ebulio = 80,2oC)
B ciclo-Hexano (ponto de ebulio = 81,0oC)
Figura 2.4 Separao em funo da diferena no ponto de ebulio
Figura 2.5 - Efeito da polaridade sobre a separao cromatogrfica
A concentrao da fase estacionria lquida tambm influi na separao, como pode ser observado na Figura 2.8. Alis, com o uso, normal diminuir a concentrao, por arraste pela fase mvel, mesmo temperatura ambiente, de modo que colunas com fase estacionria lquida possuem um tempo de vida til finito, que pode ser bastante curto, medida em que a temperatura da anlise se aproxima da temperatura limite, que por definio situa-se 150oC abaixo da temperatura de ebulio da fase estacionria. Atualmente,
tem sido desenvolvidas fases quimicamente ligadas (ver Seo 3.2 - Fase Estacionria; p. 14). Coluna: diglicerol, 20%, 6 metros
A- n-nonano (154oC) B- n-decano (174oC) C- n-undecano (194oC) no polar, no forma ponte
D- etanol (78oC) E- n-propanol (94oC) F- n-butanol (118oC) G- n-pentanol (132oC) polar, ponte de hidrognio mdia
H- gua (100oC)
polar, ponte de hidrognio fortssima
Figura 2.6 Efeito da ponte de hidrognio sobre a separao cromatogrfica
Outro fator importante, principalmente em HPLC, a polaridade da fase mvel. Alis, esse o principal recurso para implementar uma separao (ver Gradiente de Polaridade, na Seo 4.2; p. 22). Tambm a vazo da fase mvel muito importante na separao. A Figura 2.9 ilustra a situao, que foi alvo de um estudo semi-terico realizado por van Deemter (Captulo 3). Tambm a temperatura (a que est submetida a coluna) A Benzeno (ponto de ebulio = 80,2oC) fator determinante na separao, B ciclo-Hexano (ponto de ebulio = 81,0oC) particularmente em CFG, conforme resume o quadro anexo Figura 2.10. Finalmente, a Figura 2.7 - Uma separao malsucedida granulometria da fase estacionria slida (ou do suporte slido da fase estacionria lquida), conforme mostrado na Tabela 2.1, tambm influi na separao. Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte/FE slida sobre a separao cromatogrfica malha/polegada nmx 60-80 4300 80-100 4600 100-120 5700 D.E. = 1/8; l = 4 m; C = 10 % Hmn 0,93 0,87 0,70 Fo (mL/min) 20 20 24
FE: Apiezon (um hidrocarboneto)
Figura 2.8 - Efeito da concentrao da fase estacionria sobre a separao cromatogrfica.
onde:
V1 < V2 < V3 < V4
Figura 2.9 - Efeito da vazo da fase mvel sobre a separao cromatogrfica.
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Figura 2.10 - Efeito da temperatura sobre a separao cromatogrfica.

O quadro apresentado a seguir sumariza a relao entre o efeito e o tipo de processo.
TIPO ADSORO PARTIO
FASE MVEL G L G L
FASE ESTACIONRIA S S L L
EFEITO DIMINUI TR DIMINUI TR DIMINUI TR NO ALTERA T R
2.5. Cromatografia Em Fase Gasosa (CFG) Na Cromatografia a Gs empregam-se colunas bem mais longas que aquelas usadas em Cromatografia a Lquido. O princpio o mesmo, mas a fora motora a presso do gs e no a fora da gravidade, de modo que as colunas normalmente so dobradas em espiral, a fim de ocupar menos espao dentro do cromatgrafo. A Fig. 2.11 esquematiza um cromatgrafo a gs. A amostra (gs, lquido ou slido em soluo) injetada (ver Apndice 2), com auxlio de uma microseringa ou vlvula apropriada, no Injetor, que tambm o Vaporizador (V) e os seus vapores so arrastados para o interior da coluna pela fase mvel (gs de arraste). Na sada da coluna, a amostra passa pelo Detetor (D), que envia um sinal
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Fig. 2.11 - Cromatgrafo a Gs para o Registrador (R). Como ser visto adiante (Detetores, p. 23), este sinal proporcional quantidade de cada componente, o que permitir uma anlise quantitativa. Vale acrescentar que a Cromatografia a Gs talvez o mtodo de anlise mais preciso. O sinal eletrnico captado pelo registrador transformado num movimento da pena do mesmo. Como o papel de registro est em movimento, obtm-se um grfico (Fig. 2.12) denominado cromatograma.
Fig. 2.12 - Cromatograma de uma amostra com dois componentes. As reas A1 e A2 sob as duas curvas do cromatograma da Fig. 2.12 so proporcionais s quantidades dos dois componentes na mistura. Distncia de Reteno (Dr) a distncia, no papel, entre o ponto registrado no momento da injeo (Incio) e o ponto correspondente ao mximo de cada curva (pico). Dr varia com a velocidade do papel (z), mas o tempo de reteno (Tr = Dr/z) uma caracterstica da substncia que varia com a vazo da fase mvel, a natureza e a concentrao da fase estacionria e com a temperatura. Por isso, o cromatgrafo possui controladores de vazo da fase mvel e da temperatura do forno da coluna. A coluna (e consequentemente a fase estacionria) pode ser substituda, at encontrar-se a coluna ideal para uma dada amostra. Alm disso, existe uma vazo ideal para cada coluna, independentemente da natureza da amostra (ver Fig. 2.13). Assim sendo, a
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temperatura da coluna o principal recurso disponvel para obter-se um mximo de separao entre os diversos componentes da amostra. Outro parmetro usado em CFG a Reteno Relativa (RR), que tambm usado na identificao:
RR =
Tr 2 Vr 2 Dr 2 = = Tr 1 Vr 1 Dr 1
Essas relaes so equivalentes, desde que Vr2 = F.Tr e F e z so constantes (F = vazo da fase mvel).
Fig. 2.13 - Relao entre F e n ou H. Fi a Vazo Ideal (os parmetros A, B e C so descritos na Seo 3.1, eq. 6). Obs.: Experimentalmente determina-se H por medio da distncia de reteno e aplicao das equaes: n = (4Dr/L)2 e H = l /n,
onde l o comprimento da coluna e L a largura do pico na base. A Figura 2.14 ilustra o procedimento. O parmetro n mede a eficincia de uma coluna cromatogrfica (ver Capt ul o 3).
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Figura 2.14 - Procedimento para determinao do nmero de pratos tericos. As duas grandezas devem ser medidas em milmetros (ou em minutos ou segundos).
Alexandre Schuler - Cromatografia 3 - TRATAMENTO TERICO DA CFG 3.1. Equao de Van Deemter
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Van Deemter estabeleceu uma equao emprica (eq. 6) que relaciona as diversas variveis da Cromatografia a Gs com H (altura equivalente a um prato terico). Como H igual a l /n e n mede a eficincia do processo, buscam-se condies em que o valor de H mnimo: (eq. 6)
= dp = Dg = = K = N= df = Dl = v=
parmetro adimensional que mede as irregularidades no empacotamento da coluna. dimetro mdio das partculas do suporte. coeficiente de difuso da amostra na fase mvel. fator de correo para a tortuosidade dos canais entre partculas. k.Nl /Ng ; k = coeficiente de partio. frao de fase estacionria (l) ou da fase mvel (g) dentro da coluna. espessura efetiva do filme lquido (pelcula de fase estacionria na superfcie do suporte). coeficiente de difuso da amostra na fase estacionria. velocidade linear da fase mvel. A equao de Van Deemter pode ser escrita sob a forma geral H = A + B/v + C.v (eq. 7)
que a equao de uma hiprbole (Fig. 2.13). Como pode ser visto na eq. 6, o modo de empacotamento, o dimensionamento do suporte e o coeficiente de difuso da amostra em cada fase so fatores que devem ser seriamente considerados, quando projetada uma coluna. Temperatura talvez o fator mais importante, embora no aparea explicitamente na eq. 6. que K e D so altamente dependentes da temperatura. Realmente, observa-se na prtica que esta a varivel que mais influi na resoluo, variando drasticamente a reteno relativa. De um modo geral, o tempo de reteno depende da natureza da fase estacionria, da temperatura de operao e da vazo da fase mvel. 3.2. Fase estacionria A fase estacionria um slido (Cromatografia de Adsoro) altamente poroso (mais de 150 m2/g), ou, mais comumente, um lquido (Cromatografia de Partio). No segundo caso, o lquido depositado sobre um slido (suporte), que ser discutido mais adiante. Interaes entre dipolos, polaridade e pontes de hidrognio so os principais fatores, na fase estacionria, que determinam a separao cromatogrfica. Esses fatores so dependentes da temperatura, da tambm a necessidade de um controle dessa varivel. Os Cromatogramas 3.1.a e 3.1.b ilustram a influncia da polaridade e da ponte de
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hidrognio sobre a separao. Em ambos, como so usadas fases estacionrias polares, os picos aparecem na ordem crescente de polaridade dos componentes. Mas, no Cromatograma 3.1.b, como a fase estacionria (diglicerol) interage com o etanol (ponte de hidrognio), o tempo de reteno deste bastante aumentado (ver tambm Seo 2.4; p. 7). Alto ponto de ebulio e inrcia qumica e cataltica (em relao amostra, fase mvel e ao material de que constitudo o tubo da coluna) so os principais requisitos para uma fase estacionria. Em relao ao ponto de ebulio (PE) deve ser lembrado que a temperatura limite para operao com uma dada coluna 1500C abaixo do PE da fase estacionria. Acima dessa temperatura, a perda por volatilizao excessiva. Em anos recentes tem sido utilizada a FQL (Fase Quimicamente Ligada), onde a FE une-se ao suporte mediante uma reao qumica. As fases estacionrias mais freqentemente utilizadas, com um amplo espectro de aplicaes, so polmeros derivados de silcio, as polisiloxanas (ou siliconas), como a SE-30, por exemplo. Outra fase tambm bastante utilizada o polietilenoglicol (ex.: Carbowax 20M). 3.3. Suporte O suporte tem a funo de fixar dentro da coluna a fase estacionria. necessrio que o suporte seja qumica e cataliticamente inerte. O material a ser empregado tambm no pode exibir rea superficial maior que 50 m2/g, alta porosidade, nem grande poder de adsoro. Centros ativos (cidos ou bsicos) podem provocar modificaes estruturais na amostra, devendo ser removidos. Terras diatomceas, graas sua baixa capacidade de adsoro e sua baixa porosidade, so ainda muito empregadas como suporte. Um excelente suporte base de diatomcea comercializado com um nome constitudo da palavra Chromosorb seguida de uma ou mais letras (ex.: Chr WHP). Atualmente, tm sido desenvolvidos materiais sintticos, copolmeros do etilvinilbenzeno com divinilbenzeno. A depender do processo de fabricao, esses polmeros tambm podem ser empregados como fase estacionria (Ex.: Porapak Q, Chromosorb 101, etc). Permitem um bom empacotamento, graas uniformidade na granulometria e na prpria geometria das partculas.
Figura 3.1 - Ausncia (a) e presena (b) de ponte de hidrognio entre FE e etanol 3.4. Coluna O material de que constituda a coluna (tubo) pode ser ao inox 316, alumnio, nquel, vidro ou teflon. Quando no se conhece o material a ser analisado, d-se
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preferncia s colunas de vidro (trata-se de um vidro especialmente tratado, para remover centros cidos de sua superfcie) ou de teflon, sendo que a ltima tem emprego mais restrito, devido sensibilidade ao calor e presso. As colunas so classificadas quanto ao dimetro externo: - Coluna microanaltica (capilar) ............ 0,1 a 0,5 mm - Coluna analtica .................................. 1/8, 3/16 e 1/4 - Coluna semi-preparativa ..................... 3/8, 1/2 e 5/8 - Coluna preparativa .............................. 5, 7 e 10 cm As colunas analticas mais comumente empregadas possuem 2 a 3 m de comprimento, com 1.000 a 10.000 pratos tericos. Colunas capilares so bem mais longas. As primeiras capilares fabricadas possuam mais de 100 m. Com o avano da tecnologia, o comprimento atual situase entre 20 e 40 m, embora com cerca de 100.000 pratos tericos. Tem-se notcia de uma coluna capilar com cerca de 1600 m de comprimento e 1 milho de pratos tericos. Atualmente foram desenvolvidas colunas com 0,53 mm (colunas megabore) com excelentes resultados. Mais simples de instalar, renem as qualidades das colunas analticas e das capilares. As colunas usadas em CLAD (seo 4.2, p. 22) so bem mais curtas (10 a 40 cm) e os dimetros encontrados mais comumente no comrcio especializado variam entre 3 e 5 mm. 3.5. Fase mvel Em CFG, a fase mvel um gs inerte, devendo apresentar-se bastante puro, principalmente quando tratar-se da anlise de traos. Os gases mais empregados so H 2, N2, He, Ar e Ne, podendo tambm serem utilizados outros, em casos especiais. Na escolha da fase mvel (ou gs de arraste), devem ser considerados os seguintes fatores: - Disponibilidade/custo. - Eficincia na separao. - Efeito sobre o tempo de anlise. - Segurana. - Efeito sobre o sistema de deteco. 1 - A equao de Van Deemter simplificada (eq. 7), aplicada aos gases N2 e H2, apresenta os seguintes coeficientes (amostra: Propano), com uma dada coluna: Ha = 0,1 + 0,07/v + 0,05v Hb = 0,1 + 0,28/v + 0,05v (N2) (H2)
OBS.:
Esses dados comprovam a influncia da natureza do gs de arraste sobre a eficincia.
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2 - A velocidade relativa de eluio aumenta na ordem H2 < N2 < He < Ar, fato que demonstra a influncia da natureza do gs de arraste sobre o tempo de anlise. A Tabela 3.1 resume a aplicao dos critrios acima mencionados, para seleo da fase mvel em funo do detetor empregado. Tabela 3.1 - Gases mais recomendados para CFG, por tipo de detetor. TIPO DE DETETOR Condutividade Trmica Ionizao de Chama Captura Eletrnica GASES MAIS USADOS (Ordem de prioridade) H2 > He >> N2 N2 > Ne > He N2 > He
Em Cromatografia a Lquido empregam-se como Fase Mvel principalmente gua deionizada, metanol, acetonitrila, etc. A seleo depende do detetor a ser empregado e a fase mvel deve ser imiscvel com a fase estacionria liquida.
Alexandre Schuler - Cromatografia 4 - O CROMATGRAFO 4.1. O Cromatgrafo a Gs
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A Fig. 2.11 (p. 11) representa esquematicamente um Cromatgrafo a Gs. possvel agora descrever mais detalhadamente o instrumento. a) Controles de Temperatura O cromatgrafo dispe de termostatos para controle independente do aquecimento dos trs principais setores: cmara de vaporizao, forno da coluna e bloco do detetor. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistncia eltrica localizada na base do forno, homogeneizado por um ventilador, que pode permanecer ligado aps o final do aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse caso, o compartimento do forno deve permanecer aberto, exceto nos equipamentos que possuam dispositivo de resfriamento automtico.
Figura 4.1 - Fluxmetro de bolha b) Controles Pneumticos
Figura 4.2 - Divisor de fluxo para coletor
Os cromatgrafos a gs normalmente possuem uma vlvula controladora de presso e outra para ajuste da vazo da fase mvel. Idnticos sistemas existem para o controle da vazo dos gases auxiliares (ver seo 4.3.2.b; p. 25). A vazo medida com o auxlio de um fluxmetro de bolha, ou bolhmetro (Fig. 4.1). A pra (parte inferior) contm uma soluo de sabo lquido. Comprimindo-se a pra, o nvel do lquido sobe e o gs forma uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazo, suficiente marcar com um cronmetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na atualidade, existem no mercado alguns equipamentos totalmente microprocessados, tornando obsoletos esses acessrios. c) Coletor de Fraes
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O coletor de fraes um acessrio utilizado em Cromatografia preparativa. O material efluente da coluna pode passar por um divisor de fluxo (Fig. 4.2), de modo que uma parte desviada para o coletor, onde cada componente, isoladamente, condensado. Colunas de maiores dimenses permitem a injeo de uma maior quantidade de amostra, permitindo assim a produo de pequenas quantidades de um material com alta pureza (maior que 99,9999%), que pode ser empregado como padro, por exemplo. d) Detetores Por ser necessrio um estudo mais detalhado, sero discutidos mais adiante. e) Eletrmetro O eletrmetro um amplificador de sinal. Este mdulo pode ser controlado a qualquer instante, de modo que um sinal fraco (componente menor) pode ser ampliado independentemente dos outros, enquanto que um sinal muito forte (componente maior) pode ser atenuado o suficiente para que seu pico fique contido no papel do registrador. Os Cromatogramas 4.1 e 4.2 ilustram, respectivamente, a relao real de reas e outro registro da mesma amostra, com ampliao do primeiro sinal e atenuao do terceiro, ou mais exatamente, atenuao menor para o primeiro e atenuao maior para o terceiro, em relao atenuao do segundo. Logicamente, as reas medidas no segundo cromatograma, multiplicadas pelos respectivos fatores de atenuao, fornecem os valores reais das reas relativas.
Cromatograma 4.1 - Mesma atenuao f) Registrador
Cromatograma 4.2 - Atenuaes diferentes
O registrador um instrumento acessrio, que transforma o sinal emitido pelo detetor e amplificado pelo eletrmetro, em um sinal mecnico. Na extremidade do sistema mecnico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da linha de base, proporcional quantidade do componente na amostra. Como o papel est em
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movimento, obtm-se uma curva (cromatograma), onde a distncia do incio da anlise (ponto de injeo) ao mximo de cada pico a distncia de reteno (Dr). Dividindo Dr por z (velocidade do papel), obtm-se o tempo de reteno, Tr. Idealmente, com separao completa e condies timas (incluindo seleo perfeita da fase estacionria), obtm-se uma curva simtrica. No Apndice 3 so discutidas outras tcnicas de aquisio de dados. g) Programador Linear de Temperatura Quando a reteno relativa (RR) de alguns componentes prxima da unidade (baixa resoluo) e no entanto a temperatura de ebulio dos componentes menos volteis muito alta (Cromatograma 4.3), um aumento na temperatura da anlise (temperatura da coluna), com o objetivo de reduzir o tempo de anlise e obter um pico mais agudo para os ltimos componentes (o que inclusive diminuiria o erro na determinao de Dr), acarretaria uma diminuio na j pequena reteno relativa dos primeiros componentes (Cromatograma 4.4). Em situaes como essa, pode-se aplicar um gradiente de temperatura, com o auxlio de um Programador Linear de Temperatura (PLT). A velocidade de aquecimento pode ser controlada, sendo possvel tambm promover um aquecimento isotrmico em algumas regies. Em operaes desse tipo deve-se indicar no cromatograma a temperatura inicial (Ti), a temperatura final (Tf), que no deve diferir da temperatura de ebulio da fase estacionria em menos de 1500C, e a velocidade de aquecimento, para que o cromatograma possa ser reproduzido posteriormente (Cromatograma 4.5).
Cromatogramas 4.3, 4.4 e 4.5 - Anlises em diferentes temperaturas 4.2. O Cromatgrafo a Lquido O cromatgrafo a lquido (mais comumente conhecido pela sigla inglesa da tcnica, HPLC (High Performance Liquid Chromatography; em portugus: Cromatografia Lquida de Alto Desempenho), um instrumento mais simples que o cromatgrafo a gs nos seguintes aspectos: a) s possui um canal analtico, enquanto CGs podem ter at quatro canais; b) modulado, isto , sistema de bombeamento e detetor so independentes, o que facilita a substituio de detetores;
Alexandre Schuler - Cromatografia c) opera geralmente temperatura ambiente;
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A Figura 4.3 um diagrama em blocos de um CL tpico. Cada bloco descrito a seguir:
Figura 4.3 - Diagrama em blocos de um HPLC tpico a) Reservatrio de Fase Mvel A Fase Mvel (um lquido puro ou uma mistura de composio definida) deve ser filtrada em membranas com 0,46 m de dimetro de poros e desgaseificada (ver prximo item). b) Sistema de desgaseificao A Fase Mvel deve ser desgaseificada, para evitar a formao de bolhas, as quais podem provocar cavitao (com conseqente dano bomba) ou gerar picos falsos, ao passarem pela clula do detetor. So conhecidas vrias tcnicas de desgaseificao: - aquecimento com agitao; - borbulhamento de gs hlio; - ultra-som; - vcuo c) Bomba O bombeamento da Fase Mvel realizado por uma bomba controlada por um microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de suco (para evitar vaporizao de fase mvel mais voltil) e a vazo (importante quando a anlise realizada com Gradiente de Polaridade, em cujo caso h necessidade de uma segunda bomba; ver mais adiante). d) Vlvula de injeo A amostra sempre introduzida com auxlio de uma vlvula, porquanto a presso de trabalho nunca menor que 50 atmosferas (Apndice 2). e) Coluna
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As colunas empregadas em CL so retas, uma vez que seu comprimento raramente ultrapassa 30 cm, ocupando portanto muito pouco espao no equipamento. f) Detetor Os detetores utilizados em CL sero descritos na prxima seo. g) Sistema de aquisio de dados. Os sistemas de aquisio de dados empregados em CL so exatamente os mesmos empregados em CG, ou seja, registradores, integradores ou microcomputadores (Apndice 3). Gradiente de Polaridade Quando o CL dispe de apenas uma bomba, evidente que a fase mvel tem uma composio constante, do incio ao fim da anlise. Nessa situao, a polaridade da mesma tambm constante. Diz-se ento que o processo isocrtico. Quando dispe-se de duas bombas (ou mais), possvel variar a composio da fase mvel, colocando-se em cada reservatrio um lquido de polaridade diferente. O microprocessador altera a vazo de cada linha de lquido, de modo que a partir do ponto de confluncia a vazo seja constante. Nesse caso, diz-se que o processo ocorre com gradiente de polaridade. Substituindo-se temperatura por polaridade, pode-se utilizar os Cromatogramas 4.3 e 4.4 (p. 20) como ilustrao de processos isocrticos com polaridades diferentes e o Cromatograma 4.5 como ilustrao de um processo com gradiente de polaridade. 4.3. Detetores 4.3.1. Generalidades
Os detetores mais empregados so do tipo diferencial. A sua resposta (R), dada pelas reas relativas dos picos, proporcional concentrao de cada componente (detetores de condutividade trmica) ou velocidade de fluxo de massa do componente (detetores de ionizao):
R = K1.C
R = K 2.
dm dt
Dentre os detetores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso, os seguintes: detetor de condutividade trmica (DCT), detetor de ionizao de chama (DIC) e detetor de ndice de refrao (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicao.
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A escolha do detetor importante e depende do material a ser analisado. As principais caractersticas dos detetores, que devem ser consideradas quando da seleo do detetor mais apropriado, so as seguintes (ver Apndice 1, p 53): - Sensibilidade - Nvel de rudo - Resposta - Faixa de linearidade dinmica - Custo/vida til - Universalidade - Especificidade / Seletividade - Condutividade trmica (para DCT)
4.3.2. Detetores empregados em Cromatografia a Gs a) Detetor de Condutividade Trmica (DCT) O sistema de deteco por diferena de condutividade trmica consiste de dois filamentos (clula para amostra e clula de referncia), os quais fazem parte de uma ponte de Wheatstone (Figuras 4.4a e 4.4b). Faz-se passar corrente pelos filamentos e estes perdem calor para o gs de arraste. No momento em que a amostra atingir a clula correspondente, o filamento perder calor para a soluo (gs de arraste + amostra). Como a soluo possui condutividade diferente, a temperatura do filamento alterada, o mesmo ocorrendo com a sua resistncia eltrica. Essa variao na resistncia medida pela ponte. Note-se que quanto maior for a concentrao do material analisado, maior ser a variao na corrente e portanto maior ser o sinal (R = K.C). A sensibilidade de um detetor de condutividade trmica pode ser avaliada pela equao:
S = KI 2 .
onde:
( g - s) . (Tf - Tb ) g
(eq. 8)
S = sensibilidade (mV.cm3/mg) K = constante da clula I = intensidade de corrente R = resistncia do filamento
= condutividade trmica do gs de arraste = condutividade trmica da substncia Tf = temperatura do filamento Tb = temperatura do bloco
IMPORTANTE ! Se a cmara do detetor contiver ar atmosfrico no momento em que o circuito for energizado ocorrer queima do filamento. Portanto, deve-se primeiro fazer circular o gs de arraste.
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Figura 4.4.a - Bloco do Detetor de Condutividade Trmica. b) Detetor de Ionizao de Chama (DIC) A figura 4.5 representa o circuito eletrnico de um DIC. R v uma resistncia varivel, cujo valor depende do nmero de partculas entre os eletrodos. O efluente da coluna, ao passar entre os eletrodos, ionizado. Nos DIC, a fonte de ionizao a chama resultante da combusto de hidrognio com ar (gases auxiliares). A corrente contnua gerada pela fonte (fonte CC, Fig 4.5.b) transportada do polarizador para o coletor (Fig 4.5.a) por impurezas existentes na fase mvel ou por partculas de fase estacionria lquida arrastada pela fase mvel, por exemplo. No amplificador existe outra fonte de corrente, sendo esta varivel e de sentido contrrio, permitindo assim zerar a corrente resultante no circuito. Quando um componente da amostra atinge o detetor, caso possua tomos de carbono e tomos de hidrognio, entrar em combusto, sendo ionizado. Com a ionizao, aumenta a corrente sada do coletor, o que ir gerar uma tenso (V), a qual ampliada pelo amplificador eletromtrico e enviada ao registrador/integrador. Evidentemente, a sensibilidade do detetor depender da facilidade relativa de ionizao de cada componente da amostra.
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Figura 4.4b- Diagrama Eletrnico do DCT
Fig. 4.5.a- Estrutura fsica de um DIC c) Detetor de Captura Eletrnica (DCE) Embora possuindo circuito semelhante ao de um DIC, o DCE, ao contrrio daquele, mede a queda de corrente quando da passagem de amostra pelos eletrodos (Rv). Uma fonte de 3H-1 ou de 63Ni ioniza as molculas do gs de arraste (N2), liberando os eltrons responsveis pela corrente (corrente de fundo). Se uma substncia capaz de absorver esses eltrons passar pelo detetor, haver uma queda na corrente, resultando num sinal que tambm ser amplificado e enviado ao registrador. Aqui, a sensibilidade do detetor depende da capacidade de absoro de eltrons por parte dos diversos componentes da amostra.
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Fig. 4.5.b- Circuito eletrnico de um DIC / DCE d) Propriedades dos detetores A Tabela 4.1 auto-explicativa e sumariza as principais propriedades dos detetores, auxiliando no trabalho de seleo do detetor mais apropriado para uma anlise. O Apndice 5 descreve outros detetores de uso menos extensivo, como o DNP. Tabela 4.1 - Propriedades dos principais tipos de detetores empregados em CFG. PROPRIEDADES Limite de deteco Faixa de linearidade Vazo da fase mvel Quant. Tpica amostra Comp. Detectados reas de aplicao DCT 1 ppm 104 3 1-10 mL/min 1 - 40 L todos uso geral DIC 100 ppb 107 1-200 mL/min 0,05 - 5 L orgnicos orgnicos DNP 0,1 ppb 104 10-100 mL/min 1 - 5 L nitrogenados e fosforados resduos de pesticidas DCE 0,1 ppb 102 10-100 mL/min 1 - 5 L halogenados resduos de pesticidas
4.3.3. Detetores empregados em CLAD Os detetores mais empregados em Cromatografia a Lquido de Alto Desempenho (CLAD), embora existam outros tipos de detetores so: a) Detetores de ndice de refrao semelhana do detetor de condutividade trmica, o detetor de ndice de refrao o mais antigo, menos sensvel e o nico universal, dentre os detetores empregados em CLAD. Baseando-se na diferena de ndice de refrao entre a fase mvel e cada componente da amostra, conhecem-se dois tipos de detetores IR:
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Os detetores tipo deflexo utilizam como elemento ativo um diodo capaz de gerar uma corrente contnua cuja intensidade proporcional ao ngulo de incidncia da luz que atravessa a clula (Figura 4.6). Ao passar pela clula analtica uma substncia com ndice de refrao diferente daquele da fase mvel, haver uma alterao no ngulo de incidncia, resultando numa variao na intensidade de corrente, que proporcional concentrao dessa substncia na clula e consequentemente tambm proporcional sua concentrao na amostra.
Figura 4.6 - Detetor de ndice de Refrao tipo deflexo. Os detetores tipo Fresnel baseiam-se no fato da luz incidente sobre o sistema mostrado na Fig. 4.7 ser fracionada em dois feixes: uma parte da luz refletida e a outra parte refratada. De acordo com a Lei de Fresnel, a relao entre essas duas fraes funo do ndice de refrao. Assim, ao passar uma substncia (transportada pela fase mvel) pela clula, altera-se o ndice de refrao e portanto o percentual de luz refratada. Utilizando-se como foto-detetor um diodo sensvel intensidade de luz, a corrente gerada por este ser alterada de um modo proporcional concentrao dessa substncia na amostra. b) Detetores de UV-VIS Os detetores de ultravioleta-visvel (UV-VIS) baseiam-se na Lei de Lambert-Beer, que estabelece uma relao linear entre Absorbncia e Concentrao: A= .l.c onde l o caminho tico (distncia percorrida pela luz dentro da soluo; espessura da clula). A constante de proporcionalidade denomina-se absortividade molar. A absorbncia, por sua vez, proporcional transmitncia, frao de luz transmitida. Quando o contedo da clula (Fig. 4.8) transparente radiao empregada (UV ou VIS), a transmitncia 100 % e evidentemente a absorbncia ZERO.
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Entretanto, quando chega clula uma substncia que absorva essa luz, o sistema de deteco mede a diferena em intensidade, gerando o cromatograma correspondente. Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de radiao uma lmpada de mercrio, cujo comprimento de onda principal (90 % do total da radiao) mede 254 nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento de onda fixo (e nico). A Fig. 4.8 representa um diagrama esquemtico desse tipo de instrumento. Como a regio til da radiao UV varia de 190 a 300 nm, de se esperar que mesmos os compostos que absorvem luz UV no venham a ser detectados em um detetor do tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir uma varredura em toda a regio UV, primordial, evidentemente, que a fonte de radiao (lmpada de deutrio) possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de interesse (fonte no monocromtica). Desse modo, o instrumento (UV varivel) necessita de um dispositivo que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar a amostra com uma luz monocromtica. Esse dispositivo chama-se monocromador. Para se operar na faixa visvel (400-750 nm), emprega-se uma lmpada de tungstnio.
Figura 4.7 - Detetor de ndice de Refrao tipo Fresnel.
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Figura 4.8 - Detetor de Ultravioleta fixo 6 - ANLISE QUALITATIVA O tempo de reteno (Tr) uma caracterstica fsico-qumica e como tal permite que se faa anlise qualitativa, desde que se disponha de um padro. Na falta do padro, necessrio coletar cada componente isoladamente e identific-lo por outros mtodos analticos; espectrometria, por exemplo. Atualmente, so comercializados cromatgrafos cujo detetor um espectrmetro de massas. Quando uma amostra submetida anlise, preciso fornecer ao analista alguns dados a respeito da mesma: - Origem (de sntese, natural, etc ?). - Componentes provveis (espcie, nmero). - Composio quantitativa provvel. - Faixa de ponto de ebulio (amostra lquida). - Outros dados relacionados com as variveis do processo. Quanto maior for o nmero de informaes, mais rapidamente o analista encontrar as condies ideais de anlise. Como existe apenas uma vazo ideal para cada coluna, resta ao analista procurar a coluna e a temperatura (ou programao de temperatura) ideais. Existem outros modos de efetuar a identificao, os quais sero estudados mais adiante (Captulo 8).
Alexandre Schuler - Cromatografia 6 - ANLISE QUANTITATIVA 6.1. Introduo
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Para se determinar a composio de uma mistura (Anlise Quantitativa) necessrio medir as reas relativas dos picos de todos os componentes. Entretanto, nem sempre o nmero de picos igual ao nmero de componentes, pois alm da probabilidade de ocorrer superposio, alguns componentes podero no ser detectados, o tempo de anlise poder ser inferior ao tempo de reteno de um componente menos voltil, etc. O uso de uma referncia (padro) permite, contudo, determinar a percentagem de um dado componente, mesmo que no apaream os picos dos outros componentes. Antes de se efetuar o clculo da composio, entretanto, preciso fazer as correes das reas, pois a relao das reas de dois componentes quase sempre diferente da relao entre as suas massas (composio em massa). Isto porque a sensibilidade (Resposta) de um detetor a duas diferentes substncias normalmente diferente. Analisando a eq. 8 (p. 23), observamos que alm de outros fatores, a sensibilidade dos detetores de condutividade trmica depende da diferena g - s. Como s varia de substncia para substncia, podemos dizer que uma mistura binria qualquer contendo 50% de cada componente muito provavelmente ter uma relao de reas diferente da unidade. Com os detetores de ionizao de chama (e tambm com os de captura de eltrons) existe esse mesmo problema, pois a facilidade de se ionizar (ou de capturar eltrons) varia de substncia para substncia. Alis, essa afirmao vale para qualquer outro tipo de detetor, inclusive aqueles empregados em Cromatografia a Lquido. Assim sendo, vale a pena repetir, necessrio primeiro determinar os fatores de resposta para as reas e s depois efetuar o clculo da composio. 6.2. Medio de rea A rea de um pico pode ser medida por vrios mtodos, a saber: i - Com auxlio de um planmetro. ii - Por pesagem (recorta-se cada pico e pesa-se em balana analtica). iii - Com auxlio de um integrador: a) de disco (eletromecnico) b) eletrnico ou
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iv - Determinao grfica: a) S = h.L ou b) S = h.L,
onde h a altura do pico, medida desde a linha de base at o pice do mesmo, L a largura na base (distncia entre os pontos em que a linha de base interceptada pelas tangentes traadas nos dois ramos da curva) e L a largura do pico na metade de sua altura, como se v na Figura 6.1. Essas grandezas devem ser medidas em milmetro. O planmetro um dispositivo mecnico, articulado. medida em que se percorre o permetro do pico, um ponteiro percorre uma escala. A leitura ao final do permetro a rea do pico. O traado do integrador de disco mostrado abaixo do pico, na fig. 6.1. O uso de um integrador permite determinar a rea com um erro da ordem de 0,1%. Entretanto, os erros dos outros mtodos, em torno de 0,5 - 1%, bastante aceitvel para a maioria das finalidades. Dado o alto custo dos integradores, principalmente os eletrnicos, muitos Laboratrios ainda utilizam o mtodo grfico. Atualmente, encontram-se no mercado vrias verses de softwares (com a respectiva interface), que substituem com muitas vantagens (inclusive de custo) os integradores eletrnicos. A utilizao do planmetro exige habilidade do operador, de modo que o erro poder ser bem maior que 1% (a preciso normalmente baixa). O mtodo de pesagem, por sua vez, pouco empregado em virtude de exigir a destruio do cromatograma. Dentre os mtodos grficos (a e b), o da meia altura (b) recomendado para os picos cuja linha de base no est bem definida e tambm por causa da impreciso no traado das tangentes. Entretanto, a medio de uma largura L (da ordem de 5 mm) muitas vezes acarreta um erro da mesma magnitude do erro da medida de L, de modo que os dois processos, em geral, podem ser considerados igualmente precisos. A experincia indicar, em cada ocasio, qual mtodo dever ser empregado. Se os picos no esto completamente separados, ao ponto de no se poder medir a largura L, utiliza-se o mtodo a (S = h.L), medindo-se L do seguinte modo (Fig. 6.2): 1) Traar, como na Fig. 6.1, a tangente do pico; mas s as mostradas na fig. 6.2; 2) A partir do ponto A (Fig. 6.2), traar uma vertical at cortar a linha de base; 3) L1 e L2 so as bases dos dois picos da Fig. 6.2 e as suas reas so h1L1 e h2L2. Fig. 6.1 - Mtodo grfico para determinao de reas relativas em cromatografia.
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OBS.: Essa tcnica pode ser empregada tambm nos casos em que A fica abaixo de L e denominada CORREO VERTICAL. Se o primeiro pico for muito menor que o segundo (Fig. 6.3), o procedimento exatamente igual. Por outro lado, na situao inversa, a medio da rea do segundo pico feita como mostrado na Fig. 6.4. Essa segunda tcnica chama-se CORREO TANGENCIAL. Se houver um outro pico sobre a cauda do primeiro e o ponto A estiver acima da tangente, procede-se a uma correo vertical entre os dois pequenos.
Figura 6.2 - Correo vertical
Figura 6.3 - Correo vertical
Fig. 6.4 - Correo horizontal
6.3. Mtodos de Clculo Os mtodos de clculo descritos a seguir j incluem a correo da rea. a) Normalizao de rea Usa-se um dos componentes da mistura como referncia. Seja uma mistura das substncias S1, S2, ... , Sn e Sr, onde Sr a referncia. A seguinte relao vlida para um cromatograma dessa mistura:
mr mi = Ar Aci
A ci =
mi . Ar mr
(eq. 9)
onde Aci a rea corrigida de uma substncia qualquer i. Por outro lado, podemos dizer que:
A ci = A i. Fi
(eq. 10)
onde Fi o fator de correo. Igualando-se os segundos membros das equaes 9 e 10, fica:
Ai.Fi =
mi . Ar mr
ou
Fi =
mi Ar . mr Ai
(eq. 11)
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OBS.: Para uma mesma soluo, mi / mr = Ci / Cr, logo Fi = Ci / Cr . Ar /Ai (eq. 11) aplicandose a eq. 11 a uma amostra de concentrao conhecida (mistura padro), encontra-se Fi. Ento, a partir da eq. 10 (aplicada amostra de concentrao desconhecida), calculada a rea corrigida Aci. Finalmente, a composio dada pela eq. 12:
Ci =
Aci . 100 Aci
(eq. 12)
Quando todos os componentes de uma mistura pertencem a uma mesma funo qumica, os fatores de correo (tambm denominados fatores de converso - pois convertem a rea em concentrao ou massa - ou fatores de resposta) so praticamente iguais. Assim, admitindo-se que F1 = F 2 = ... = F n = F, pode-se fazer F = 1 e a equao 12 simplifica-se:
Ci
Ai . 100 Ai
(eq. 12)
O caso geral conhecido como Normalizao de rea com Fator de Resposta (Norm %) e o caso particular (eq. 12) como Normalizao de rea sem Fator de Resposta, ou simplesmente rea %. b) Padronizao Interna Para a determinao da composio de uma amostra pelo mtodo da Normalizao de rea, necessrio que todos os seus diversos componentes sejam detectados (a eq. 12 exige que sejam calculadas todas as reas: Aci). Entretanto, no fcil ter certeza absoluta de que todos os componentes foram realmente detectados. Alm disso, se apenas um nico componente interessa ao analista, a sua determinao a partir de uma amostra com muitos componentes traria dois outros agravantes: i) Todo trabalho de medio e clculo dos picos de interesse. ii) A probabilidade maior de um outro componente ter o mesmo tempo de reteno do componente de interesse. Para resolver o problema (ii) o analista preferiria usar um detetor que se possvel s detectasse o componente de interesse. Mas, como resolver o problema inicial ? A resposta a essas questes est na adio amostra de uma substncia nova, com as seguintes caractersticas: - Solvel na amostra. - Detectvel. - Possuir Tr diferente de qualquer componente detectvel.
Alexandre Schuler - Cromatografia - No reagir com a amostra. Essa substncia denominada de padro interno.
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Seja uma soluo padro contendo todas as substncias de interesse e o padro interno (Pi), cujas concentraes e reas sejam respectivamente: Ai e Ci - um componente qualquer de interesse. APi e CPi - o padro interno. As relaes Ci /Ai = Ri (eq. 13) e CPi /APi = RPi (eq. 14) do a resposta do detetor para qualquer componente, inclusive Pi. Numa mesma soluo, a relao Ri / RPi constante e igual a Fi (comparar com a eq. 11).
Ci Api . = Fi Ai Cpi
(eq. 15)
A adio do padro interno a uma amostra de concentrao desconhecida, resulta em uma soluo para a qual so vlidas as relaes:
Ci' = Ri Ai'
(eq. 16)
C'Pi = RP i A 'Pi
(eq. 17),
equivalentes s equaes 13 e 14. Logo,
Assim,
C'Pi C' . Fi = Ri = i' A 'Pi Ai ' Ai C'i = . C'Pi . Fi ' A Pi
(eq. 18) (eq. 19)
OBS.: A preciso desse mtodo, bem como a do mtodo a, independe do erro de injeo, mas a preciso de ambos depende do erro na preparao dos padres. c) Padronizao externa Mais prtico que o mtodo anterior e no necessitando tambm da deteco de todos os componentes da amostra, o mtodo do padro externo, entretanto, depende do volume injetado, de modo que sua preciso influenciada pelo erro de injeo. Considerem-se as equaes 13 e 16. Numa soluo de composio conhecida (soluo padro) e numa amostra desconhecida, tm-se respectivamente:
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Ci = Ri Ai
C'i = Ri A 'i
Igualando-se os dois primeiros membros, tem-se, tirando o valor de C 'i :
C'i = A 'i .
Ci Ai
(eq. 20)
Como Ri constante, uma vez determinado o seu valor, a partir da soluo padro e para cada componente de interesse, o analista ter apenas que aplicar a eq. 21:
C'i = A 'i . Ri
OBS.:
(eq. 21)
1 - Os valores de Ri, obtidos num determinado laboratrio, podem ser tabelados, ou fornecidos a um computador (integrador/processador), para agilizao das anlises. Devido a alteraes na sensibilidade do detetor (variao na relao de fluxo dos gases auxiliares no DIC, corroso, decaimento natural na fonte radioativa do DCE, etc.), os valores de F i (ou de Ri) devem ser recalculados periodicamente. O analista dever determinar experimentalmente a periodicidade. 2 - O mtodo do padro externo (regra de trs simples) uma simplificao do mtodo do padro interno (regra de trs composta), onde se faz Vip = Via , onde Vip o volume injetado de soluo padro e Via o volume injetado da amostra. Portanto, a preciso deste mtodo de clculo depende da percia do analista na medio do volume a ser injetado. d) Tcnica para fechar uma anlise Muitas vezes necessrio fazer duas injees. Isso acontece quando uma nica coluna no consegue separar todos os componentes e/ou um nico detetor no detecta todas as substncias. Considere-se o mtodo de Normalizao de rea e uma situao em que um dos componentes aparece isolado nos dois cromatogramas. Como nas duas injees o volume no foi exatamente o mesmo, haveria um erro grosseiro se as diversas reas dos dois cromatogramas fossem somadas diretamente. No exemplo a seguir, a amostra possui cinco componentes, sendo que os componentes (1), (2) e (4) so quantificados no cromatograma A. Observa-se que (2) aparece nos dois cromatogramas. Teoricamente as suas reas, nos dois cromatogramas (Aa2 e Ab2) seriam iguais. Na prtica, geralmente encontra-se Aa 2 Ab 2 . Qualquer uma das reas correta, de modo que A ou B pode ser tomada como referncia, indiferentemente. Tomando o cromatograma A como referncia, tem-se:
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A a2 = K A b2
(para corrigir as reas no cromatograma B)
Aa1. F1 + Aa 2. F2 + Ab3. K. F3 + A a 4. F4 + Ab5. F5. K =
ci
onde Aci qualquer termo do 1o membro. A concentrao de qualquer componente calculada a partir da eq. 12. 6.4. Seleo do melhor mtodo de clculo Para se decidir sobre o melhor mtodo de clculo para uma dada amostra, basta responder s questes apresentadas no Esquema 6.1.
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Esquema 6.1 - Critrios para seleo do melhor mtodo de clculo.
Alexandre Schuler - Cromatografia 7 - OTIMIZAO DO PROCESSO ANALTICO 7.1. Parmetros analticos
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Conforme foi visto ao longo dos captulos anteriores, muitos fatores influem no processo cromatogrfico. Essa influncia no aleatria, podendo portanto ser controlada pelo operador, com o objetivo de otimizar o processo de separao. A Tabela 7.1 mostra a importncia do correto dimensionamento de uma coluna cromatogrfica, enquanto que a Tabela 7.2 mostra a influncia do volume injetado sobre L (largura do pico na base; ver Fig. 2.14, p. 13), n e H (ver Fig. 2.13, p. 13). O Grfico 7.1 mostra a relao entre C e nmax () e entre C e Hmin(), onde C a concentrao da fase estacionria. O Grfico 7.2 mostra como esses parmetros (n e H) variam com o comprimento da coluna (l). A temperatura (T) modifica o tempo de reteno (tr). A variao do tr com T no linear. A relao tr / T depende do composto em estudo e da faixa de temperatura empregada. A Tabela 7.3, o Grfico 7.3 e os Cromatogramas 7.1.a,b e 7.2.a,b,c evidenciam essas afirmaes. Finalmente, a Tabela 7.4 mostra que nmax, Hmin e Fo (vazo ideal) dependem inclusive da granulometria do suporte. Tabela 7.1 - Efeito do comprimento da coluna e da concentrao da FE sobre a eficincia.
l (m)
1 2 4 9 16 4 4 4 4
Coluna * C (%) 10 10 10 10 10 1 2 5 20
m (g) 0,13 0,24 0,57 1,24 2,15 0,05 0,12 0,26 1,18
Vazo Ideal Fo (mL/min) 30+5 20+5 28+5 21+5 38+5 18+5 26+5 34+5 37+5
n x 10-3 0,8 1,4 4,3 8,0 16,0 1,9 2,0 2,7 3,3
H (mm) 1,25 1,43 0,93 1,13 1,00 2,11 2,00 1,48 1,21
(*) a) Fase estacionria: Apiezon L; DE = 1/8; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna.
Tabela 7.2 - Efeito do volume injetado sobre L, n e H. Volume (L) L (mm) n H (mm)
Alexandre Schuler - Cromatografia 0,5 1,0 1,5 2,0 7 9 11 12 15.800 9760 6800 5270 1,01 1,64 2,35 3,03
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Tabela 7.3 - Efeito da temperatura sobre o tempo de reteno Composto n-pentano n-hexano n-heptano n-octano 70oC 1,60 3,29 7,38 18,88 100oC 1,17 1,93 3,65 7,08 130oC 0,85 1,23 1,92 3,25 160oC 0,68 0,77 1,35 2,00
A partir dessas informaes possvel estabelecer, por exemplo, para uma coluna com 1/8 de dimetro externo (coluna analtica), que: Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, nmax funo linear de l. O valor de nmax aumenta, quando diminui a granulometria do suporte. O valor de nmax varia com C, sendo mximo quando C = 12 %, para suporte com faixa de granulometria de 60-80 mesh ( malhas por polegada linear; equivale a um dimetro de partcula de 175-230 mm). A faixa de vazo ideal no varia com a temperatura. O tempo de reteno diminui de maneira no linear com o aumento da temperatura; a relao tr / T varia com a natureza do composto e o intervalo de temperatura considerado. 7.2. Projetando um mtodo analtico Para se projetar um novo mtodo analtico por cromatografia, so necessrias vrias avaliaes, relacionadas a seguir:
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Seleo do tipo de cromatgrafo (a gs ou a lquido); Seleo do detetor, em funo dos compostos a serem analisados e de suas concentraes; Parmetros de funcionamento do detetor; Seleo da coluna: natureza da Fase Estacionria (e sua granulometria, caso seja slida); dimenses da coluna (comprimento e dimetro); concentrao da Fase Estacionria (FE), natureza e granulometria do suporte, no caso de FE lquida;
Seleo da temperatura (ou programao de temperatura) para a coluna, no caso de CFG; Seleo do Gradiente de Polaridade, se necessrio, no caso de CFL (HPLC); Determinao do Limite de Deteco (LD) e da Faixa de Linearidade Dinmica (FLD); Determinao dos Fatores de Resposta; Determinao das demais condies de anlise: volume injetado, tcnica de injeo, atenuao (se no dispuser de sistema de integrao), temperatura do vaporizador (em CFG) e do detetor e vazo da fase mvel (ou gradiente); Concentrao dos componentes na soluo padro, natureza do solvente empregado e tcnicas de amostragem e de preparao da amostra e da soluo padro; Mtodo de clculo utilizado; Nmero mnimo de determinaes em paralelo e erro mximo (reprodutibilidade); Avaliao do erro estatstico global, associado s diversas operaes (preparao de solues, tcnica de amostragem, tcnica de injeo e medio de rea); expresso do resultado final;
Observaes: a) na seleo do detetor, verificar se o material a ser analisado detectvel por ele e se o seu Limite de Deteco compatvel com a faixa de concentrao de interesse (ver, por exemplo, a Tabela 4.1 na p. 26); b) na avaliao dos erros estatsticos, considerar todas as operaes envolvidas, tais como pesagem, medio de volume, diluio, tcnicas de amostragem e de injeo, etc; c) para clculos estatsticos, utilizar o Apndice 6 (ver Seo 7.3).; d) em relao aos diversos mtodos de clculo, lembrar que: Mtodo rea % Norm % P. Ext. P. Int. prep. Padro No Sim Sim Sim prep. Amostra No No No Sim injeo No No Sim No comp. No detectados Sim Sim No No altura(1) Sim Sim No(2) No(2)

(1) como medida da rea; (2) dentro de uma faixa mais ou menos estreita de concentrao.
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Tabela 7.4 Efeito da granulometria do suporte sobre a eficincia Malha/polegada 60-80 80-100 100-120 D.E. = 1/8; l = 4 m; C = 10 % nmx 4300 4600 5700 Hmn 0,93 0,87 0,70 Fo (mL/min) 20 20 24
7.3. Validao de um mtodo analtico 7.3.1. Objetivo A identificao por Cromatografia (a gs ou a lquido) feita por comparao dos tempos de reteno, para uma dada substncia, entre uma soluo padro e a amostra. Entretanto, sabido que num determinado sistema cromatogrfico (Fase Mvel, Fase Estacionria e Detetor), mesmo empregando-se como fluxo da Fase Mvel aquele encontrado por ser o ideal (de acordo com os experimentos de van Deemter), no nula a probabilidade de outro componente da amostra apresentar o mesmo tempo de reteno que o da substncia de interesse. Validar um mtodo analtico consiste em garantir que nas condies analticas, a substncia-problema e apenas ela apresenta aquele tempo de reteno. Evidentemente um mtodo validado deve ser operacionalizado atravs de um manual (Norma), o qual determina condies padronizadas que garantam a sua repetibilidade/reprodutibilidade. Deve ser enfatizado que um determinado mtodo analtico validado para um determinado tipo de amostra no necessariamente vlido para outro tipo de amostra (ex.: dosagem de um princpio ativo existente em um determinado medicamento versus a mesma determinao nas vsceras do cadver de uma suposta vtima de super-dosagem), posto que outro tipo de
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amostra pode conter outras substncias tambm passveis de ser detectadas no mesmo tempo de reteno do analito e que no tenham sido includas na pesquisa de validao. 7.3.2. Conceitos Com o objetivo de garantir uma correta compreenso deste texto, so apresentados a seguir os termos tcnicos aqui empregados, com suas respectivas definies. Nome Analito Amostra Padro United States Pharmacopea USP Concentrao c Soluo Estoque SE Soluo Intermediria Soluo de Trabalho Faixa de Linearidade Curva de Calibrao Coeficiente de Correlao r SI ST FL notao descrio Substncia-problema. Qualquer material, independentemente de sua origem, que contenha o analito. O analito, comercializado com alta pureza. Farmacopia Americana. Fonte de consulta. Concentrao do analito (ou do padro). Soluo do padro a alta concentrao (pode ser guardada por alguns meses, dependendo da natureza da substncia). Soluo do padro, necessria para se chegar Soluo de Trabalho. Soluo do padro com concentrao semelhante ao que se espera da amostra. Intervalo de concentrao em que existe relao linear com a rea do pico. Curva construda com os dados da Faixa de Trabalho. Parmetro que mede a preciso com que a Curva de Calibrao relaciona as reas com as respectivas concentraes. usado para avaliar o fim da regio linear na construo da FL. Intervalo contido na FL, compreendendo as concentraes usuais da amostra. Concentrao mnima detectvel do analito no extrato injetado. Concentrao mnima detectvel do analito na amostra. Concentrao mnima do analito que corresponde a um erro mximo aceitvel. Capacidade de separar a substncia-problema dos demais componentes da amostra. Mede a seletividade. Avalia a re petibi lidade ou a reprodutibilidade de um mtodo analtico,
Faixa de Trabalho Limite de Deteco do Equipamento Limite de Deteco da Amostra Limite Efetivo Seletividade Resoluo Preciso
FT LDE LDA LE
Rs
Alexandre Schuler - Cromatografia por medida da 1a ou da 2a estimativa do desvio padro (Apndice 6). Grau de fidelidade com que o resultado exprime o valor real da concentrao do analito. Avaliado com auxlio do teste t1 (de Student), por comparao com uma soluo padro (Apndice 6). Nos casos em que se faz uma extrao, necessrio determinar o percentual de extrao e sua repetibilidade. Recomenda-se que a soluo padro seja submetida mesma operao. Mede a disperso dos resultados obtidos por repetio da anlise, num mesmo Laboratrio, com o mesmo equipamento e mesmo analista. Ver Preciso. Mede a disperso dos resultados obtidos por repetio da anlise, em diferentes Laboratrios, diferentes equipamentos ou diferentes analistas. Usa o teste F (Apndice 6). Mede a influncia sobre a repetibilidade, das diversas operaes constantes do mtodo. Mede a influncia sobre a Reprodutibilidade, das diversas operaes constantes do mtodo.
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Exatido
Recuperao
Repetibilidade
Reprodutibilidade
Consistncia Robustez 7.3.3. Procedimento
a) Seletividade / Identificao A principal fase do trabalho aquela em que testada a confiabilidade da identificao. Isso inclui a determinao do tempo de reteno de toda e qualquer substncia que possa eventualmente existir na amostra, quais sejam: impurezas de sntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poder ser bastante penoso); impurezas de degradao (essas informaes podem ser obtidas de estudos shelflife); excipientes, conservantes, aditivos e outros princpios ativos constantes da formulao (no caso de associaes); Deve ser lembrado que a identificao pura e simples por cromatografia (mtodo no validado) no tem valor cientfico. Assim, o ideal, o recomendado mesmo, associar tcnica cromatogrfica, a tcnica de Espectrometria de Massas. Essa associao pode ser manual, atravs da separao fsica, por coleta na sada da coluna, seguida da obteno do espectro de massas. A identificao pode ser
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ainda complementada com auxlio de outra tcnica analtica, como a Espectrometria de Ressonncia Magntica Nuclear, Espectrofotometria no Ultravioleta-Visvel ou a Espectrofotometria no Infravermelho. Atualmente existem cromatgrafos (CFG ou HPLC) acoplados a um espectrmetro de massas, o qual substitui o detetor tradicional do cromatgrafo. Embora os exemplos aqui apresentados sejam tpicos da indstria farmacutica, os diversos procedimentos so igualmente aplicveis a qualquer outro tipo de amostra. De um modo geral, produtos de sntese (de uso farmacutico ou no) podem ter seu mtodo analtico validado sem auxlio da espectrometria (embora seu emprego d maior credibilidade validao). Por outro lado, qualquer outro material (inclusive de uso farmacutico) exige a associao de mtodos espectromtricos. J se sabe que a eficincia (n) de uma coluna diretamente proporcional ao tempo de reteno. Portanto, quanto maior for o tempo de eluio, maior ser a sua eficincia. Assim, a seletividade pode ser medida como a razo dos tempos de reteno: = tr1/tr2 Essa relao tambm denominada reteno relativa (p. 12) ou ainda fator de separao e demonstra-se que equivalente s relaes dos coeficientes de partio: = kp1/kp2 Entretanto, esse critrio algo insatisfatrio, posto que colunas com diferentes eficincias podem apresentar mesmos fatores de separao, conforme pode ser visto na Figura 7.1.a,b. Porisso, em vez da seletividade, emprega-se a resoluo (Rs), como medida efetiva da capacidade de separao: Rs = 2(tr2 tr1)/(L1 + L2) ou seja, a resoluo igual diferena entre os tempos de reteno dividida pela mdia da larguras na base (Figura 2.14, p. 13). bvio que a resoluo diminui com o alargamento do pico e evidentemente tambm diminui se a cauda, resultante de uma interao excessiva com a fase estacionria, bastante pronunciada (Figura 7.2). Essa deformao do pico deve ser considerada quando da seleo da coluna. Chama-se fator de deformao ou fator de assimetria (TF, do ingls tailing factor) a relao TF = BC AB
onde a distncia BD igual a 10 % da altura do pico ( DE ). O TF mximo admissvel 3.
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Figura 7.2 Pico com cauda (deformao) Figura 7.1 Resoluo a) baixa; b) alta b) Detalhamento da Metodologia A metodologia analtica inclui todos os parmetros explicitados na Seo 7.2 (pgina 41). c) Avaliao estatstica Para realizao dos testes estatsticos, sugere-se que qualquer operao (preparao da soluo padro, tomada de alquotas, etc) seja realizada em triplicata (ou mais) e que cada soluo obtida seja injetada pelo menos cinco vezes. Nesses casos, deve ser empregada a 2 a estimativa do desvio padro (s R ; Apndice 6). A 1 a estimativa (s) s deve ser empregada em conjuntos de dados com mais de 10 itens. d) Exemplo A seguir, apresentado um exemplo, para ilustrar toda a operao. Para este exemplo, foi selecionado o produto aspirina. A aspirina comercializada em vrias formas, sendo selecionado como amostra o comprimido. A aspirina (cido acetilsaliclico) produzida industrialmente a partir do cido saliclico:
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Desse modo, de se esperar que o precursor (AS) seja um contaminante comum no produto (AAS). Consequentemente, o AS uma das substncias que devem ter seu tempo de reteno medido, para verificar se coincide ou no com o do AAS. Uma vez completada a etapa de identificao (vale repetir: confirmao de que nada que eventualmente possa estar presente na amostra apresente o mesmo tempo de reteno do AAS), parte-se para as avaliaes estatsticas. i. Condies analticas: Cromatgrafo a lquido modelo CG 480E, com detetor de ultravioleta CG 437B. Comprimento de onda: 254 nm. Coluna: RP-18, 250 mm X 4,6 mm, 10 m; temperatura ambiente. Fase Mvel: H2O:Metanol:cido Actico (46:52,5:1,5); 1,5 mL/min (isocrtico).
Preparao das solues padro (para AAS e AS): A soluo estoque foi de 500 mg/100 mL. As demais solues foram de 200, 100, 20, 10 e 5 mg/100 mL. Preparao da amostra: A partir de 5 comprimidos pulverizados em almofariz, foi tomada uma alquota pesando 55 mg (10% do peso mdio de um comprimido). O material foi dissolvido em 10 mL da fase mvel, com auxlio de ultra-som e em seguida filtrado (0,46 m). Injeo da amostra: vlvula Rheodyne, com loop de 20 L. ii. Faixa de Linearidade e Limite de Deteco As solues padro foram injetadas em triplicata, sendo que a mais diluda foi injetada dez vezes. A partir da mdias das reas obtidas, foram construdas as respectivas Faixas de Linearidade (Grficos 7.4 e 7.5), onde evidencia-se que as massas injetadas conforme prescrito em Preparao da amostra permanecem dentro da regio linear. O rudo (medido com atenuao mnima necessria para uma altura no inferior a 5 mm) foi de 7 mm, o que por comparao com
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a mdia das alturas dos picos das dez injees da soluo mais diluda resultou em um Limite de Deteco (para AAS e AS), da ordem de 0,3 mg/100 mL.
2 8,0x10
400
2 6,0x10
300
rea do pico
2 4,0x10
rea do pico
200
r = 0,99996
2 2,0x10
r = 0,99999
100
0,0 0 0 500 1000 1500 2000 0 100 200 300 400 500
Concentrao (mg/L)
Concentrao (mg/L)
Grfico 7.4 FLD do AAS. iii. Preciso e expresso dos resultados
Grfico 7.5 FLD do AS.
A partir dos dados (reas) das dez injees da soluo mais diluda referida no item ii acima, pode ser calculado o erro analtico (de repetibilidade) e a partir deste (1,2%), determinar a forma correta de expresso do resultado (vlida para ambos os compostos): Re = X 0,01 mg/L
Alexandre Schuler - Cromatografia 8 TCNICAS ADICIONAIS DE IDENTIFICAO 8.1. Tempo de reteno e reteno relativa
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A identificao feita tradicionalmente atravs da medio do tempo de reteno (tr). Entretanto, a essa forma de medio est associado um erro, decorrente de uma natural variao no tempo transcorrido entre a injeo e o acionamento do sistema de registro. Esse erro costuma ser da ordem de 2 % em relao ao tempo de reteno. pequeno demais, na maioria das vezes. Mas h casos em que a diferena de t r entre dois componentes dessa mesma ordem de grandeza. Em tais casos recomendvel o emprego da Reteno Relativa (RR). Um dos componentes tomado como referncia (RR = 1) e as RRs dos demais so calculadas com auxlio da relao: RRb = trb/tra , onde tra e trb so, respectivamente, os tempos de reteno da referncia e de outro componente. 8.2. ndice de reteno Outro parmetro utilizado para identificao, o ndice de Reteno (Ir) determinado experimentalmente a partir do cromatograma da mistura do desconhecido (i) com duas parafinas normais com n e m (m = n + 1) tomos de carbono, desde que: Vrn < Vri <Vrm onde Vr = volume de reteno = F.tr A relao
pode ser substituda por: Nesse sistema, assume-se que: Padres para determinao do Ir : a) como visto acima, as parafinas normais so, por definio, padres primrios, com Ir = 100n. b) em qualquer srie homloga com mais de 5 tomos de carbono, o Ir cresce de 100 unidades para cada CH2 adicional e no influenciado pela temperatura. Esses compostos podem, portanto, ser utilizados como padres secundrios. 8.3. Equivalncia entre fases estacionrias
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conhecida a relao
os ndices de reteno de um composto i numa fase polar qualquer e numa fase estacionria no polar tomada como referncia (geralmente esqualano), medidos a uma mesma temperatura. Essa relao permite avaliar a influncia, na separao, da fase estacionria e de grupos substituintes presentes na molcula da substncia considerada. McReynolds, baseado em trabalho inicial de Rohrschneider, tomou cinco compostos como referncia e associou o somatrio dos seus valores de I com a polaridade da fase estacionria, chegando a classificar centenas de fases estacionrias. A Tabela 8.1 apresenta alguns exemplos (observe-se que as FEs esto colocadas em ordem crescente de polaridade). Os valores de I, denominados constantes de McReynolds, foram determinados a 120oC. Os valores de Ir para os cinco compostos, com a fase estacionria esqualano, so: benzeno, 653; n-butanol, 590; 2-pentanona, 627; nitropropano, 652 e piridina, 699. Por comparao entre os nmeros de McReynolds de duas diferentes fases estacionrias, possvel concluir se as mesmas so equivalentes ou no. possvel tambm prever como melhor uma separao, comparando-se a natureza de duas substncias-problema com duas das cinco substncias tomadas como referncia. Tabela 8.1 Valores do Nmero de McReynolds (I) para algumas fases estacionrias. FASE ESTACIONRIA Esqualano (*) Nujol Apiezon L SE-30 SE-52 Hallcomid M-18 OL QF-1 Carbowax 20M Diglicerol DEGS TCEP 9 BIBLIOGRAFIA(*) 1. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold, Holland. 1967. 2. Ciola, R. Fundamentos da Cromatografia a Gs. Ed. Edgard Blcher Ltda., So Paulo, 1985. 3. Ciola, R. Tpicos em Cromatografia a Lquido. Inst. Cientficos C. G. Ltda., So Paulo, 1984. 4. Hadden, N. e Col. Basic Liquid Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1971. A 0 9 32 15 32 89 144 322 371 492 593 B VALORES DE I C D E 0 0 0 0 5 2 6 11 22 15 32 42 53 44 64 41 72 65 98 67 280 143 239 165 233 355 463 305 536 368 572 510 826 560 676 854 733 581 833 791 857 752 1028 915 I 0 33 143 217 334 916 1500 2308 3287 3430 4145
I = pi I ni , onde I pi e I ni so, respectivamente, r r r r
Alexandre Schuler - Cromatografia 5. McNair, H. e Bonelli, E. Basic Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1968. 6. Basics of Liquid Chromatography. Spectra-Physics, Cal. USA, 1977. 7. Fundamentals of Gas Analysis by Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1977. 8. Schuler, A. Caderno de Prticas de Cromatografia. Depto. Eng. Qumica/UFPE, 1994.
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(*) A Literatura aqui apresentada serviu de base para a elaborao deste texto e recomendada queles que pretendem aprofundar-se na matria.
Alexandre Schuler - Cromatografia 10 APNDICE 1 Caractersticas bsicas dos detetores 10.1. Sensibilidade
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A sensibilidade de um detetor medida pela sua Resposta, que a magnitude do sinal recebido pelo Sistema de Aquisio de Dados (Registrador potenciomtrico, Integrador ou Software), sob a forma de rea do pico. Assim, quanto maior for a rea do pico de uma mesma amostra, maior ser a sensibilidade do detetor empregado. 10.2. Nvel de rudo O rudo uma caracterstica indesejvel dos detetores, ou melhor, de qualquer dispositivo eletrnico. No caso do cromatgrafo, o rudo devido a um conjunto de fatores, tais como: - impurezas dos componentes eletrnicos - interferncias na rede eltrica - defeitos em circuitos eletrnicos - contaminao no septo da coluna - vazamento de fase mvel - mau contato em cabos e conectores - sangramento da coluna - contaminao na vlvula de amostragem - contaminao no detetor - contaminao na coluna
Essas causas podem ser removidas, exceto a primeira, que depende no s da qualidade do produto, mas tambm de suas caractersticas prprias. Assim, existe um nvel mnimo de rudo que no pode ser removido. Evidentemente, um pico com altura igual do rudo no poder ser reconhecido como tal. O rudo faz com que a linha de base no seja uma reta perfeita, mas algo parecido com o traado mostrado na Fig. 10.1.
Fig. 10.1. Linha de base com rudo. 10.3. Limite de Deteco Limite de Deteco (LD), ou Quantidade Mnima Detectvel (QMD), como o prprio nome o diz, a massa mnima injetvel que produza um pico que possa ser identificado como tal. Por definio, LD uma massa cujo pico tenha uma altura igual ao dobro da altura mdia do rudo (h r, Fig. 10.1). 10.4. Faixa de Linearidade Dinmica
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Entende-se por Faixa de Linearidade Dinmica (FLD) o intervalo compreendido entre a Quantidade Mnima Detectvel (QMD) e a massa mxima injetvel cuja Resposta ainda seja linear. A Fig. 10.2 ilustra a situao. A linha vermelha compreende a regio linear. Alguns detetores, possuem uma faixa ampla (DIC), enquanto outros apresentam linearidade numa faixa bem mais estreita (DCE). Alguns operam com massas altas (DCT, DIR), enquanto outros s apresentam linearidade a altas diluies (DCE, DUV). Para se determinar a FLD de um detetor, em relao a um determinado composto, necessrio preparar solues dentro do intervalo de interesse e montar um grfico equivalente ao apresentado na Fig. 10.2. Em seguida, o analista deve calcular o coeficiente de correlao (r; Apndice 6) para todos os pontos e depois recalcular o coeficiente de correlao aps retirar, sucessivamente, os pontos n, (n-1), (n-2), etc, at que o valor de r permanea estvel e prximo de 1. No tendo havido erro grosseiro na preparao das solues, nas injees, nem nas medies de reas, devese encontrar um valor de r maior ou igual a Figura 10.2 Faixa de Linearidade Dinmica. 0,999.
Alexandre Schuler - Cromatografia 11. APNDICE 2 Tcnicas de introduo da amostra
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Tradicionalmente a amostra (slido em soluo, lquido ou gs) introduzida com auxlio de uma microseringa (Figura 11.1). Em Cromatografia a Gs (CFG), exceto com colunas capilares ou megabore (ver abaixo), recomenda-se injetar de 3 a 5 microlitros (L), sendo que o erro de medio inversamente proporcional ao volume.
Figura 11.1 Microseringa para amostras lquidas em CFG Em se tratando de amostras gasosas, existem duas outras tcnicas: seringa especial para gases (seringas gas-tight, que previnem contaminao ou diluio da amostra com ar), que utilizada quando a amostra no est pressurizada e a vlvula injetora de sete vias (Figura 11.2). Em Cromatografia a Lquido (HPLC), a amostra (lquido ou slido em soluo) introduzida com auxlio de uma seringa numa vlvula equivalente vlvula da Figura 11.2, sendo do tipo rotativa e resistente alta presso empregada neste tipo de equipamento. Ambas as vlvulas encarregam-se de medir o volume injetado, que varia de umas poucas dezenas de microlitros (HPLC) a 1 2 mL (CFG). No caso de colunas capilares (ou megabore), o volume mximo injetvel muito pequeno para ser medido por uma microlitros (0,01 a 1 L). Alm disso, o dimetro das mesmas to pequeno ( 0,53 mm) que a injeo no pode ser feita diretamente na coluna, como acontece com as colunas de maior dimetro (CFG). Nesses casos, necessrio um injetor especial, onde a amostra, uma vez vaporizada, dissolvida na fase mvel e esta soluo sofre uma diviso (divisor pneumtico), de modo que 1/100 ou uma frao ainda menor realmente enviada para a coluna, enquanto que o restante descartado.
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Figura 11.2.a Vlvula de injeo de amostra gasosa (posio carga)
Figura 11.2.b Vlvula de injeo de amostra gasosa (posio injeo)
Alexandre Schuler - Cromatografia 12. APNDICE 3 Sistemas de aquisio de dados
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Mesmo na atualidade ainda so empregados registradores para a aquisio dos dados cromatogrficos. Qualquer que seja o detetor empregado (CFG ou HPLC), o sinal gerado pelo mesmo uma tenso (corrente contnua). Trabalhando-se com registrador, obtm-se um grfico (cromatograma), com auxlio do qual so medidos os tempos de reteno e as reas dos diferentes picos. O tempo gasto nesse trabalho muito grande e o erro s vezes bastante expressivo (5 a 10 %). O integrador eletromecnico realizou uma verdadeira revoluo na Cromatografia, particularmente em laboratrios de Controle de Qualidade, acelerando e aumentando bastante a preciso do trabalho analtico (erro da ordem de 0,5 %). Com o desenvolvimento da eletrnica, alguns registradores passaram a ser comercializados com um integrador eletrnico cujo registro grfico era igual ao do integrador eletromecnico, de modo que no houve diminuio visvel no erro de integrao, pois a leitura continuava sendo analgica. Mas logo em seguida surgiram os verdadeiros integradores eletrnicos. Os primeiros limitavam-se a imprimir a rea medida. Os clculos eram ainda realizados pelo analista, embora com uma preciso na integrao (medida da rea) da ordem de 0,001 %. A Segunda gerao de integradores veio complementar o trabalho. Aps a integrao, o equipamento, utilizando o mtodo de clculo previamente selecionado pelo analista, realizava a operao final, chegando a imprimir a concentrao na unidade desejada. Esses equipamentos denominam-se integradores-processadores. Alguns, mais sofisticados, imprimem o cromatograma, em tempo real, utilizando os recursos de correo vertical e correo tangencial e inclusive realizando clculos ps-anlise (geralmente em BASIC), alm de automatizar o acionamento de vlvulas. Na realidade esses integradores de ltima gerao so computadores dedicados. Seu alto custo, aliado a uma curta vida tecnolgica, decretou o fim desses equipamentos. Na atualidade, os laboratrios de cromatografia esto substituindo os integradores por softwares bastante completos e sofisticados, que com auxlio de um microcomputador tipo PC e de uma interface, realizam o trabalho do integrador com a mesma eficincia, a um preo bem menor, alm de poderem monitorar at quatro cromatgrafos de um modo totalmente independente.
Alexandre Schuler - Cromatografia 13. APNDICE 4 O desenvolvimento cromatogrfico
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As Figuras 1.1 (p. 1) e 2.1 (p. 3) mostram, respectivamente, a distribuio das partculas slidas (fase estacionria slida ou suporte, no caso da fase estacionria lquida) dentro de uma coluna empacotada e o processo de separao a nvel molecular (pictoricamente). Na Seo 2.2 (p. 4) dado um pequeno tratamento matemtico ao processo de separao por partio, quando ento h referncia a etapas ou pontos de equilbrio. Entre as pginas 6 e 7 oferecida uma pequena discusso a respeito do que acontece numa coluna de cromatografia clssica (fase estacionria slida), quando faz-se referncia a uma coluna desenvolvida. No final da Seo 2.5, ao discutir as Figuras 2.13 e 2.14 (p. 13), feita referncia ao nmero de pratos tericos (n), como medida da eficincia (capacidade de separao) de uma coluna cromatogrfica. Finalmente, no Captulo 3 (p. 14), apresentada a equao de van Deemter e seus diversos parmetros so discutidos. O processo de separao cromatogrfica pode ser analisado, por analogia, como uma destilao fracionada. No projeto de uma coluna de destilao contnua, o engenheiro qumico calcula em que pontos devem ser colocadas bandejas (pratos) para a retirada de fraes de diferentes pontos de ebulio. Numa destilao em batelada no existem essas bandejas, mas evidentemente o clculo o mesmo. Como no existem pontos de remoo ao longo da coluna, tudo sai pelo topo da mesma, na ordem crescente do ponto de ebulio. O mesmo acontece com a cromatografia. A diferena que outros fatores tambm interferem no processo, tornando-o mais complexo, porm tambm mais completo, mais eficiente. Assim, enquanto uma coluna de destilao contm cerca de 40-60 bandejas, uma coluna de cromatografia possui algumas centenas ou mesmo milhares de bandejas (pratos tericos). Cada componente da amostra, com diferente coeficiente de partio (ou de adsoro), movimenta-se ao longo da coluna, transportado pela fase mvel, com uma velocidade mdia diferente: quanto maior for sua afinidade com a fase estacionria (ou menor com a fase mvel), maior ser o coeficiente e portanto maior ser seu tempo de residncia (tempo de reteno) na coluna, ou seja, menor ser sua velocidade mdia. O material eludo comporta-se como um pisto mvel, com concentrao mxima nas proximidades da parte central e distribuio de concentrao quase gaussiana. medida em que o tempo passa, a largura do pisto aumenta (por efeito da difuso), de modo que se o tempo de eluio for muito grande, os picos coalescem e a separao ser incompleta (ver Figura 2.9, vazo V1, na pgina 10). Por outro lado, se o tempo for muito curto, (vazo V 4 da Figura 2.9), pode ser insuficiente para permitir separao completa. Esse raciocnio levou elaborao da equao abaixo, para o clculo da eficincia de uma coluna cromatogrfica (Fig. 2.14, p. 13): n = (4Dr/L)2 Pictoricamente, uma mistura de trs componentes apresentaria o comportamento mostrado na Figura 13.1 e a distribuio de concentrao (ou de massa) de cada componente mostrada na Figura 13.2. Observe-se que a Figura 13.2 no um
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cromatograma. A substncia que sai primeiro da coluna a primeira a atingir o detetor. Do mesmo modo, a primeira poro de cada componente a atingir o detetor a da extremidade direita (na Figura). O cromatograma, por outro lado, traado da esquerda para a direita (neste livro). Assim, enquanto a Figura 13.2 mostra uma cauda frontal, o cromatograma correspondente mostraria uma cauda no ramo negativo (descendente) do pico de cada componente.
Figura 13.1 Desenvolvimento cromatogrfico de uma mistura ternria.
Figura 13.2 Distribuio de massa.
Alexandre Schuler - Cromatografia 14. APNDICE 5 Outros detetores empregados em Cromatografia 14.1. Detetor de Nitrognio e Fsforo (DNP)
60
O DNP um detetor utilizado em cromatografia a gs e foi projetado especificamente para a deteco de compostos nitrogenados (N) e fosforados (P) a nvel de traos (concentraes da ordem de ppb). Tambm conhecido como detetor termoinico, o DNP utiliza uma eletrnica (e o prprio hardware) equivalente ao DIC, inclusive com os mesmos gases (Nitrognio como fase mvel e Hidrognio e Ar Sinttico como gases da chama). O polarizador contm uma pastilha alcalina e a razo de fluxos dos trs gases (que diferente para compostos nitrogenados ou fosforados) insuficiente para produzir chama, mas o potencial eltrico estabelecido no local gera um estado de plasma, que aumenta de 14105 a sensibilidade do detetor frente a esses compostos, relativamente a outros compostos. Devido a essas caractersticas, o DNP dito seletivo para compostos nitrogenados e fosforados, unicamente para solues extremamente diludas, sendo portanto ideal para a deteco de traos de pesticidas organo-clorados e organo-fosforados. 14.2. Detetor Fotomtrico de Chama (DFC) O DFC basicamente um detetor de ionizao de chama, no que diz respeito ao hardware. Entretanto, a deteco baseia-se na absoro da radiao emitida pelo enxofre (e tambm pelo fsforo e ainda outros elementos) na regio visvel do espectro eletromagntico. Trata-se portanto de um espectrofotmetro, obedecendo assim Lei de Beer. A radiao emitida pela chama atravessa um filtro, o qual seleciona o comprimento de onda desejado (394 nm para o enxofre e 526 nm para o fsforo). Para compostos contendo um desses elementos, sua sensibilidade da mesma ordem de grandeza do DNP, sendo portanto indicado para a deteco de traos (ppb) de pesticidas fosforados e sulfurados. 14.3. Detetor de ons At os anos 70 a Cromatografia Instrumental apenas no era empregada na anlise de ons (ctions e nions). Posteriormente foi observado que o bombeamento em paralelo de um reagente complexante poderia transformar o on em um derivado (na sada da coluna), colorido, o qual seria detectado num espectrofotmetro (ex.: detetor UV-VIS). A separao cromatogrfica de ons, no discutida neste livro, ocorre numa coluna contendo uma resina trocadora de ons apropriada, tratando-se portanto de uma tcnica bastante antiga, mais largamente empregada na purificao de guas (deionizao). O equipamento , em ltima anlise, um HPLC tpico. Para evitar o trabalho de derivao, foi desenvolvido um detetor especfico, o detetor de ons, que , em ltima anlise, um condutivmetro. Consta de um par de eletrodos contidos numa clula termostatizada. Aplica-se um campo eltrico entre os eletrodos. O efluente da coluna passa pela clula, variando a resistncia entre os eletrodos, de acordo com a Lei de Ohm. A condutncia (L) inversamente proporcional resistncia e
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medida em Ohm-1. Essa unidade atualmente denomina-se Siemens. Quando a distncia entre os eletrodos de 1 cm, tem-se: k = L/A onde k a condutncia especfica e A a rea do eletrodo. Por outro lado, a condutncia equivalente (Ce) relacionada com a condutncia especfica como: Ce = 1000 k/c onde c a concentrao do on em equivalente-grama/L. 14.4. Detetor de Fluorescncia O Detetor de Fluorescncia, utilizado em HPLC, equivalente a um Detetor de Ultravioleta. A nica diferena consiste na localizao (ortogonal e no linear) em relao ao caminho tico. Desse modo, captada apenas a radiao proveniente do processo de fluorescncia, caracterstico de certas classes de compostos. Assim, substncias que no fluorescem podem existir na amostra sem interferir na deteco. Uma importante aplicao a anlise de aminocidos em materiais biolgicos (ex.: teste do pezinho). Neste exemplo, os aminocidos so transformados em derivados fluorescentes com o reagente AQC (carbamato de aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidila). Nove aminocidos podem ser analisados em aproximadamente dez minutos, em gradiente ternrio, com limite de deteco menor que 10 mg/L. 14.4. Detetor Eletroqumico O Detetor Eletroqumico, tambm utilizado em HPLC, basicamente uma clula eletroqumica. O analito oriundo da coluna, ao passar pela clula, oxidado (ou reduzido) pelo potencial aplicado, gerando uma corrente eltrica que proporcional sua concentrao. Existem dois tipos de detetores: a) Detetor coulomtrico: a amostra passa atravs da clula. Desse modo, todo o material oxidado (ou reduzido); b) Detetor amperomtrico: a amostra passa pela superfcie do eletrodo. Assim, apenas cerca de 1% a 5% do material realmente oxidado (ou reduzido). Desenvolvido para detectar traos (ppb a ppt) de ons, este detetor exige alta pureza de solventes e reagentes. A gua, por exemplo, deve ser deionizada, purificada em sistema Milli-Q ou equivalente e filtrada em filtros com 0,2 m (membrana de nylon 66) e sua resistividade deve ser ao menos 18,2 Mohm.cm. O fabricante inclusive aconselha que ao sair do sistema Milli-Q a gua passe em coluna com fase mvel C18 para extrao.
Alexandre Schuler - Cromatografia 15. APNDICE 6 Estatstica 15.1. Erro estatstico
62
Todo trabalho experimental dotado de erro. Trata-se aqui de dois tipos de erro: a) erro estatstico e b) erro sistemtico. O erro estatstico possui caractersticas aleatrias. Pode ser avaliado e minimizado, mas nunca anulado. Apresenta um comportamento gaussiano, isto , em um certo nmero de repeties, os valores que mais se afastam da mdia (aritmtica) ocorrem com menor freqncia e erros positivos e negativos de mesma grandeza ocorrem com igual freqncia. O erro sistemtico, por outro lado, um erro determinado, possui sinal ( positivo ou negativo). Em Cromatografia, o erro sistemtico corrigido automaticamente pelo prprio mtodo de clculo (Seo 6.3; p. 33). 15.2. Avaliao do erro estatstico Uma das maneiras de se medir o grau de disperso de um conjunto de resultados analticos (repeties) o desvio padro (s), o qual pode ser calculado com auxlio da equao s = [(xi - x )/(n 1)]1/2 (eq. 22) onde x i um resultado qualquer, x a mdia aritmtica e n o nmero de repeties. Esse parmetro denominado primeira estimativa do desvio padro, j que o verdadeiro desvio padro s pode ser calculado quando n tende para infinito. Entretanto, s s pode ser empregado quando n maior que 10. Como normalmente n muito pequeno (3 a 5 determinao em paralelo), emprega-se em seu lugar a segunda estimativa do desvio padro (sR): sR = Kn R (eq. 23)
onde R a amplitude, ou seja, a diferena entre o valor (resultado analtico) maior e o valor menor. O valor de Kn obtido da Tabela 15.1. 15.3. Avaliao da exatido Na realidade, erro de exatido o erro sistemtico, que seria corrigido pelo prprio mtodo analtico, conforme afirmado acima. Entretanto, o analista pode cometer erros operacionais que resultem em erro sistemtico (ex.: uso de solventes contendo impurezas que interfiram na identificao). O erro sistemtico pode ser avaliado com auxlio do teste t (de Student), que compara a concentrao real de uma soluo padro, preparada com todo critrio (por exemplo, preparada por um Laboratrio de Referncia) com a concentrao do padro empregado na calibrao do equipamento. A equao seguinte aplicada, com auxlio da Tabela 15.2:
63
Tabela 15.1 - Valores de Kn para clculo de sR. n Kn 2

0,8862
3
0,5908
4
0,4857
5
0,4299
6
0,3946
7
0,3698
8
0,3512
9
0,3367
10
0,3249
t=
X n s
(eq.24)
onde X a mdia aritmtica das n determinaes, a concentrao real, s calculado de acordo com a eq. 22 (p. 63) e t comparado com o valor tabelado (Tabela 15.2). Se o valor de tcalc for menor ou igual ao de ttab na coluna P = 95%, para o correspondente valor de n-1, o Laboratrio em avaliao est correto. Tabela 15.2 - Valores de t para aplicao do teste t. n-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 90 6,314 2,920 2,353 2,132 2,015 1,943 1,895 1,860 1,833 1,812 P (%) 95 12,706 4,303 3,182 2,776 2,571 2,447 2,365 2,306 2,262 2,228 99 63,657 9,925 5,841 4,608 4,032 3,707 3,499 3,355 3,250 3,169
15.4. Avaliao da reprodutibilidade O objetivo comparar a preciso de um Laboratrio, de um analista, de um equipamento ou de um mtodo (ou um determinado procedimento) com outro. Aplica-se o teste F, que compara a disperso de um conjunto de dados com a de outro. Se as diferenas em preciso forem estatisticamente significativas, o valor de Fcalc ser maior que o valor de Ftab (Tabela 15.3). Para uso da eq. 25, o maior desvio padro colocado no numerador, de modo a ter-se um valor de F maior que 1.
F=
s2 A s2 B
(eq. 25)
Tabela 15.3 - Valores de F para aplicao do teste F
64
(n -1) de B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 161 18,5 10,1 7,7 6,6 6,0 5,6 5,3 5,1 5,0
2 200 19 8,6 6,9 5,8 5,1 4,7 4,5 4,3 4,1
3 216 19,2 9,9 6,6 5,4 4,8 4,4 4,1 3,9 3,7
(n - 1) PARA O MTODO A 4 5 6 7 225 230 234 237 19,2 19,3 19,3 19,4 9,1 9,0 8,9 8,8 6,4 6,3 6,2 6,1 5,2 5,1 5,0 4,9 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 4,0 3,9 3,6 3,8 3,7 3,6 3,5 3,6 3,5 3,4 3,3 3,5 3,3 3,2 3,1
8 239 19,4 8,8 6,1 4,8 4,2 3,7 3,4 3,2 3,1
9 241 19,4 8,8 6,0 4,8 4,1 3,6 3,3 3,1 3,0
10 242 19,4 8,8 6,0 4,8 4,1 3,6 3,3 3,1 3,0
15.5. Nmero ideal de repeties O nmero ideal de repeties (determinaes em paralelo) calculado com aplicao das eq. 26 e 27:
t.s
(eq. 26)
L = 100/
(eq. 27)
Os dados so organizados no Quadro abaixo (os valores so exemplo fictcio), para facilitar a interpretao. Na ltima coluna indicada a diferena entre o valor de L atual e o da linha anterior. No momento em que a diferena (vale dizer, a diminuio na disperso dos valores, ou ainda o aumento na preciso) fica desprezvel, a critrio do analista, este adota o nmero anterior como sendo o nmero ideal de repeties.
n 2 3 4 5 6
0,260 0,072 0,046 0,036 0,030
amostra A: = 1% L Dif. 26,0 7,2 18,8 4,6 2,6 3,6 1,0 3,0 0,6
15.6. Expresso do resultado final
65
Para explicitar o grau de confiabilidade em uma anlise, necessrio indicar os limites de confiana. Na prtica, comum definir os limites a partir da amplitude. Assim, um resultado Re representado como:
Re = X + R/2
Na realidade, caso o mtodo tenha sido submetido a uma avaliao estatstica completa, emprega-se a relao:
Re = X + t. Kn.
15.7. Clculo do coeficiente de correlao (r)
R n
Na Seo 10.4 (p. 54) foi solicitado o clculo do coeficiente de correlao. Este clculo realizado com uso da eq. 28: (eq. 28)
Para ordenar os clculos, faz-se uso do quadro abaixo, onde x e y so, respectivamente, concentrao e rea do pico.
Ponto no 1 2 ... ... ... n Totais
x x1 x2 ... ... ... xn x
y y1 y2 ... ... ... yn y
x.y x1.y1 x2.y2 ... ... ... xn.yn x.y
x2 x12 x 22 ... ... ... x n2 x2
y2 y12 y22 ... ... ... yn2 y2

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SUMRIO 1 - Introduo, 1 1.1. Histrico, 1 1.2. Classificao, 1 2 - Tipos de Processos Cromatogrficos, 3 2.1. Cromatografia de adsoro, 3 2.2.

Figura 1.1 - O Processo Cromatogrfico .

Alexandre Schuler - Cromatografia Cromatografia em Fase Lquida de Alto Desempenho

Alexandre Schuler - Cromatografia 2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRFICOS 2.1. Cromatografia de Adsoro

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Se M0 a massa total da substncia e M1 a massa dissolvida no solvente 1,

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Alexandre Schuler - Cromatografia Cromatografia em Coluna

FE: Esqualano (um hidrocarboneto de baixssima polaridade)

FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)

A Benzeno (ponto de ebulio = 80,2oC)

B ciclo-Hexano (ponto de ebulio = 81,0oC)

Figura 2.4 Separao em funo da diferena no ponto de ebulio

Figura 2.5 - Efeito da polaridade sobre a separao cromatogrfica

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A- n-nonano (154oC) B- n-decano (174oC) C- n-undecano (194oC) no polar, no forma ponte

polar, ponte de hidrognio fortssima

Figura 2.6 Efeito da ponte de hidrognio sobre a separao cromatogrfica

FE: Apiezon (um hidrocarboneto)

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Figura 2.8 - Efeito da concentrao da fase estacionria sobre a separao cromatogrfica.

V1 < V2 < V3 < V4

Figura 2.9 - Efeito da vazo da fase mvel sobre a separao cromatogrfica.

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Figura 2.10 - Efeito da temperatura sobre a separao cromatogrfica.

TIPO ADSORO PARTIO

EFEITO DIMINUI TR DIMINUI TR DIMINUI TR NO ALTERA T R

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Esses dados comprovam a influncia da natureza do gs de arraste sobre a eficincia.

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Alexandre Schuler - Cromatografia 4 - O CROMATGRAFO 4.1. O Cromatgrafo a Gs

Figura 4.1 - Fluxmetro de bolha b) Controles Pneumticos

Figura 4.2 - Divisor de fluxo para coletor

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Cromatograma 4.1 - Mesma atenuao f) Registrador

Cromatograma 4.2 - Atenuaes diferentes

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Alexandre Schuler - Cromatografia c) opera geralmente temperatura ambiente;

A Figura 4.3 um diagrama em blocos de um CL tpico. Cada bloco descrito a seguir:

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S = sensibilidade (mV.cm3/mg) K = constante da clula I = intensidade de corrente R = resistncia do filamento

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Figura 4.4b- Diagrama Eletrnico do DCT

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Figura 4.7 - Detetor de ndice de Refrao tipo Fresnel.

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Alexandre Schuler - Cromatografia 6 - ANLISE QUANTITATIVA 6.1. Introduo

Alexandre Schuler - Cromatografia

iv - Determinao grfica: a) S = h.L ou b) S = h.L,

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Figura 6.2 - Correo vertical

Figura 6.3 - Correo vertical

Fig. 6.4 - Correo horizontal

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