Cromatografia (Livro)

SUMÁRIO
1 - Introdução, 1
1.1. Histórico, 1
1.2. Classificação, 1
2 - Tipos de Processos Cromatográficos, 3
2.1. Cromatografia de adsorção, 3

2.2. Cromatografia de partição, 4
2.3. Cromatografia em fase líquida, 6
2.4. Fatores que influem na separação, 7
2.5. Cromatografia em fase gasosa, 11
3 - Tratamento teórico da Cromatografia, 14
3.1. Equação de Van Deemter, 14

3.2. Fase estacionária, 14
3.3. Suporte, 15
3.4. Coluna, 16
3.5. Fase móvel, 16
4 - O Cromatógrafo, 18
4.1. O Cromatógrafo a Gás, 18

4.2. O Cromatógrafo a Líquido, 20
4.3. Detetores, 23
5 - Análise Qualitativa, 30
6 - Análise Quantitativa, 31
6.1. Introdução, 31
6.2. Medição de área, 31
6.3. Métodos de cálculo, 33
6.4. Seleção do melhor método de cálculo, 37
7. Otimização do processo analítico, 39
7.1. Parâmetros analíticos, 39

7.2. Projetando um método analítico, 41
7.3. Validação de um método analítico, 43
8. Técnicas adicionais de identificação, 50

8.1 Tempo de retenção e retenção relativa, 50
8.2. Índice de retenção, 50
8.3. Equivalência entre fases estacionárias, 51
9. Bibliografia, 52
10. Apêndice 1 (Características Básicas dos Detetores), 53
10.1. Sensibilidade, 53
10.2. Nível de ruído, 53
10.3. Limite de Detecção, 53
10.4. Faixa de Linearidade Dinâmica, 54
11. Apêndice 2 (Técnicas de introdução da amostra), 55
12. Apêndice 3 (Sistemas de aquisição de dados), 57
13. Apêndice 4 (O desenvolvimento cromatográfico), 58
14. Apêndice 5 (Outros detetores utilizados em Cromatografia), 60
15. Apêndice 6 (Estatística), 64

Alexandre Schuler - Cromatografia
1 - INTRODUÇÃO
1.1. Histórico
Cromatografia é um termo genérico, aplicado a um processo de

separação físico-químico, o qual é baseado nos fenômenos de adsorção e partição. Este
termo foi escolhido porque as primeiras separações foram realizadas com substâncias
coloridas. Entretanto, o processo cromatográfico não é restrito a essa classe de
substâncias, constituindo-se na atualidade no método mais eficiente de separação, com
aplicações na Química Analítica Qualitativa e Quantitativa, para compostos orgânicos e
inorgânicos, independentemente de seu estado físico.
1.2. Classificação
Num processo cromatográfico são envolvidas uma fase móvel e uma

fase estacionária. A fase estacionária é um sólido ou um líquido (Figura 1.1). No segundo
caso, este fica impregnado em um sólido (suporte) e o fenômeno mais atuante é a
partição. No primeiro caso, tem predominância a adsorção. Assim, pode-se classificar a
Cromatografia em dois tipos gerais: Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de
Partição.
Figura 1.1 - O Processo Cromatográfico . A Fase Móvel transporta a amostra através da Fase
Estacionária. A velocidade média das partículas da amostra depende da sua natureza. Desse
modo, cada componente atingirá o final da coluna em um instante diferente.
A fase móvel pode ser um líquido ou um gás. No primeiro caso,

denomina-se o processo de Cromatografia em Fase Líquida e no segundo caso de
Cromatografia em Fase Gasosa, ou simplesmente Cromatografia a Líquido e
Cromatografia a Gás.
A Cromatografia pode ainda ser classificada em função da técnica

empregada:
 Cromatografia em Papel
 Cromatografia em Camada Delgada
 Cromatografia em Coluna Clássica
Alexandre Schuler - Cromatografia 2
 Cromatografia em Fase Gasosa

 Cromatografia em Fase Líquida de Alto Desempenho
Esta última é mais conhecida pela iniciais de seu nome em inglês

(High Performance Liquid Chromatography - HPLC) e constituem-se variantes suas
as seguintes técnicas:
 Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)
 Cromatografia de Troca Iônica (IEC)
GPC (do inglês Gel Permeation Chromatography) é empregada na

análise de polímeros, enquanto a IEC (do inglês Ion Exchange Chromatography) é
empregada na análise de íons (cátions e ânions).
2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS
2.1. Cromatografia de Adsorção
Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido

(adsorvente) fixa em sua superfície um líquido ou um gás, por meio de interações
semelhantes às “forças de Van Der Waals”. Chama-se coeficiente de adsorção à relação
Na
ka 
Nn
onde Na e Nn são respectivamente o número de moles adsorvidos e não adsorvidos de uma
determinada substância. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka, estes
variando com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vários
componentes é forçada a passar através de um tubo contendo um adsorvente (coluna
cromatográfica), cada componente necessitará de um intervalo de tempo diferente para
transpor a coluna. Esse intervalo de tempo é denominado tempo de retenção (Tr). A
Figura 2.1a ilustra um processo de Cromatografia por Adsorção. A substância mais
fortemente adsorvida é mais dificilmente arrastada pela Fase Móvel.
a) Cromatografia de Adsorção b) Cromatografia de Partição
Figura 2.1 - Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.

2.2. Cromatografia de Partição
Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos

não miscíveis, ela se dissolverá parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a
relação C1 / C2, onde C1 e C2 são as concentrações da substância em cada um dos dois
líquidos. Denomina-se coeficiente de partição à relação
C1
kp 
C2
Se M0 é a massa total da substância e M1 é a massa dissolvida no
solvente 1, podemos escrever
M1 M1 V2
kp  V1  
( M 0  M 1) V1 M0  M1
V2
k pV 1
logo, M 1  M 0. (eq. 1)
V 2  k pV 1
Se a substância estava inicialmente dissolvida no solvente 1, M1 é a
massa que permanece neste solvente após adição do solvente 2, o qual extraiu a massa
(M0 - M1). Se as duas fases forem separadas (com auxílio de um funil de separação, por
exemplo), a adição de outra quantidade do solvente 2 vai extrair a massa (M1 - M2), onde
k pV 1
M 2  M 1. (eq. 2)
V 2  k pV 1
Substituindo na eq. 2 o valor de M1 (eq. 1 ), fica
M2 = Mo [kpV1(V2 + kpV1)]2 (eq. 3)
A eq. 3 pode ser generalizada para
Mn = Mo [kpV1(V2 + kpV1)]n (eq. 4)
que dá a massa Mn que permanece no solvente 1 após n extrações com o solvente 2. Dá-se ao
processo agora descrito o nome de extração. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de,
por exemplo, 2 componentes, com kp  kp ' , um dos componentes ficará preferencialmente
no solvente 1 e o outro no solvente 2. Assim sendo, à medida que n cresce, cada fase ficará
mais pura em um dos componentes. No caso anterior (extração), a porção de líquido 1
era sempre a mesma, renovando-se apenas o líquido 2. Agora, ambos são renovados.
O Esquema 2.1, onde o líquido 1 é o superior, ilustra o processo, que pode ser
visualizado a nível molecular na Figura 2.1.b.
Sejam duas substâncias A e B, onde kA é maior que kB. Isto significa que
o líquido 1 vai se enriquecendo de A e o líquido 2, relativamente, vai se enriquecendo de
B, a cada etapa do processo. Os números da esquerda, em cada quadrícula, indicam a
fração de A e os da direita indicam a fração de B. Do mesmo modo, os números
superiores indicam a fração de A e de B no líquido 1 e os inferiores indicam a fração de A
e de B no líquido 2. No exemplo, foi utilizada uma mistura com quantidades iguais de A e
de B, cujos coeficientes de partição valem, respectivamente, 3 e 1/3.
Para este segundo tipo de procedimento, a eq. 4 não é válida. Em seu

lugar, pode ser deduzida, de modo semelhante, a eq. 5, onde Mn é a massa extraída após n
etapas. A partir dos valores de MAn e MBn, pode-se calcular a composição da mistura (ou o
grau de pureza de cada componente) em cada solvente, após n etapas (n partições).
Esquema 2.1 - Distribuição (partição) de duas substâncias (A e B), em dois líquidos (1 e

2) não miscíveis.
Mn = Mo [V2(V2 + kpV1)]n (eq. 5)
A partição, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo

cromatográfico. O número de “equilíbrios” (etapas) que ocorrem dentro de uma coluna
(n) é conhecido como o “número de pratos teóricos”, prato teórico sendo um ponto de
equilíbrio (entre uma fase e outra). A distância entre dois pontos de equilíbrio
consecutivos chama-se “altura equivalente a um prato teórico” (H). Os parâmetros n e H
serão novamente discutidos mais adiante.
IMPORTANTE ! Se kB também for maior que a unidade, a perda de B será muito grande
e também a purificação de A será muito demorada (exigirá maior número de etapas).
2.3. Cromatografia em Fase Líquida
O exemplo mais simples de cromatografia a líquido é a separação em

uma camada delgada de sílica-gel depositada sobre uma placa de vidro (Cromatografia
em Camada Delgada). A Figura 2.2 ilustra o processo.
O líquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os

componentes de uma mistura binária (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicação).
Quando o solvente se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta é removida da
cuba que contém o solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posição vertical
e a um nível abaixo do ponto de aplicação. As razões de frente, Rf A = d1 / d3 e RfB = d2 / d3
são características de cada substância, dependendo da natureza da fase móvel e da fase
estacionária. A Cromatografia em Camada Delgada é a mais empregada em Análise
Qualitativa ou semi-Quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra utilizada,
é menos indicada para fins preparativos, quando então se emprega a Cromatografia em
Coluna Clássica. Neste segundo tipo de processo, a fase estacionária é colocada em um
tubo de vidro (coluna cromatográfica) colocado na posição vertical. A coluna é dotada de
uma torneira na extremidade inferior (Fig. 2.3), que é utilizada para controlar a vazão da
fase móvel, que desce por gravidade.
Fig. 2.2 - Cromatografia em Camada

Delgada.
Neste exemplo, a amostra contém dois

componentes, A e B, que são identificados
pelos respectivos valores de R f
A necessidade de se controlar a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna,

além da impossibilidade (naquela época - anos 50) de se bombear um líquido
com fluxo constante e contínuo, levaram os projetistas a abandonar essa técnica, passando
a utilizar um gás como fase móvel (1956).
O ponto A’ indica o nível da fase estacionária e o ponto A

indica o nível da fase móvel. A diferença A’ - A deve ser o
menor possível, para evitar a diluição do material a ser
cromatografado, o que resultaria em zonas (na Fig. 2.3, as
faixas 1, 2 e 3) mais largas. Ao se fazer a eluição (passagem da
fase móvel), os componentes afastam-se do ponto de aplicação
(topo da coluna) a uma distância d tal que d/ l = Rf ( l é o
comprimento da coluna), obtendo-se assim uma coluna
desenvolvida . A partir daí, continuando-se a eluição, cada
componente pode ser coletado isoladamente, quando atingir o
final da coluna. Denomina-se Volume de Retenção (V r) o
Figura 2.3 volume de fase móvel necessário para a eluição completa de
um componente. Desse modo, tem-se V r = V 1 / Rf, onde V 1 é o
Cromatografia volume ocupado pela fase móvel dentro da coluna. A partir daí
em Coluna pode ser calculado o volume total de solvente necessário para a
eluição de todos os componentes da amostra. No Apêndice 4,
são discutidos mais detalhes sobre o desenvolvimento da
coluna.
2.4. Fatores que influem na separação
Independentemente do processo envolvido na separação cromatográfica

(adsorção ou partição), esta é função de uma série de fatores, a saber:
Natureza da fase estacionária Vazão da fase móvel

Concentração da fase estacionária Temperatura
Natureza da fase móvel Granulometria e geometria do suporte
A polaridade da fase estacionária é um fator importante a se

considerar. Em princípio, quando se tem uma fase estacionária não polar, os
diversos componentes da amostra eluem na ordem crescente de seus pontos de
ebulição e o processo assemelha-se bastante a uma destilação (Figura 2.4). Quando
a fase estacionária apresenta polaridade, essa ordem de eluição em função do ponto
de ebulição fica alterada (Figura 2.5) e só é obedecida quando os componentes
apresentam polaridade de mesma ordem de grandeza (componentes A-C e D-G da
Figura 2.6). Em alguns casos, a diferença de polaridade pode ser equilibrada com a
diferença de ponto de ebulição, fazendo com que dois componentes distintos eluam
juntos (Figura 2.7). Nesses casos, outros fatores podem auxiliar na separação, como
a ponte de hidrogênio entre os componentes D-G da Figura 2.6.
FE: Esqualano (um hidrocarboneto de baixíssima polaridade) FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)
B  ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0 oC)

A  Benzeno (ponto de ebulição = 80,2oC)
Figura 2.4 – Separação em função da Figura 2.5 - Efeito da polaridade sobre a

diferença no ponto de ebulição separação cromatográfica
A concentração da fase estacionária líquida também influi na separação,

como pode ser observado na Figura 2.8. Aliás, com o uso, é normal diminuir a
concentração, por arraste pela fase móvel, mesmo à temperatura ambiente, de modo que
colunas com fase estacionária líquida possuem um tempo de vida útil finito, que pode ser
bastante curto, à medida em que a temperatura da análise se aproxima da temperatura
limite, que por definição situa-se 150 oC abaixo da temperatura de ebulição da fase
estacionária. Atualmente, tem sido desenvolvidas fases quimicamente ligadas (ver Seção
3.2 - Fase Estacionária; p. 14).
Coluna: diglicerol, 20%, 6 metros
A- n-nonano (154oC) D- etanol (78oC) H- água (100oC)

B- n-decano (174oC) E- n-propanol (94oC)
C- n-undecano (194oC) F- n-butanol (118oC)
G- n-pentanol (132oC)
não polar, não forma ponte polar, ponte de hidrogênio média polar, ponte de hidrogênio fortíssima
FE: Apiezon (um hidrocarboneto)
Figura 2.6 – Efeito da ponte de hidrogênio sobre a separação cromatográfica
Outro fator importante,
principalmente em HPLC, é a polaridade da
fase móvel. Aliás, esse é o principal recurso
para implementar uma separação (ver
Gradiente de Polaridade, na Seção 4.2; p.
22). Também a vazão da fase móvel é muito
importante na separação. A Figura 2.9 ilustra
a situação, que foi alvo de um estudo semi-
teórico realizado por van Deemter (Capítulo
A  Benzeno (ponto de ebulição = 80,2 C)
o
B  ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)
Figura 2.7 - Uma separação malsucedida

3). Também a temperatura (a que está submetida a coluna) é fator determinante na separação,
particularmente em CFG, conforme resume o quadro anexo à Figura 2.10. Finalmente, a
granulometria da fase estacionária sólida (ou do suporte sólido da fase estacionária líquida),
conforme mostrado na Tabela 2.1, também influi na separação.
Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte/FE sólida sobre a separação cromatográfica
malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min)

60-80 4300 0,93 20
80-100 4600 0,87 20
100-120 5700 0,70 24
D.E. = 1/8”; l = 4 m; C = 10 %
Figura 2.8 - Efeito da concentração da fase estacionária

sobre a separação cromatográfica.
onde: V 1 < V2 < V3 < V4
Figura 2.9 - Efeito da vazão da fase móvel sobre a separação

cromatográfica.
Figura 2.10 - Efeito da temperatura sobre a separação cromatográfica.

O quadro apresentado a seguir sumariza a relação entre o efeito e o tipo de
processo.
TIPO FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA EFEITO

ADSORÇÃO G S DIMINUI TR
L S DIMINUI TR
PARTIÇÃO G L DIMINUI TR
L L NÃO ALTERA TR
2.5. Cromatografia Em Fase Gasosa (CFG)
Na Cromatografia a Gás empregam-se colunas bem mais longas que

aquelas usadas em Cromatografia a Líquido. O princípio é o mesmo, mas a força motora é
a pressão do gás e não a força da gravidade, de modo que as colunas normalmente são
dobradas em espiral, a fim de ocupar menos espaço dentro do cromatógrafo. A Fig. 2.11
esquematiza um cromatógrafo a gás.
A amostra (gás, líquido ou sólido em solução) é injetada (ver Apêndice

2), com auxílio de uma microseringa ou válvula apropriada, no Injetor, que também é o
Vaporizador (V) e os seus vapores são arrastados para o interior da coluna pela fase móvel
(gás de arraste). Na saída da coluna, a amostra passa pelo Detetor (D), que envia um sinal
Fig. 2.11 - Cromatógrafo a Gás
para o Registrador (R). Como será visto adiante (Detetores, p. 23), este sinal é
proporcional à quantidade de cada componente, o que permitirá uma análise quantitativa.
Vale acrescentar que a Cromatografia a Gás é talvez o método de análise mais preciso. O
sinal eletrônico captado pelo registrador é transformado num movimento da pena do
mesmo. Como o papel de registro está em movimento, obtém-se um gráfico (Fig. 2.12)
denominado cromatograma.
Fig. 2.12 - Cromatograma de uma amostra com dois componentes.
As áreas A1 e A2 sob as duas curvas do cromatograma da Fig. 2.12 são

proporcionais às quantidades dos dois componentes na mistura. Distância de Retenção
(Dr) é a distância, no papel, entre o ponto registrado no momento da injeção (Início) e o
ponto correspondente ao máximo de cada curva (pico). Dr varia com a velocidade do
papel (z), mas o tempo de retenção (Tr = Dr/z) é uma característica da substância que
varia com a vazão da fase móvel, a natureza e a concentração da fase estacionária e com a
temperatura. Por isso, o cromatógrafo possui controladores de vazão da fase móvel e da
temperatura do forno da coluna. A coluna (e consequentemente a fase estacionária) pode
ser substituída, até encontrar-se a coluna ideal para uma dada amostra. Além disso, existe
uma vazão ideal para cada coluna, independentemente da natureza da amostra (ver Fig.
2.13). Assim sendo, a temperatura da coluna é o principal recurso disponível para obter-se
um máximo de separação entre os diversos componentes da amostra.
Outro parâmetro usado em CFG é a Retenção Relativa (RR), que é

também usado na identificação:
Tr 2 Vr 2 Dr 2
RR = = =
Tr 1 Vr 1 Dr 1
Essas relações são equivalentes, desde que Vr2 = F.Tr e F e z são constantes (F = vazão
da fase móvel).
Fig. 2.13 - Relação entre F e n ou H. Fi é a Vazão Ideal (os parâmetros A, B e C são

descritos na Seção 3.1, eq. 6).
Obs.: Experimentalmente determina-se H por medição da distância de retenção e

aplicação das equações:
n = (4Dr/L) 2 e H = l /n,
onde l é o comprimento da coluna e L é a largura do pico na base. A Figura 2.14 ilustra o

procedimento. O parâmetro n mede a eficiência de uma coluna cromatográfica
(v er C a pí t u l o 3).
Figura 2.14 - Procedimento para determinação do

número de pratos teóricos. As duas
grandezas devem ser medidas em
milímetros (ou em minutos ou
segundos).
3 - TRATAMENTO TEÓRICO DA CFG
3.1. Equação de Van Deemter
Van Deemter estabeleceu uma equação empírica (eq. 6) que relaciona as

diversas variáveis da Cromatografia a Gás com H (altura equivalente a um prato teórico).
Como H é igual a l /n e n mede a eficiência do processo, buscam-se condições em que o
valor de H é mínimo:
(eq. 6)
= parâmetro adimensional que mede as irregularidades no empacotamento da coluna.

dp = diâmetro médio das partículas do suporte.
Dg = coeficiente de difusão da amostra na fase móvel.
= fator de correção para a tortuosidade dos canais entre partículas.
K’ = k.Nl /Ng ; k = coeficiente de partição.
N= fração de fase estacionária (l) ou da fase móvel (g) dentro da coluna.
df = espessura efetiva do filme líquido (película de fase estacionária na superfície do suporte).
Dl = coeficiente de difusão da amostra na fase estacionária.
v= velocidade linear da fase móvel.
A equação de Van Deemter pode ser escrita sob a forma geral
H = A + B/v + C.v (eq. 7)
que é a equação de uma hipérbole (Fig. 2.13). Como pode ser visto na eq. 6, o modo de
empacotamento, o dimensionamento do suporte e o coeficiente de difusão da amostra em
cada fase são fatores que devem ser seriamente considerados, quando é projetada uma
coluna. Temperatura é talvez o fator mais importante, embora não apareça explicitamente
na eq. 6. É que K’ e D são altamente dependentes da temperatura. Realmente, observa-se
na prática que esta é a variável que mais influi na resolução, variando drasticamente a
retenção relativa. De um modo geral, o tempo de retenção depende da natureza da fase
estacionária, da temperatura de operação e da vazão da fase móvel.
3.2. Fase estacionária
A fase estacionária é um sólido (Cromatografia de Adsorção) altamente

poroso (mais de 150 m 2/g), ou, mais comumente, um líquido (Cromatografia de Partição). No
segundo caso, o líquido é depositado sobre um sólido (suporte), que será discutido mais
adiante.
Interações entre dipolos, polaridade e pontes de hidrogênio são os

principais fatores, na fase estacionária, que determinam a separação cromatográfica. Esses
fatores são dependentes da temperatura, daí também a necessidade de um controle dessa
variável. Os Cromatogramas 3.1.a e 3.1.b ilustram a influência da polaridade e da ponte
de hidrogênio sobre a separação. Em ambos, como são usadas fases estacionárias polares,
os picos aparecem na ordem crescente de polaridade dos componentes. Mas, no
Cromatograma 3.1.b, como a fase estacionária (diglicerol) interage com o etanol (ponte
de hidrogênio), o tempo de retenção deste é bastante aumentado (ver também Seção 2.4;
p. 7).
Alto ponto de ebulição e inércia química e catalítica (em relação à

amostra, à fase móvel e ao material de que é constituído o tubo da coluna) são os
principais requisitos para uma fase estacionária. Em relação ao ponto de ebulição (PE)
deve ser lembrado que a temperatura limite para operação com uma dada coluna é 150 0C
abaixo do PE da fase estacionária. Acima dessa temperatura, a perda por volatilização é
excessiva. Em anos recentes tem sido utilizada a FQL (Fase Quimicamente Ligada), onde
a FE une-se ao suporte mediante uma reação química. As fases estacionárias mais
freqüentemente utilizadas, com um amplo espectro de aplicações, são polímeros
derivados de silício, as polisiloxanas (ou siliconas), como a SE-30, por exemplo. Outra
fase também bastante utilizada é o polietilenoglicol (ex.: Carbowax 20M).
3.3. Suporte
O suporte tem a função de fixar dentro da coluna a fase estacionária. É

necessário que o suporte seja química e cataliticamente inerte. O material a ser
empregado também não pode exibir área superficial maior que 50 m 2/g, alta porosidade,
nem grande poder de adsorção. Centros ativos (ácidos ou básicos) podem provocar
modificações estruturais na amostra, devendo ser removidos. Terras diatomáceas, graças à
sua baixa capacidade de adsorção e à sua baixa porosidade, são ainda muito empregadas
como suporte. Um excelente suporte à base de diatomácea é comercializado com um
nome constituído da palavra Chromosorb seguida de uma ou mais letras (ex.: Chr WHP).
Atualmente, têm sido desenvolvidos materiais sintéticos, copolímeros do etilvinilbenzeno
com divinilbenzeno. A depender do processo de fabricação, esses polímeros também
podem ser empregados como fase estacionária (Ex.: Porapak Q, Chromosorb 101, etc).
Permitem um bom empacotamento, graças à uniformidade na granulometria e na própria
geometria das partículas.
Figura 3.1 - Ausência (a) e presença (b) de ponte de hidrogênio entre FE e etanol
3.4. Coluna
O material de que é constituída a coluna (tubo) pode ser aço inox 316,
alumínio, níquel, vidro ou teflon. Quando não se conhece o material a ser analisado, dá-se
preferência às colunas de vidro (trata-se de um vidro especialmente tratado, para remover
centros ácidos de sua superfície) ou de teflon, sendo que a última tem emprego mais
restrito, devido à sensibilidade ao calor e à pressão. As colunas são classificadas quanto
ao diâmetro externo:
- Coluna microanalítica (capilar) ............ 0,1 a 0,5 mm

- Coluna analítica .................................. 1/8”, 3/16” e 1/4”
- Coluna semi-preparativa ..................... 3/8”, 1/2” e 5/8”
- Coluna preparativa .............................. 5, 7 e 10 cm
As colunas analíticas mais comumente empregadas possuem 2 a 3 m de

comprimento, com 1.000 a 10.000 pratos teóricos. Colunas capilares são bem mais longas. As
primeiras capilares fabricadas possuíam mais de 100 m. Com o avanço da tecnologia, o
comprimento atual situa-se entre 20 e 40 m, embora com cerca de 100.000 pratos teóricos. Tem-se
notícia de uma coluna capilar com cerca de 1600 m de comprimento e 1 milhão de pratos teóricos.
Atualmente foram desenvolvidas colunas com 0,53 mm (colunas

“megabore”) com excelentes resultados. Mais simples de instalar, reúnem as qualidades
das colunas analíticas e das capilares.
As colunas usadas em CLAD (seção 4.2, p. 22) são bem mais curtas (10 a 40
cm) e os diâmetros encontrados mais comumente no comércio especializado variam entre 3 e 5
mm.
3.5. Fase móvel
Em CFG, a fase móvel é um gás inerte, devendo apresentar-se bastante

puro, principalmente quando tratar-se da análise de traços. Os gases mais empregados são
H2, N2, He, Ar e Ne, podendo também serem utilizados outros, em casos especiais.
Na escolha da fase móvel (ou gás de arraste), devem ser considerados os

seguintes fatores:
- Disponibilidade/custo.
- Eficiência na separação.
- Efeito sobre o tempo de análise.
- Segurança.
- Efeito sobre o sistema de detecção.
OBS.:
1 - A equação de Van Deemter simplificada (eq. 7), aplicada aos gases N 2 e H2,
apresenta os seguintes coeficientes (amostra: Propano), com uma dada
coluna:
Ha = 0,1 + 0,07/v + 0,05v (N2)

Hb = 0,1 + 0,28/v + 0,05v (H2)
Esses dados comprovam a influência da natureza do gás de arraste sobre a eficiência.
2 - A velocidade relativa de eluição aumenta na ordem H2 < N2 < He < Ar, fato que
demonstra a influência da natureza do gás de arraste sobre o tempo de análise.
A Tabela 3.1 resume a aplicação dos critérios acima mencionados, para

seleção da fase móvel em função do detetor empregado.
Tabela 3.1 - Gases mais recomendados para CFG, por tipo de detetor.
TIPO DE DETETOR GASES MAIS USADOS

(Ordem de prioridade)
Condutividade Térmica H2 > He >> N2
Ionização de Chama N2 > Ne > He
Captura Eletrônica N2 > He
Em Cromatografia a Líquido empregam-se como Fase Móvel

principalmente água deionizada, metanol, acetonitrila, etc. A seleção depende do detetor
a ser empregado e a fase móvel deve ser imiscível com a fase estacionária liquida.
4 - O CROMATÓGRAFO
4.1. O Cromatógrafo a Gás
A Fig. 2.11 (p. 11) representa esquematicamente um Cromatógrafo a

Gás. É possível agora descrever mais detalhadamente o instrumento.
a) Controles de Temperatura
O cromatógrafo dispõe de termostatos para controle independente do

aquecimento dos três principais setores: câmara de vaporização, forno da coluna e bloco
do detetor. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistência elétrica localizada
na base do forno, é homogeneizado por um ventilador, que pode permanecer ligado após
o final do aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse caso, o compartimento
do forno deve permanecer aberto, exceto nos equipamentos que possuam dispositivo de
resfriamento automático.
Figura 4.1 - Fluxímetro de bolha Figura 4.2 - Divisor de fluxo para coletor
b) Controles Pneumáticos
Os cromatógrafos a gás normalmente possuem uma válvula controladora

de pressão e outra para ajuste da vazão da fase móvel. Idênticos sistemas existem para o
controle da vazão dos gases auxiliares (ver seção 4.3.2.b; p. 25). A vazão é medida com o
auxílio de um fluxímetro de bolha, ou bolhômetro (Fig. 4.1). A “pêra” (parte inferior)
contém uma solução de sabão líquido. Comprimindo-se a “pêra”, o nível do líquido sobe
e o gás forma uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazão, é suficiente
marcar com um cronômetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na
atualidade, existem no mercado alguns equipamentos totalmente microprocessados,
tornando obsoletos esses acessórios.
c) Coletor de Frações
O coletor de frações é um acessório utilizado em Cromatografia

preparativa. O material efluente da coluna pode passar por um divisor de fluxo (Fig. 4.2),
de modo que uma parte é desviada para o coletor, onde cada componente, isoladamente, é
condensado. Colunas de maiores dimensões permitem a injeção de uma maior quantidade
de amostra, permitindo assim a produção de pequenas quantidades de um material com
alta pureza (maior que 99,9999%), que pode ser empregado como padrão, por exemplo.
d) Detetores
Por ser necessário um estudo mais detalhado, serão discutidos mais adiante.
e) Eletrômetro
O eletrômetro é um amplificador de sinal. Este módulo pode ser

controlado a qualquer instante, de modo que um sinal fraco (componente menor) pode ser
ampliado independentemente dos outros, enquanto que um sinal muito forte (componente
maior) pode ser atenuado o suficiente para que seu pico fique contido no papel do
registrador. Os Cromatogramas 4.1 e 4.2 ilustram, respectivamente, a relação real de áreas
e outro registro da mesma amostra, com ampliação do primeiro sinal e atenuação do
terceiro, ou mais exatamente, atenuação menor para o primeiro e atenuação maior para o
terceiro, em relação à atenuação do segundo. Logicamente, as áreas medidas no segundo
cromatograma, multiplicadas pelos respectivos fatores de atenuação, fornecem os valores
reais das áreas relativas.
Cromatograma 4.1 - Mesma atenuação Cromatograma 4.2 - Atenuações diferentes
f) Registrador
O registrador é um instrumento acessório, que transforma o sinal emitido

pelo detetor e amplificado pelo eletrômetro, em um sinal mecânico. Na extremidade do
sistema mecânico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da
linha de base, é proporcional à quantidade do componente na amostra. Como o papel está
em movimento, obtém-se uma curva (cromatograma), onde a distância do início da
análise (ponto de injeção) ao máximo de cada pico é a distância de retenção (Dr).
Dividindo Dr por z (velocidade do papel), obtém-se o tempo de retenção, Tr. Idealmente,
com separação completa e condições ótimas (incluindo seleção perfeita da fase
estacionária), obtém-se uma curva simétrica. No Apêndice 3 são discutidas outras técnicas
de aquisição de dados.
g) Programador Linear de Temperatura
Quando a retenção relativa (RR) de alguns componentes é próxima da

unidade (baixa resolução) e no entanto a temperatura de ebulição dos componentes menos
voláteis é muito alta (Cromatograma 4.3), um aumento na temperatura da análise
(temperatura da coluna), com o objetivo de reduzir o tempo de análise e obter um pico
mais agudo para os últimos componentes (o que inclusive diminuiria o erro na
determinação de Dr), acarretaria uma diminuição na já pequena retenção relativa dos
primeiros componentes (Cromatograma 4.4). Em situações como essa, pode-se aplicar um
gradiente de temperatura, com o auxílio de um Programador Linear de Temperatura
(PLT). A velocidade de aquecimento pode ser controlada, sendo possível também
promover um aquecimento isotérmico em algumas regiões. Em operações desse tipo
deve-se indicar no cromatograma a temperatura inicial (T i), a temperatura final (T f), que
não deve diferir da temperatura de ebulição da fase estacionária em menos de 150 0C, e a
velocidade de aquecimento, para que o cromatograma possa ser reproduzido
posteriormente (Cromatograma 4.5).
Cromatogramas 4.3, 4.4 e 4.5 - Análises em diferentes temperaturas

4.2. O Cromatógrafo a Líquido
O cromatógrafo a líquido (mais comumente conhecido pela sigla inglesa

da técnica, HPLC (High Performance Liquid Chromatography; em português:
Cromatografia Líquida de Alto Desempenho), é um instrumento mais simples que o
cromatógrafo a gás nos seguintes aspectos:
a) só possui um canal analítico, enquanto CG’s podem ter até quatro canais;
b) é modulado, isto é, sistema de bombeamento e detetor são independentes, o
que facilita a substituição de detetores;
c) opera geralmente à temperatura ambiente;
A Figura 4.3 é um diagrama em blocos de um CL típico. Cada bloco é

descrito a seguir:
Figura 4.3 - Diagrama em blocos de um HPLC típico
a) Reservatório de Fase Móvel
A Fase Móvel (um líquido puro ou uma mistura de composição definida)

deve ser filtrada em membranas com 0,46 m de diâmetro de poros e desgaseificada (ver
próximo item).
b) Sistema de desgaseificação
A Fase Móvel deve ser desgaseificada, para evitar a formação de bolhas,

as quais podem provocar cavitação (com conseqüente dano à bomba) ou gerar picos
falsos, ao passarem pela célula do detetor. São conhecidas várias técnicas de
desgaseificação:
- aquecimento com agitação;

- borbulhamento de gás hélio;
- ultra-som;
- vácuo
c) Bomba
O bombeamento da Fase Móvel é realizado por uma bomba

controlada por um microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de sucção
(para evitar vaporização de fase móvel mais volátil) e a vazão (importante quando a
análise é realizada com Gradiente de Polaridade, em cujo caso há necessidade de uma
segunda bomba; ver mais adiante).
d) Válvula de injeção
A amostra é sempre introduzida com auxílio de uma válvula,

porquanto a pressão de trabalho nunca é menor que 50 atmosferas (Apêndice 2).
e) Coluna
As colunas empregadas em CL são retas, uma vez que seu comprimento

raramente ultrapassa 30 cm, ocupando portanto muito pouco espaço no equipamento.
f) Detetor
Os detetores utilizados em CL serão descritos na próxima seção.
g) Sistema de aquisição de dados.
Os sistemas de aquisição de dados empregados em CL são exatamente os

mesmos empregados em CG, ou seja, registradores, integradores ou microcomputadores
(Apêndice 3).
Gradiente de Polaridade
Quando o CL dispõe de apenas uma bomba, é evidente que a fase

móvel tem uma composição constante, do início ao fim da análise. Nessa situação, a
polaridade da mesma também é constante. Diz-se então que o processo é isocrático.
Quando dispõe-se de duas bombas (ou mais), é possível variar a composição da fase
móvel, colocando-se em cada reservatório um líquido de polaridade diferente. O
microprocessador altera a vazão de cada linha de líquido, de modo que a partir do
ponto de confluência a vazão seja constante. Nesse caso, diz-se que o processo ocorre
com gradiente de polaridade. Substituindo-se temperatura por polaridade, pode-se
utilizar os Cromatogramas 4.3 e 4.4 (p. 20) como ilustração de processos isocráticos
com polaridades diferentes e o Cromatograma 4.5 como ilustração de um processo
com gradiente de polaridade.
4.3. Detetores
4.3.1. Generalidades
Os detetores mais empregados são do tipo diferencial. A sua resposta

(R), dada pelas áreas relativas dos picos, é proporcional à concentração de cada
componente (detetores de condutividade térmica) ou à velocidade de fluxo de massa do
componente (detetores de ionização):
dm
R = K1.C R = K2.
dt
Dentre os detetores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso,
os seguintes: detetor de condutividade térmica (DCT), detetor de ionização de chama (DIC) e
detetor de índice de refração (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicação.
A escolha do detetor é importante e depende do material a ser analisado.

As principais características dos detetores, que devem ser consideradas quando da seleção
do detetor mais apropriado, são as seguintes (ver Apêndice 1, p 53):
- Sensibilidade - Faixa de linearidade dinâmica - Especificidade / Seletividade

- Nível de ruído - Custo/vida útil - Condutividade térmica (para DCT)
- Resposta - Universalidade
4.3.2. Detetores empregados em Cromatografia a Gás
a) Detetor de Condutividade Térmica (DCT)
O sistema de detecção por diferença de condutividade térmica consiste

de dois filamentos (célula para amostra e célula de referência), os quais fazem parte de
uma ponte de Wheatstone (Figuras 4.4a e 4.4b). Faz-se passar corrente pelos filamentos e
estes perdem calor para o gás de arraste. No momento em que a amostra atingir a célula
correspondente, o filamento perderá calor para a solução (gás de arraste + amostra).
Como a solução possui condutividade diferente, a temperatura do filamento é alterada, o
mesmo ocorrendo com a sua resistência elétrica. Essa variação na resistência é medida
pela ponte. Note-se que quanto maior for a concentração do material analisado, maior será
a variação na corrente e portanto maior será o sinal (R = K.C).
A sensibilidade de um detetor de condutividade térmica pode ser avaliada pela

equação:
(  g -  s)
S = KI2 . . (Tf - T b ) (eq. 8)
g
onde:
S = sensibilidade (mV.cm 3/mg)  = condutividade térmica do gás de arraste

K = constante da célula  = condutividade térmica da substância
I = intensidade de corrente
R = resistência do filamento Tf = temperatura do filamento

Tb = temperatura do bloco
IMPORTANTE ! Se a câmara do detetor contiver ar atmosférico no momento em que o

circuito for energizado ocorrerá queima do filamento. Portanto, deve-se primeiro fazer
circular o gás de arraste.
Figura 4.4.a - Bloco do Detetor de Condutividade Térmica.
b) Detetor de Ionização de Chama (DIC)
A figura 4.5 representa o circuito eletrônico de um DIC. R v é uma

resistência variável, cujo valor depende do número de partículas entre os eletrodos. O
efluente da coluna, ao passar entre os eletrodos, é ionizado. Nos DIC, a fonte de ionização
é a chama resultante da combustão de hidrogênio com ar (gases auxiliares). A corrente
contínua gerada pela fonte (fonte CC, Fig 4.5.b) é transportada do polarizador para o
coletor (Fig 4.5.a) por impurezas existentes na fase móvel ou por partículas de fase
estacionária líquida arrastada pela fase móvel, por exemplo. No amplificador existe outra
fonte de corrente, sendo esta variável e de sentido contrário, permitindo assim zerar a
corrente resultante no circuito. Quando um componente da amostra atinge o detetor, caso
possua átomos de carbono e átomos de hidrogênio, entrará em combustão, sendo
ionizado. Com a ionização, aumenta a corrente saída do coletor, o que irá gerar uma
tensão (V), a qual é ampliada pelo amplificador eletrométrico e enviada ao
registrador/integrador. Evidentemente, a sensibilidade do detetor dependerá da facilidade
relativa de ionização de cada componente da amostra.
Figura 4.4b- Diagrama Eletrônico do DCT
Fig. 4.5.a- Estrutura física de um DIC
c) Detetor de Captura Eletrônica (DCE)
Embora possuindo circuito semelhante ao de um DIC, o DCE, ao

contrário daquele, mede a queda de corrente quando da passagem de amostra pelos
eletrodos (Rv). Uma fonte de 3H-1 ou de 63Ni ioniza as moléculas do gás de arraste (N 2),
liberando os elétrons responsáveis pela corrente (corrente de fundo). Se uma substância
capaz de absorver esses elétrons passar pelo detetor, haverá uma queda na corrente,
resultando num sinal que também será amplificado e enviado ao registrador.
Aqui, a sensibilidade do detetor depende da capacidade de absorção de

elétrons por parte dos diversos componentes da amostra.
Fig. 4.5.b- Circuito eletrônico de um DIC / DCE
d) Propriedades dos detetores
A Tabela 4.1 é auto-explicativa e sumariza as principais propriedades dos

detetores, auxiliando no trabalho de seleção do detetor mais apropriado para uma análise. O
Apêndice 5 descreve outros detetores de uso menos extensivo, como o DNP.
Tabela 4.1 - Propriedades dos principais tipos de detetores empregados em CFG.
PROPRIEDADES DCT DIC DNP DCE

Limite de detecção 1 ppm 100 ppb 0,1 ppb 0,1 ppb
Faixa de linearidade 104 107 104 102
Vazão da fase móvel 3
1-10 mL/min 1-200 mL/min 10-100 mL/min 10-100 mL/min
Quant. Típica amostra 1 - 40 L 0,05 - 5 L 1 - 5 L 1 - 5 L
Comp. Detectados todos orgânicos nitrogenados e halogenados
fosforados
Áreas de aplicação uso geral orgânicos resíduos de resíduos de
pesticidas pesticidas
4.3.3. Detetores empregados em CLAD
Os detetores mais empregados em Cromatografia a Líquido de Alto

Desempenho (CLAD), embora existam outros tipos de detetores são:
a) Detetores de índice de refração
À semelhança do detetor de condutividade térmica, o detetor de índice

de refração é o mais antigo, menos sensível e o único universal, dentre os detetores
empregados em CLAD. Baseando-se na diferença de índice de refração entre a fase móvel

e cada componente da amostra, conhecem-se dois tipos de detetores IR:
 Os detetores tipo deflexão utilizam como elemento ativo um diodo capaz de

gerar uma corrente contínua cuja intensidade é proporcional ao ângulo de
incidência da luz que atravessa a célula (Figura 4.6). Ao passar pela célula
analítica uma substância com índice de refração diferente daquele da fase móvel,
haverá uma alteração no ângulo de incidência, resultando numa variação na
intensidade de corrente, que é proporcional à concentração dessa substância na
célula e consequentemente também proporcional à sua concentração na amostra.
Figura 4.6 - Detetor de Índice de Refração tipo deflexão.
 Os detetores tipo Fresnel baseiam-se no fato da luz incidente sobre o sistema

mostrado na Fig. 4.7 ser fracionada em dois feixes: uma parte da luz é refletida e a
outra parte é refratada. De acordo com a Lei de Fresnel, a relação entre essas duas
frações é função do índice de refração. Assim, ao passar uma substância (transportada
pela fase móvel) pela célula, altera-se o índice de refração e portanto o percentual de
luz refratada. Utilizando-se como foto-detetor um diodo sensível à intensidade de luz,
a corrente gerada por este será alterada de um modo proporcional à concentração
dessa substância na amostra.
b) Detetores de UV-VIS
Os detetores de ultravioleta-visível (UV-VIS) baseiam-se na Lei de

Lambert-Beer, que estabelece uma relação linear entre Absorbância e Concentração:
A=.l.c
onde l é o caminho ótico (distância percorrida pela luz dentro da solução; espessura da
célula). A constante de proporcionalidade  denomina-se absortividade molar. A
absorbância, por sua vez, é proporcional à transmitância, fração de luz transmitida.
Quando o conteúdo da célula (Fig. 4.8) é transparente à radiação

empregada (UV ou VIS), a transmitância é 100 % e evidentemente a absorbância é
ZERO.
Entretanto, quando chega à célula uma substância que absorva essa luz,
o sistema de detecção mede a diferença em intensidade, gerando o cromatograma
correspondente.
Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de

radiação uma lâmpada de mercúrio, cujo comprimento de onda principal (90 % do total
da radiação) mede 254 nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento
de onda fixo (e único). A Fig. 4.8 representa um diagrama esquemático desse tipo de
instrumento. Como a região útil da radiação UV varia de 190 a 300 nm, é de se esperar
que mesmos os compostos que absorvem luz UV não venham a ser detectados em um
detetor do tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir
uma varredura em toda a região UV, é primordial, evidentemente, que a fonte de radiação
(lâmpada de deutério) possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de
interesse (fonte não monocromática). Desse modo, o instrumento (UV variável) necessita
de um dispositivo que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a
irradiar a amostra com uma luz monocromática. Esse dispositivo chama-se
“monocromador”. Para se operar na faixa visível (400-750 nm), emprega-se uma lâmpada
de tungstênio.
Figura 4.7 - Detetor de Índice de Refração tipo Fresnel.

Figura 4.8 - Detetor de Ultravioleta fixo
6 - ANÁLISE QUALITATIVA
O tempo de retenção (Tr) é uma característica físico-química e como tal

permite que se faça análise qualitativa, desde que se disponha de um padrão. Na falta do
padrão, é necessário coletar cada componente isoladamente e identificá-lo por outros
métodos analíticos; espectrometria, por exemplo. Atualmente, são comercializados
cromatógrafos cujo detetor é um espectrômetro de massas.
Quando uma amostra é submetida à análise, é preciso fornecer ao

analista alguns dados a respeito da mesma:
- Origem (de síntese, natural, etc ?).

- Componentes prováveis (espécie, número).
- Composição quantitativa provável.
- Faixa de ponto de ebulição (amostra líquida).
- Outros dados relacionados com as variáveis do processo.
Quanto maior for o número de informações, mais rapidamente o analista

encontrará as condições ideais de análise.
Como existe apenas uma vazão ideal para cada coluna, resta ao analista
procurar a coluna e a temperatura (ou programação de temperatura) ideais.
Existem outros modos de efetuar a identificação, os quais serão

estudados mais adiante (Capítulo 8).
6 - ANÁLISE QUANTITATIVA
6.1. Introdução
Para se determinar a composição de uma mistura (Análise Quantitativa)

é necessário medir as áreas relativas dos picos de todos os componentes. Entretanto, nem
sempre o número de picos é igual ao número de componentes, pois além da probabilidade
de ocorrer superposição, alguns componentes poderão não ser detectados, o tempo de
análise poderá ser inferior ao tempo de retenção de um componente menos volátil, etc.
O uso de uma referência (padrão) permite, contudo, determinar a

percentagem de um dado componente, mesmo que não apareçam os picos dos outros
componentes.
Antes de se efetuar o cálculo da composição, entretanto, é preciso fazer

as correções das áreas, pois a relação das áreas de dois componentes quase sempre é
diferente da relação entre as suas massas (composição em massa). Isto porque a
sensibilidade (Resposta) de um detetor a duas diferentes substâncias normalmente é
diferente.
Analisando a eq. 8 (p. 23), observamos que além de outros fatores, a

sensibilidade dos detetores de condutividade térmica depende da diferença g - s Como
s varia de substância para substância, podemos dizer que uma mistura binária qualquer
contendo 50% de cada componente muito provavelmente terá uma relação de áreas
diferente da unidade.
Com os detetores de ionização de chama (e também com os de captura

de elétrons) existe esse mesmo problema, pois a facilidade de se ionizar (ou de capturar
elétrons) varia de substância para substância. Aliás, essa afirmação vale para qualquer
outro tipo de detetor, inclusive aqueles empregados em Cromatografia a Líquido.
Assim sendo, vale a pena repetir, é necessário primeiro determinar os

fatores de resposta para as áreas e só depois efetuar o cálculo da composição.
6.2. Medição de Área
A área de um pico pode ser medida por vários métodos, a saber:
i - Com auxílio de um planímetro.
ii - Por pesagem (recorta-se cada pico e pesa-se em balança analítica).

iii - Com auxílio de um integrador:
a) de disco (eletromecânico) ou
b) eletrônico
iv - Determinação gráfica:
a) S = h.L ou b) S = h.L’,
onde h é a altura do pico, medida desde a linha de base até o ápice do mesmo,
L é a largura na base (distância entre os pontos em que a linha de base é
interceptada pelas tangentes traçadas nos dois ramos da curva) e L’ é a largura
do pico na metade de sua altura, como se vê na Figura 6.1. Essas grandezas
devem ser medidas em milímetro.
O planímetro é um dispositivo mecânico, articulado. À medida

em que se percorre o perímetro do pico, um ponteiro percorre uma escala. A
leitura ao final do perímetro é a área do pico. O traçado do integrador de disco
é mostrado abaixo do pico, na fig. 6.1. O uso de um integrador permite
determinar a área com um erro da ordem de 0,1%. Entretanto, os erros dos
outros métodos, em torno de 0,5 - 1%, é bastante aceitável para a maioria das
finalidades. Dado o alto custo dos integradores, principalmente os eletrônicos,
muitos Laboratórios ainda utilizam o método gráfico. Atualmente, encontram-se
no mercado várias versões de softwares (com a respectiva interface), que
substituem com muitas vantagens (inclusive de custo) os integradores
eletrônicos.
A utilização do planímetro exige habilidade do operador, de

modo que o erro poderá ser bem maior que 1% (a precisão normalmente é
baixa). O método de pesagem, por sua vez, é pouco empregado em virtude de
exigir a destruição do cromatograma. Dentre os métodos gráficos ( a e b), o da
meia altura (b) é recomendado para os picos cuja linha de base não está bem
definida e também por causa da imprecisão no traçado das tangentes. Entretanto,
a medição de uma largura L’ (da ordem de 5 mm) muitas vezes acarreta um erro
da mesma magnitude do erro da medida de L, de modo que os dois processos,
em geral, podem ser considerados igualmente precisos. A experiência indicará,
em cada ocasião, qual método deverá ser empregado.
Se os picos não estão completamente separados, ao ponto de não se

poder medir a largura L’, utiliza-se o método “a” (S = h.L), medindo-se L do
seguinte modo (Fig. 6.2):
1) Traçar, como na Fig. 6.1, a tangente do pico; mas só as mostradas na fig. 6.2;
2) A partir do ponto A (Fig. 6.2), traçar uma vertical até cortar a linha de base;
3) L1 e L2 são as bases dos dois picos da Fig. 6.2 e as suas áreas são h 1L1 e h2L2.
Fig. 6.1 - Método gráfico para determinação de áreas relativas

em cromatografia.
OBS.: Essa técnica pode ser empregada também nos casos em que A fica abaixo de L’ e é
denominada CORREÇÃO VERTICAL. Se o primeiro pico for muito menor que o segundo (Fig. 6.3),
o procedimento é exatamente igual. Por outro lado, na situação inversa, a medição da área do segundo
pico é feita como mostrado na Fig. 6.4. Essa segunda técnica chama-se CORREÇÃO TANGENCIAL.
Se houver um outro pico sobre a cauda do primeiro e o ponto A estiver acima da tangente, procede-se a
uma correção vertical entre os dois pequenos.
Figura 6.2 - Correção vertical Figura 6.3 - Correção vertical Fig. 6.4 - Correção horizontal
6.3. Métodos de Cálculo
Os métodos de cálculo descritos a seguir já incluem a correção da área.
a) Normalização de área
Usa-se um dos componentes da mistura como referência. Seja uma

mistura das substâncias S1, S2, ... , Sn e Sr, onde Sr é a referência.
A seguinte relação é válida para um cromatograma dessa mistura:
mr mi mi
= A ci = . Ar (eq. 9)
Ar Aci mr
onde Aci é a área corrigida de uma substância qualquer i. Por outro lado, podemos dizer que:
A ci  A i . Fi (eq. 10)
onde Fi é o fator de correção. Igualando-se os segundos membros das equações 9 e 10,

fica:
mi mi Ar
Ai.Fi = . Ar ou Fi = . (eq. 11)
mr mr Ai
OBS.: Para uma mesma solução, m i / mr = Ci / Cr, logo Fi = Ci / Cr . Ar /Ai (eq. 11’)
aplicando-se a eq. 11 a uma amostra de concentração conhecida (mistura padrão), encontra-se
Fi. Então, a partir da eq. 10 (aplicada à amostra de concentração desconhecida), é calculada a
área corrigida Aci. Finalmente, a composição é dada pela eq. 12:
Aci
Ci = . 100 (eq. 12)
Aci
Quando todos os componentes de uma mistura pertencem a uma
mesma função química, os fatores de correção (também denominados fatores de
conversão - pois convertem a área em concentração ou massa - ou fatores de
resposta) são praticamente iguais. Assim, admitindo-se que F 1 = F2 = ... = F n = F,
pode-se fazer F = 1 e a equação 12 simplifica-se:
Ai
Ci = . 100 (eq. 12’)
Ai
O caso geral é conhecido como Normalização de Área com Fator de
Resposta (Norm %) e o caso particular (eq. 12’) como Normalização de Área sem Fator
de Resposta, ou simplesmente Área %.
b) Padronização Interna
Para a determinação da composição de uma amostra pelo método da

Normalização de Área, é necessário que todos os seus diversos componentes sejam
detectados (a eq. 12 exige que sejam calculadas todas as áreas: Aci). Entretanto, não é
fácil ter certeza absoluta de que todos os componentes foram realmente detectados. Além
disso, se apenas um único componente interessa ao analista, a sua determinação a partir

de uma amostra com muitos componentes traria dois outros agravantes:
i) Todo trabalho de medição e cálculo dos picos de interesse.
ii) A probabilidade maior de um outro componente ter o mesmo tempo de

retenção do componente de interesse.
Para resolver o problema (ii) o analista preferiria usar um detetor que se

possível só detectasse o componente de interesse. Mas, como resolver o problema inicial ?
A resposta a essas questões está na adição à amostra de uma substância nova, com as
seguintes características:
- Solúvel na amostra.
- Detectável.
- Possuir Tr diferente de qualquer componente detectável.
- Não reagir com a amostra.
Essa substância é denominada de padrão interno.
Seja uma solução padrão contendo todas as substâncias de interesse e o

padrão interno (Pi), cujas concentrações e áreas sejam respectivamente:
Ai e Ci - um componente qualquer de interesse.

APi e CPi - o padrão interno.
As relações Ci /Ai = Ri (eq. 13) e CPi /APi = RPi (eq. 14) dão a resposta
do detetor para qualquer componente, inclusive P i. Numa mesma solução, a relação R i /
RPi é constante e igual a Fi (comparar com a eq. 11).
Ci Api
. = Fi (eq. 15)
Ai Cpi
A adição do padrão interno a uma amostra de concentração
desconhecida, resulta em uma solução para a qual são válidas as relações:
Ci' C'Pi
= Ri (eq. 16) e = RPi (eq. 17),
Ai' A 'Pi
equivalentes às equações 13 e 14. Logo,

C'Pi C'i
. F i = Ri = (eq. 18)
A 'Pi A 'i
A 'i
Assim, C'i = '
. C'Pi . Fi (eq. 19)
A Pi
OBS.: A precisão desse método, bem como a do método “a”, independe do erro de
injeção, mas a precisão de ambos depende do erro na preparação dos padrões.
c) Padronização externa
Mais prático que o método anterior e não necessitando também da

detecção de todos os componentes da amostra, o método do padrão externo, entretanto,
depende do volume injetado, de modo que sua precisão é influenciada pelo erro de
injeção.
Considerem-se as equações 13 e 16. Numa solução de composição

conhecida (solução padrão) e numa amostra desconhecida, têm-se respectivamente:
Ci C'i
= Ri e = Ri
Ai A 'i
Igualando-se os dois primeiros membros, tem-se, tirando o valor de C 'i :
Ci
C'i = A 'i . (eq. 20)
Ai
Como Ri é constante, uma vez determinado o seu valor, a partir da solução
padrão e para cada componente de interesse, o analista terá apenas que aplicar a eq. 21:
C'i = A 'i . Ri (eq. 21)
OBS.:
1 - Os valores de R i, obtidos num determinado laboratório, podem ser tabelados,
ou fornecidos a um computador (integrador/processador), para agilização das análises.
Devido a alterações na sensibilidade do detetor (variação na relação de fluxo dos gases
auxiliares no DIC, corrosão, decaimento natural na fonte radioativa do DCE, etc.), os
valores de Fi (ou de Ri) devem ser recalculados periodicamente. O analista deverá
determinar experimentalmente a periodicidade.
2 - O método do padrão externo (regra de três simples) é uma simplificação do
método do padrão interno (regra de três composta), onde se faz V ip = Via , onde Vip é o
volume injetado de solução padrão e V ia é o volume injetado da amostra. Portanto, a

precisão deste método de cálculo depende da perícia do analista na medição do volume a
ser injetado.
d) Técnica para fechar uma análise
Muitas vezes é necessário fazer duas injeções. Isso acontece quando uma
única coluna não consegue separar todos os componentes e/ou um único detetor não
detecta todas as substâncias.
Considere-se o método de Normalização de Área e uma situação em que

um dos componentes aparece isolado nos dois cromatogramas. Como nas duas injeções o
volume não foi exatamente o mesmo, haveria um erro grosseiro se as diversas áreas dos
dois cromatogramas fossem somadas diretamente.
No exemplo a seguir, a amostra possui cinco componentes, sendo que os

componentes (1), (2) e (4) são quantificados no cromatograma A. Observa-se que (2)
aparece nos dois cromatogramas. Teoricamente as suas áreas, nos dois cromatogramas
(Aa2 e Ab2) seriam iguais. Na prática, geralmente encontra-se Aa 2  A b 2 . Qualquer uma
das áreas é correta, de modo que A ou B pode ser tomada como referência,
indiferentemente. Tomando o cromatograma A como referência, tem-se:
A a2
= K (para corrigir as áreas no cromatograma B)
A b2
A a1. F 1 + A a 2 . F 2 + A b 3. K. F 3 + A a 4 . F 4 + A b 5. F 5. K = A ci ,
onde Aci é qualquer termo do 1 o membro. A concentração de qualquer componente é

calculada a partir da eq. 12.
6.4. Seleção do melhor método de cálculo
Para se decidir sobre o melhor método de cálculo para uma dada

amostra, basta responder às questões apresentadas no Esquema 6.1.
Esquema 6.1 - Critérios para seleção do melhor método de cálculo.

7 - OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO ANALÍTICO
7.1. Parâmetros analíticos
Conforme foi visto ao longo dos capítulos anteriores, muitos fatores

influem no processo cromatográfico. Essa influência não é aleatória, podendo portanto ser
controlada pelo operador, com o objetivo de otimizar o processo de separação.
A Tabela 7.1 mostra a importância do correto dimensionamento de uma

coluna cromatográfica, enquanto que a Tabela 7.2 mostra a influência do volume injetado
sobre L (largura do pico na base; ver Fig. 2.14, p. 13), n e H (ver Fig. 2.13, p. 13). O
Gráfico 7.1 mostra a relação entre C e n max () e entre C e Hmin(), onde C é a
concentração da fase estacionária. O Gráfico 7.2 mostra como esses parâmetros (n e H)
variam com o comprimento da coluna ( l).
A temperatura (T) modifica o tempo de retenção (t r). A variação do t r

com T não é linear. A relação
tr / T
depende do composto em estudo e da faixa de temperatura empregada. A Tabela 7.3, o

Gráfico 7.3 e os Cromatogramas 7.1.a,b e 7.2.a,b,c evidenciam essas afirmações.
Finalmente, a Tabela 7.4 mostra que n max, Hmin e Fo (vazão ideal) dependem inclusive da
granulometria do suporte.
Tabela 7.1 - Efeito do comprimento da coluna e da concentração da FE sobre a eficiência.
Coluna * Vazão Ideal

l (m) C (%) m (g) Fo n x 10-3 H (mm)
(mL/min)
1 10 0,13 30+5 0,8 1,25
2 10 0,24 20+5 1,4 1,43
4 10 0,57 28+5 4,3 0,93
9 10 1,24 21+5 8,0 1,13
16 10 2,15 38+5 16,0 1,00
4 1 0,05 18+5 1,9 2,11
4 2 0,12 26+5 2,0 2,00
4 5 0,26 34+5 2,7 1,48
4 20 1,18 37+5 3,3 1,21
(*) a) Fase estacionária: Apiezon L; DE = 1/8”; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh
b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna.
Tabela 7.2 - Efeito do volume injetado sobre L, n e H.
Volume (L) L (mm) n H (mm)

0,5 7 15.800 1,01
1,0 9 9760 1,64
1,5 11 6800 2,35
2,0 12 5270 3,03
Tabela 7.3 - Efeito da temperatura sobre o tempo de retenção
Composto 70oC 100oC 130oC 160oC

n-pentano 1,60 1,17 0,85 0,68
n-hexano 3,29 1,93 1,23 0,77
n-heptano 7,38 3,65 1,92 1,35
n-octano 18,88 7,08 3,25 2,00
A partir dessas informações é possível estabelecer, por exemplo, para

uma coluna com 1/8” de diâmetro externo (coluna analítica), que:
 Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, nmax é função linear de l.
 O valor de nmax aumenta, quando diminui a granulometria do suporte.
 O valor de nmax varia com C, sendo máximo quando C = 12 %, para suporte com
faixa de granulometria de 60-80 mesh (  malhas por polegada linear; equivale a um
diâmetro de partícula de 175-230 mm).
 A faixa de vazão ideal não varia com a temperatura.
 O tempo de retenção diminui de maneira não linear com o aumento da temperatura; a
relação tr / T varia com a natureza do composto e o intervalo de temperatura
considerado.
7.2. Projetando um método analítico
Para se projetar um novo método analítico por cromatografia, são

necessárias várias avaliações, relacionadas a seguir:
 Seleção do tipo de cromatógrafo (a gás ou a líquido);

 Seleção do detetor, em função dos compostos a serem analisados e de suas concentrações;
 Parâmetros de funcionamento do detetor;
 Seleção da coluna:
 natureza da Fase Estacionária (e sua granulometria, caso seja sólida);

 dimensões da coluna (comprimento e diâmetro);
 concentração da Fase Estacionária (FE), natureza e granulometria do suporte, no
caso de FE líquida;
 Seleção da temperatura (ou programação de temperatura) para a coluna, no caso de CFG;

 Seleção do Gradiente de Polaridade, se necessário, no caso de CFL (HPLC);
 Determinação do Limite de Detecção (LD) e da Faixa de Linearidade Dinâmica (FLD);
 Determinação dos Fatores de Resposta;
 Determinação das demais condições de análise: volume injetado, técnica de injeção,
atenuação (se não dispuser de sistema de integração), temperatura do vaporizador
(em CFG) e do detetor e vazão da fase móvel (ou gradiente);
 Concentração dos componentes na solução padrão, natureza do solvente empregado e
técnicas de amostragem e de preparação da amostra e da solução padrão;
 Método de cálculo utilizado;
 Número mínimo de determinações em paralelo e erro máximo (reprodutibilidade);
 Avaliação do erro estatístico global, associado às diversas operações (preparação de
soluções, técnica de amostragem, técnica de injeção e medição de área); expressão do
resultado final;
Observações:
a) na seleção do detetor, verificar se o material a ser analisado é detectável por ele e

se o seu Limite de Detecção é compatível com a faixa de concentração de
interesse (ver, por exemplo, a Tabela 4.1 na p. 26);
b) na avaliação dos erros estatísticos, considerar todas as operações envolvidas, tais como
pesagem, medição de volume, diluição, técnicas de amostragem e de injeção, etc;
c) para cálculos estatísticos, utilizar o Apêndice 6 (ver Seção 7.3).;
d) em relação aos diversos métodos de cálculo, lembrar que:

Método prep. prep. injeção comp. Não altura(1)

Padrão Amostra detectados
Área % Não Não Não Sim Sim
Norm % Sim Não Não Sim Sim
P. Ext. Sim Não Sim Não Não(2)
P. Int. Sim Sim Não Não Não(2)
(1) como medida da “área”; (2) dentro de uma faixa mais ou menos estreita de concentração.
Tabela 7.4 – Efeito da granulometria do suporte sobre a eficiência
Malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min)

60-80 4300 0,93 20
80-100 4600 0,87 20
100-120 5700 0,70 24
D.E. = 1/8”; l = 4 m; C = 10 %
7.3. Validação de um método analítico
7.3.1. Objetivo
A identificação por Cromatografia (a gás ou a líquido) é feita por

comparação dos tempos de retenção, para uma dada substância, entre uma solução
padrão e a amostra. Entretanto, é sabido que num determinado sistema
cromatográfico (Fase Móvel, Fase Estacionária e Detetor), mesmo empregando-se
como fluxo da Fase Móvel aquele encontrado por ser o ideal (de acordo com os
experimentos de van Deemter), não é nula a probabilidade de outro componente da
amostra apresentar o mesmo tempo de retenção que o da substância de interesse.
Validar um método analítico consiste em garantir que nas condições analíticas, a
substância-problema e apenas ela apresenta aquele tempo de retenção. Evidentemente
um método validado deve ser operacionalizado através de um manual (Norma), o qual
determina condições padronizadas que garantam a sua
repetibilidade/reprodutibilidade. Deve ser enfatizado que um determinado método
analítico validado para um determinado tipo de amostra não é necessariamente válido
para outro tipo de amostra (ex.: dosagem de um princípio ativo existente em um
determinado medicamento versus a mesma determinação nas vísceras do cadáver de

uma suposta vítima de super-dosagem), posto que outro tipo de amostra pode conter
outras substâncias também passíveis de ser detectadas no mesmo tempo de retenção
do analito e que não tenham sido incluídas na pesquisa de validação.
7.3.2. Conceitos
Com o objetivo de garantir uma correta compreensão deste texto,

são apresentados a seguir os termos técnicos aqui empregados, com suas
respectivas definições.
Nome notação descrição

Analito Substância-problema.
Amostra Qualquer material, independentemente de
sua origem, que contenha o analito.
Padrão O analito, comercializado com alta pureza.
United States USP Farmacopéia Americana. Fonte de consulta.
Pharmacopea
Concentração c Concentração do analito (ou do padrão).
Solução Estoque SE Solução do padrão a alta concentração
(pode ser guardada por alguns meses,
dependendo da natureza da substância).
Solução Intermediária SI Solução do padrão, necessária para se
chegar à Solução de Trabalho.
Solução de Trabalho ST Solução do padrão com concentração
semelhante ao que se espera da amostra.
Faixa de Linearidade FL Intervalo de concentração em que existe
relação linear com a área do pico.
Curva de Calibração Curva construída com os dados da Faixa de
Trabalho.
Coeficiente de r Parâmetro que mede a precisão com que a
Correlação Curva de Calibração relaciona as áreas com
as respectivas concentrações. É usado para
avaliar o fim da região linear na construção da
FL.
Faixa de Trabalho FT Intervalo contido na FL, compreendendo
as concentrações usuais da amostra.
Limite de Detecção do LDE Concentração mínima detectável do analito
Equipamento no extrato injetado.
Limite de Detecção da LDA Concentração mínima detectável do analito na
Amostra amostra.
Limite Efetivo LE Concentração mínima do analito que
corresponde a um erro máximo aceitável.

Seletividade  Capacidade de separar a substância-problema
dos demais componentes da amostra.
Resolução Rs Mede a seletividade.
Precisão Ava l i a a r ep et i bi l i d a d e ou a
reprodutibilidade de um método analítico,
por medida da 1a ou da 2a estimativa do
desvio padrão (Apêndice 6).
Exatidão Grau de fidelidade com que o resultado
exprime o valor real da concentração do
analito. Avaliado com auxílio do teste t 1
(de Student), por comparação com uma
solução padrão (Apêndice 6).
Recuperação Nos casos em que se faz uma extração, é
necessário determinar o percentual de
extração e sua repetibilidade. Recomenda-
se que a solução padrão seja submetida à
mesma operação.
Repetibilidade Mede a dispersão dos resultados obtidos por
repetição da análise, num mesmo
Laboratório, com o mesmo equipamento e
mesmo analista. Ver Precisão.
Reprodutibilidade Mede a dispersão dos resultados obtidos por
repetição da análise, em diferentes
Laboratórios, diferentes equipamentos ou
diferentes analistas. Usa o teste F (Apêndice
6).
Consistência Mede a influência sobre a repetibilidade,
das diversas operações constantes do
método.
Robustez Mede a influência sobre a Reprodutibilidade,
das diversas operações constantes do método.
7.3.3. Procedimento
a) Seletividade / Identificação
A principal fase do trabalho é aquela em que é testada a confiabilidade

da identificação. Isso inclui a determinação do tempo de retenção de toda e qualquer
substância que possa eventualmente existir na amostra, quais sejam:
 impurezas de síntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poderá ser bastante
penoso);
 impurezas de degradação (essas informações podem ser obtidas de estudos shelf-

life);
 excipientes, conservantes, aditivos e outros princípios ativos constantes da
formulação (no caso de associações);
Deve ser lembrado que a identificação pura e simples por

cromatografia (método não validado) não tem valor científico. Assim, o ideal, o
recomendado mesmo, é associar à técnica cromatográfica, a técnica de Espectrometria
de Massas. Essa associação pode ser manual, através da separação física, por coleta
na saída da coluna, seguida da obtenção do espectro de massas. A identificação
pode ser ainda complementada com auxílio de outra técnica analítica, como a
Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear, Espectrofotometria no
Ultravioleta-Visível ou a Espectrofotometria no Infravermelho. Atualmente existem
cromatógrafos (CFG ou HPLC) acoplados a um espectrômetro de massas, o qual
substitui o detetor tradicional do cromatógrafo.
Embora os exemplos aqui apresentados sejam típicos da indústria

farmacêutica, os diversos procedimentos são igualmente aplicáveis a qualquer outro tipo
de amostra. De um modo geral, produtos de síntese (de uso farmacêutico ou não) podem
ter seu método analítico validado sem auxílio da espectrometria (embora seu emprego dê
maior credibilidade à validação). Por outro lado, qualquer outro material (inclusive de
uso farmacêutico) exige a associação de métodos espectrométricos.
Já se sabe que a eficiência (n) de uma coluna é diretamente proporcional

ao tempo de retenção. Portanto, quanto maior for o tempo de eluição, maior será a sua
eficiência. Assim, a seletividade pode ser medida como a razão dos tempos de retenção:
 = tr1/tr2
Essa relação é também denominada retenção relativa (p. 12) ou ainda fator de separação
e demonstra-se que é equivalente às relações dos coeficientes de partição:
 = kp1/kp2
Entretanto, esse critério é algo insatisfatório, posto que colunas com diferentes eficiências
podem apresentar mesmos fatores de separação, conforme pode ser visto na Figura
7.1.a,b. Porisso, em vez da seletividade, emprega-se a resolução (Rs), como medida
efetiva da capacidade de separação:
Rs = 2(tr2 – tr1)/(L1 + L2)
ou seja, a resolução é igual à diferença entre os tempos de retenção dividida pela média
da larguras na base (Figura 2.14, p. 13).
É óbvio que a resolução diminui com o alargamento do pico e

evidentemente também diminui se a cauda, resultante de uma interação excessiva com a
fase estacionária, é bastante pronunciada (Figura 7.2). Essa deformação do pico deve ser
considerada quando da seleção da coluna. Chama-se fator de deformação ou fator de
assimetria (TF, do inglês tailing factor) a relação
BC
TF =
AB
onde a distância BD é igual a 10 % da altura do pico ( DE ). O TF máximo admissível

é 3.
Figura 7.2 – Pico com cauda

(deformação)
Figura 7.1 – Resolução a) baixa; b) alta
b) Detalhamento da Metodologia
A metodologia analítica inclui todos os parâmetros explicitados na

Seção 7.2 (página 41).
c) Avaliação estatística
Para realização dos testes estatísticos, sugere-se que qualquer

operação (preparação da solução padrão, tomada de alíquotas, etc) seja realizada
em triplicata (ou mais) e que cada solução obtida seja injetada pelo menos cinco
vezes. Nesses casos, deve ser empregada a 2 a estimativa do desvio padrão (s R ;
Apêndice 6). A 1 a estimativa (s) só deve ser empregada em conjuntos de dados
com mais de 10 itens.
d) Exemplo
A seguir, é apresentado um exemplo, para ilustrar toda a operação. Para

este exemplo, foi selecionado o produto aspirina. A aspirina é comercializada em várias
formas, sendo selecionado como amostra o comprimido.
A aspirina (ácido acetilsalicílico) é produzida industrialmente a partir do

ácido salicílico:
Desse modo, é de se esperar que o precursor (AS) seja um contaminante

comum no produto (AAS). Consequentemente, o AS é uma das substâncias que devem ter
seu tempo de retenção medido, para verificar se coincide ou não com o do AAS.
Uma vez completada a etapa de identificação (vale repetir: confirmação

de que nada que eventualmente possa estar presente na amostra apresente o mesmo tempo
de retenção do AAS), parte-se para as avaliações estatísticas.
i. Condições analíticas :
 Cromatógrafo a líquido modelo CG 480E, com detetor de ultravioleta CG 437B.

 Comprimento de onda: 254 nm.
 Coluna: RP-18, 250 mm X 4,6 mm, 10 m; temperatura ambiente.
 Fase Móvel: H2O:Metanol:Ácido Acético (46:52,5:1,5); 1,5 mL/min (isocrático).
Preparação das soluções padrão (para AAS e AS):
A solução estoque foi de 500 mg/100 mL. As demais soluções foram de 200, 100, 20, 10
e 5 mg/100 mL.
Preparação da amostra:
A partir de 5 comprimidos pulverizados em almofariz, foi tomada uma alíquota pesando

55 mg (10% do peso médio de um comprimido). O material foi dissolvido em 10 mL da
fase móvel, com auxílio de ultra-som e em seguida filtrado (0,46 m).
Injeção da amostra: válvula Rheodyne, com loop de 20 L.
ii. Faixa de Linearidade e Limite de Detecção
As soluções padrão foram injetadas em triplicata, sendo que a mais diluída foi
injetada dez vezes. A partir da médias das áreas obtidas, foram construídas as respectivas
Faixas de Linearidade (Gráficos 7.4 e 7.5), onde evidencia-se que as massas injetadas
conforme prescrito em Preparação da amostra permanecem dentro da região linear. O ruído
(medido com atenuação mínima necessária para uma altura não inferior a 5 mm) foi de 7 mm,
o que por comparação com a média das alturas dos picos das dez injeções da solução mais
diluída resultou em um Limite de Detecção (para AAS e AS), da ordem de 0,3 mg/100 mL.
8,0x102 400
6,0x102
300
Área do pico
Área do pico
4,0x102
200
r = 0,99996 r = 0,99999
2,0x102
100
0,0
0
0 500 1000 1500 2000 0 100 200 300 400 500
Concentração (mg/L) Concentração (mg/L)
Gráfico 7.4 – FLD do AAS. Gráfico 7.5 – FLD do AS.
iii. Precisão e expressão dos resultados
A partir dos dados (áreas) das dez injeções da solução mais diluída referida no
item ii acima, pode ser calculado o erro analítico (de repetibilidade) e a partir deste
(1,2%), determinar a forma correta de expressão do resultado (válida para ambos os
compostos):
Re = X  0,01 mg/L
8 – TÉCNICAS ADICIONAIS DE IDENTIFICAÇÃO
8.1. Tempo de retenção e retenção relativa
A identificação é feita tradicionalmente através da medição do tempo de

retenção (tr). Entretanto, a essa forma de medição está associado um erro, decorrente de
uma natural variação no tempo transcorrido entre a injeção e o acionamento do sistema de
registro. Esse erro costuma ser da ordem de 2 % em relação ao tempo de retenção. É
pequeno demais, na maioria das vezes. Mas há casos em que a diferença de t r entre dois
componentes é dessa mesma ordem de grandeza. Em tais casos é recomendável o
emprego da Retenção Relativa (RR). Um dos componentes é tomado como referência
(RR = 1) e as RR’s dos demais são calculadas com auxílio da relação:
RRb = trb/tra ,
onde tra e trb são, respectivamente, os tempos de retenção da referência e de outro

componente.
8.2. Índice de retenção
Outro parâmetro utilizado para identificação, o Índice de Retenção (Ir) é

determinado experimentalmente a partir do cromatograma da mistura do desconhecido (i)
com duas parafinas normais com n e m (m = n + 1) átomos de carbono, desde que:
Vrn < Vri <Vrm onde Vr = volume de retenção = F.t r
A relação
pode ser substituída por:
Nesse sistema, assume-se que:

Padrões para determinação do Ir :

a) como visto acima, as parafinas normais são, por definição, padrões
primários, com I r = 100n.
b) em qualquer série homóloga com mais de 5 átomos de carbono, o I r cresce de
100 unidades para cada CH2 adicional e não é influenciado pela temperatura.
Esses compostos podem, portanto, ser utilizados como padrões secundários.
8.3. Equivalência entre fases estacionárias
p n p n
É conhecida a relação I ri  I ri onde I ri e I ri são, respectivamente,
os índices de retenção de um composto i numa fase polar qualquer e numa fase
estacionária não polar tomada como referência (geralmente esqualano), medidos a uma
mesma temperatura. Essa relação permite avaliar a influência, na separação, da fase
estacionária e de grupos substituintes presentes na molécula da substância considerada.
McReynolds, baseado em trabalho inicial de Rohrschneider, tomou

cinco compostos como referência e associou o somatório dos seus valores de I com a
polaridade da fase estacionária, chegando a classificar centenas de fases estacionárias. A
Tabela 8.1 apresenta alguns exemplos (observe-se que as FE’s estão colocadas em ordem
crescente de polaridade). Os valores de I, denominados constantes de McReynolds,
foram determinados a 120 oC. Os valores de I r para os cinco compostos, com a fase
estacionária esqualano, são: benzeno, 653; n-butanol, 590; 2-pentanona, 627;
nitropropano, 652 e piridina, 699. Por comparação entre os números de McReynolds de
duas diferentes fases estacionárias, é possível concluir se as mesmas são equivalentes ou
não. É possível também prever como melhor uma separação, comparando-se a natureza
de duas substâncias-problema com duas das cinco substâncias tomadas como referência.
Tabela 8.1 – Valores do Número de McReynolds (I) para algumas fases estacionárias.
FASE VALORES DE I
ESTACIONÁRIA A B C D E I
Esqualano (*) 0 0 0 0 0 0
Nujol 9 5 2 6 11 33
Apiezon L 32 22 15 32 42 143
SE-30 15 53 44 64 41 217
SE-52 32 72 65 98 67 334
Hallcomid M-18 OL 89 280 143 239 165 916
QF-1 144 233 355 463 305 1500
Carbowax 20M 322 536 368 572 510 2308
Diglicerol 371 826 560 676 854 3287
DEGS 492 733 581 833 791 3430
TCEP 593 857 752 1028 915 4145
9 – BIBLIOGRAFIA(*)
1. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold, Holland. 1967.
2. Ciola, R. Fundamentos da Cromatografia a Gás. Ed. Edgard Blücher Ltda., São Paulo, 1985.
3. Ciola, R. Tópicos em Cromatografia a Líquido. Inst. Científicos C. G. Ltda., São Paulo, 1984.
4. Hadden, N. e Col. Basic Liquid Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1971.
5. McNair, H. e Bonelli, E. Basic Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1968.
6. Basics of Liquid Chromatography. Spectra-Physics, Cal. USA, 1977.
7. Fundamentals of Gas Analysis by Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1977.
8. Schuler, A. Caderno de Práticas de Cromatografia. Depto. Eng. Química/UFPE, 1994.
(*) A Literatura aqui apresentada serviu de base para a elaboração deste texto e é recomendada
àqueles que pretendem aprofundar-se na matéria.
10 – APÊNDICE 1
Características básicas dos detetores
10.1. Sensibilidade
A sensibilidade de um detetor é medida pela sua Resposta, que é a

magnitude do sinal recebido pelo Sistema de Aquisição de Dados (Registrador
potenciométrico, Integrador ou Software), sob a forma de área do pico. Assim,
quanto maior for a área do pico de uma mesma amostra, maior será a sensibilidade do
detetor empregado.
10.2. Nível de ruído
O ruído é uma característica indesejável dos detetores, ou melhor, de

qualquer dispositivo eletrônico. No caso do cromatógrafo, o ruído é devido a um
conjunto de fatores, tais como:
- impurezas dos componentes eletrônicos - mau contato em cabos e conectores

- interferências na rede elétrica - sangramento da coluna
- defeitos em circuitos eletrônicos - contaminação na válvula de amostragem
- contaminação no septo da coluna - contaminação no detetor
- vazamento de fase móvel - contaminação na coluna
Essas causas podem ser removidas, exceto a primeira, que depende

não só da qualidade do produto, mas também de suas características próprias. Assim,
existe um nível mínimo de ruído que não pode ser removido. Evidentemente, um
pico com altura igual à do ruído não poderá ser reconhecido como tal. O ruído faz
com que a linha de base não seja uma reta perfeita, mas algo parecido com o traçado
mostrado na Fig. 10.1.
Fig. 10.1. Linha de base com ruído.
10.3. Limite de Detecção
Limite de Detecção (LD), ou Quantidade Mínima Detectável (QMD),

como o próprio nome o diz, é a massa mínima injetável que produza um pico que
possa ser identificado como tal. Por definição, LD é uma massa cujo pico tenha uma
altura igual ao dobro da altura média do ruído (h r, Fig. 10.1).
10.4. Faixa de Linearidade Dinâmica
Entende-se por Faixa de Linearidade Dinâmica (FLD) o intervalo

compreendido entre a Quantidade Mínima Detectável (QMD) e a massa máxima injetável
cuja Resposta ainda seja linear. A Fig. 10.2 ilustra a situação. A linha vermelha
compreende a região linear. Alguns detetores, possuem uma faixa ampla (DIC), enquanto
outros apresentam linearidade numa faixa bem mais estreita (DCE). Alguns operam com
massas altas (DCT, DIR), enquanto outros só apresentam linearidade a altas diluições
(DCE, DUV). Para se determinar a FLD
de um detetor, em relação a um
determinado composto, é necessário
preparar soluções dentro do intervalo de
interesse e montar um gráfico equivalente
ao apresentado na Fig. 10.2. Em seguida,
o analista deve calcular o coeficiente de
correlação (r; Apêndice 6) para todos os
pontos e depois recalcular o coeficiente
de correlação após retirar,
sucessivamente, os pontos n, (n-1), (n-2),
etc, até que o valor de r permaneça
estável e próximo de 1. Não tendo havido
Figura 10.2 – Faixa de Linearidade Dinâmica. erro grosseiro na preparação das soluções,
nas injeções, nem nas medições de áreas,
deve-se encontrar um valor de r maior ou
igual a 0,999.
11. APÊNDICE 2
Técnicas de introdução da amostra
Tradicionalmente a amostra (sólido em solução, líquido ou gás) é

introduzida com auxílio de uma microseringa (Figura 11.1). Em Cromatografia a Gás
(CFG), exceto com colunas capilares ou megabore (ver abaixo), recomenda-se injetar de 3
a 5 microlitros (L), sendo que o erro de medição é inversamente proporcional ao
volume.
Figura 11.1 – Microseringa para amostras líquidas em CFG
Em se tratando de amostras gasosas, existem duas outras técnicas:

seringa especial para gases (seringas gas-tight, que previnem contaminação ou
diluição da amostra com ar), que é utilizada quando a amostra não está pressurizada e
a válvula injetora de sete vias (Figura 11.2).
Em Cromatografia a Líquido (HPLC), a amostra (líquido ou sólido

em solução) é introduzida com auxílio de uma seringa numa válvula equivalente à
válvula da Figura 11.2, sendo do tipo rotativa e resistente à alta pressão empregada
neste tipo de equipamento. Ambas as válvulas encarregam-se de medir o volume
injetado, que varia de umas poucas dezenas de microlitros (HPLC) a 1 – 2 mL (CFG).
No caso de colunas capilares (ou megabore), o volume máximo

injetável é muito pequeno para ser medido por uma microlitros (0,01 a 1 L). Além
disso, o diâmetro das mesmas é tão pequeno ( 0,53 mm) que a injeção não pode ser
feita diretamente na coluna, como acontece com as colunas de maior diâmetro (CFG).
Nesses casos, é necessário um injetor especial, onde a amostra, uma vez vaporizada, é
dissolvida na fase móvel e esta solução sofre uma divisão (divisor pneumático), de
modo que 1/100 ou uma fração ainda menor é realmente enviada para a coluna,
enquanto que o restante é descartado.
Figura 11.2.a – Válvula de injeção de amostra gasosa (posição carga)
Figura 11.2.b – Válvula de injeção de amostra gasosa (posição

injeção)
12. APÊNDICE 3
Sistemas de aquisição de dados
Mesmo na atualidade ainda são empregados registradores para a

aquisição dos dados cromatográficos. Qualquer que seja o detetor empregado (CFG ou
HPLC), o sinal gerado pelo mesmo é uma tensão (corrente contínua). Trabalhando-se com
registrador, obtém-se um gráfico (cromatograma), com auxílio do qual são medidos os
tempos de retenção e as áreas dos diferentes picos. O tempo gasto nesse trabalho é muito
grande e o erro é às vezes bastante expressivo (5 a 10 %).
O integrador eletromecânico realizou uma verdadeira revolução na

Cromatografia, particularmente em laboratórios de Controle de Qualidade, acelerando e
aumentando bastante a precisão do trabalho analítico (erro da ordem de 0,5 %).
Com o desenvolvimento da eletrônica, alguns registradores passaram a

ser comercializados com um integrador eletrônico cujo registro gráfico era igual ao do
integrador eletromecânico, de modo que não houve diminuição visível no erro de
integração, pois a leitura continuava sendo analógica. Mas logo em seguida surgiram os
verdadeiros integradores eletrônicos. Os primeiros limitavam-se a imprimir a área
medida. Os cálculos eram ainda realizados pelo analista, embora com uma precisão na
integração (medida da área) da ordem de 0,001 %. A Segunda geração de integradores
veio complementar o trabalho. Após a integração, o equipamento, utilizando o método de
cálculo previamente selecionado pelo analista, realizava a operação final, chegando a
imprimir a concentração na unidade desejada. Esses equipamentos denominam-se
integradores-processadores. Alguns, mais sofisticados, imprimem o cromatograma, em
tempo real, utilizando os recursos de correção vertical e correção tangencial e inclusive
realizando cálculos pós-análise (geralmente em BASIC), além de automatizar o
acionamento de válvulas. Na realidade esses integradores de última geração são
computadores dedicados. Seu alto custo, aliado a uma curta vida tecnológica, decretou o
fim desses equipamentos.
Na atualidade, os laboratórios de cromatografia estão substituindo os

integradores por softwares bastante completos e sofisticados, que com auxílio de um
microcomputador tipo PC e de uma interface, realizam o trabalho do integrador com a
mesma eficiência, a um preço bem menor, além de poderem monitorar até quatro
cromatógrafos de um modo totalmente independente.
13. APÊNDICE 4
O desenvolvimento cromatográfico
As Figuras 1.1 (p. 1) e 2.1 (p. 3) mostram, respectivamente, a

distribuição das partículas sólidas (fase estacionária sólida ou suporte, no caso da fase
estacionária líquida) dentro de uma coluna empacotada e o processo de separação a nível
molecular (pictoricamente). Na Seção 2.2 (p. 4) é dado um pequeno tratamento
matemático ao processo de separação por partição, quando então há referência a etapas
ou pontos de equilíbrio. Entre as páginas 6 e 7 é oferecida uma pequena discussão a
respeito do que acontece numa coluna de cromatografia clássica (fase estacionária sólida),
quando faz-se referência a uma coluna desenvolvida. No final da Seção 2.5, ao discutir as
Figuras 2.13 e 2.14 (p. 13), é feita referência ao número de pratos teóricos (n), como
medida da eficiência (capacidade de separação) de uma coluna cromatográfica.
Finalmente, no Capítulo 3 (p. 14), é apresentada a equação de van Deemter e seus
diversos parâmetros são discutidos.
O processo de separação cromatográfica pode ser analisado, por

analogia, como uma destilação fracionada. No projeto de uma coluna de destilação
contínua, o engenheiro químico calcula em que pontos devem ser colocadas bandejas
(pratos) para a retirada de frações de diferentes pontos de ebulição. Numa destilação em
batelada não existem essas bandejas, mas evidentemente o cálculo é o mesmo. Como não
existem pontos de remoção ao longo da coluna, tudo sai pelo topo da mesma, na ordem
crescente do ponto de ebulição. O mesmo acontece com a cromatografia. A diferença é
que outros fatores também interferem no processo, tornando-o mais complexo, porém
também mais completo, mais eficiente. Assim, enquanto uma coluna de destilação
contém cerca de 40-60 bandejas, uma coluna de cromatografia possui algumas centenas
ou mesmo milhares de bandejas (pratos teóricos).
Cada componente da amostra, com diferente coeficiente de partição (ou

de adsorção), movimenta-se ao longo da coluna, transportado pela fase móvel, com uma
velocidade média diferente: quanto maior for sua afinidade com a fase estacionária (ou
menor com a fase móvel), maior será o coeficiente e portanto maior será seu tempo de
residência (tempo de retenção) na coluna, ou seja, menor será sua velocidade média. O
material eluído comporta-se como um pistão móvel, com concentração máxima nas
proximidades da parte central e distribuição de concentração quase gaussiana. À medida
em que o tempo passa, a largura do pistão aumenta (por efeito da difusão), de modo que
se o tempo de eluição for muito grande, os picos coalescem e a separação será incompleta
(ver Figura 2.9, vazão V1, na página 10). Por outro lado, se o tempo for muito curto,
(vazão V4 da Figura 2.9), pode ser insuficiente para permitir separação completa. Esse
raciocínio levou à elaboração da equação abaixo, para o cálculo da eficiência de uma
coluna cromatográfica (Fig. 2.14, p. 13):
n = (4Dr/L)2
Pictoricamente, uma mistura de três componentes apresentaria o

comportamento mostrado na Figura 13.1 e a distribuição de concentração (ou de massa)
de cada componente é mostrada na Figura 13.2. Observe-se que a Figura 13.2 não é um
cromatograma. A substância que sai primeiro da coluna é a primeira a atingir o detetor.
Do mesmo modo, a primeira porção de cada componente a atingir o detetor é a da
extremidade direita (na Figura). O cromatograma, por outro lado, é traçado da esquerda
para a direita (neste livro). Assim, enquanto a Figura 13.2 mostra uma cauda frontal, o
cromatograma correspondente mostraria uma cauda no ramo negativo (descendente) do
pico de cada componente.
Figura 13.1 – Desenvolvimento cromatográfico de uma Figura 13.2 – Distribuição de

mistura ternária. massa.
14. APÊNDICE 5
Outros detetores empregados em Cromatografia
14.1. Detetor de Nitrogênio e Fósforo (DNP)
O DNP é um detetor utilizado em cromatografia a gás e foi projetado

especificamente para a detecção de compostos nitrogenados (N) e fosforados (P) a nível
de traços (concentrações da ordem de ppb). Também conhecido como detetor
termoiônico, o DNP utiliza uma eletrônica (e o próprio hardware) equivalente ao DIC,
inclusive com os mesmos gases (Nitrogênio como fase móvel e Hidrogênio e Ar Sintético
como gases da chama). O polarizador contém uma pastilha alcalina e a razão de fluxos
dos três gases (que é diferente para compostos nitrogenados ou fosforados) é insuficiente
para produzir chama, mas o potencial elétrico estabelecido no local gera um estado de
plasma, que aumenta de 14-105 a sensibilidade do detetor frente a esses compostos,
relativamente a outros compostos. Devido a essas características, o DNP é dito seletivo
para compostos nitrogenados e fosforados, unicamente para soluções extremamente
diluídas, sendo portanto ideal para a detecção de traços de pesticidas organo-clorados e
organo-fosforados.
14.2. Detetor Fotométrico de Chama (DFC)
O DFC é basicamente um detetor de ionização de chama, no que diz

respeito ao hardware. Entretanto, a detecção baseia-se na absorção da radiação emitida
pelo enxofre (e também pelo fósforo e ainda outros elementos) na região visível do
espectro eletromagnético. Trata-se portanto de um espectrofotômetro, obedecendo assim à
Lei de Beer. A radiação emitida pela chama atravessa um filtro, o qual seleciona o
comprimento de onda desejado (394 nm para o enxofre e 526 nm para o fósforo). Para
compostos contendo um desses elementos, sua sensibilidade é da mesma ordem de
grandeza do DNP, sendo portanto indicado para a detecção de traços (ppb) de pesticidas
fosforados e sulfurados.
14.3. Detetor de Íons
Até os anos 70 a Cromatografia Instrumental apenas não era empregada

na análise de íons (cátions e ânions). Posteriormente foi observado que o bombeamento
em paralelo de um reagente complexante poderia transformar o íon em um derivado (na
saída da coluna), colorido, o qual seria detectado num espectrofotômetro (ex.: detetor
UV-VIS).
A separação cromatográfica de íons, não discutida neste livro, ocorre

numa coluna contendo uma resina trocadora de íons apropriada, tratando-se portanto de
uma técnica bastante antiga, mais largamente empregada na purificação de águas
(deionização). O equipamento é, em última análise, um HPLC típico.
Para evitar o trabalho de derivação, foi desenvolvido um detetor

específico, o detetor de íons, que é, em última análise, um condutivímetro. Consta de um
par de eletrodos contidos numa célula termostatizada. Aplica-se um campo elétrico entre
os eletrodos. O efluente da coluna passa pela célula, variando a resistência ® entre os
eletrodos, de acordo com a Lei de Ohm. A condutância (L) é inversamente proporcional à
resistência e é medida em Ohm -1. Essa unidade atualmente denomina-se Siemens. Quando
a distância entre os eletrodos é de 1 cm, tem-se:
k = L/A
onde k é a condutância específica e A é a área do eletrodo. Por outro lado, a condutância

equivalente (Ce) é relacionada com a condutância específica como:
Ce = 1000 k/c
onde c é a concentração do íon em equivalente-grama/L.
14.4. Detetor de Fluorescência
O Detetor de Fluorescência, utilizado em HPLC, é equivalente a um

Detetor de Ultravioleta. A única diferença consiste na localização (ortogonal e não linear)
em relação ao caminho ótico. Desse modo, é captada apenas a radiação proveniente do
processo de fluorescência, característico de certas classes de compostos. Assim,
substâncias que não fluorescem podem existir na amostra sem interferir na detecção. Uma
importante aplicação é a análise de aminoácidos em materiais biológicos (ex.: teste do
pezinho). Neste exemplo, os aminoácidos são transformados em derivados fluorescentes
com o reagente AQC (carbamato de aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidila). Nove
aminoácidos podem ser analisados em aproximadamente dez minutos, em gradiente
ternário, com limite de detecção menor que 10 mg/L.
14.4. Detetor Eletroquímico
O Detetor Eletroquímico, também utilizado em HPLC, é basicamente

uma célula eletroquímica. O analito oriundo da coluna, ao passar pela célula, é oxidado
(ou reduzido) pelo potencial aplicado, gerando uma corrente elétrica que é proporcional à
sua concentração.
Existem dois tipos de detetores:
a) Detetor coulométrico: a amostra passa através da célula. Desse modo, todo

o material é oxidado (ou reduzido);
b) Detetor amperométrico: a amostra passa pela superfície do eletrodo.
Assim, apenas cerca de 1% a 5% do material é realmente oxidado (ou
reduzido).
Desenvolvido para detectar traços (ppb a ppt) de íons, este detetor exige alta
pureza de solventes e reagentes. A água, por exemplo, deve ser deionizada, purificada em
sistema Milli-Q ou equivalente e filtrada em filtros com 0,2 m (membrana de nylon 66)
e sua resistividade deve ser ao menos 18,2 Mohm.cm. O fabricante inclusive aconselha
que ao sair do sistema Milli-Q a água passe em coluna com fase móvel C 18 para extração.
15. APÊNDICE 6
Estatística
15.1. Erro estatístico
Todo trabalho experimental é dotado de erro. Trata-se aqui de

dois tipos de erro: a) erro estatístico e b) erro sistemático.
O erro estatístico possui características aleatórias. Pode ser avaliado e

minimizado, mas nunca anulado. Apresenta um comportamento gaussiano, isto é, em um
certo número de repetições, os valores que mais se afastam da média (aritmética) ocorrem
com menor freqüência e erros positivos e negativos de mesma grandeza ocorrem com
igual freqüência. O erro sistemático, por outro lado, é um erro determinado, possui sinal
(é positivo ou negativo). Em Cromatografia, o erro sistemático é corrigido
automaticamente pelo próprio método de cálculo (Seção 6.3; p. 33).
15.2. Avaliação do erro estatístico
Uma das maneiras de se medir o grau de dispersão de um conjunto de

resultados analíticos (repetições) é o desvio padrão (s), o qual pode ser calculado com
auxílio da equação
s =  [(xi - x )/(n – 1)]1/2 (eq. 22)
onde xi é um resultado qualquer, x é a média aritmética e n o número de repetições. Esse

parâmetro é denominado primeira estimativa do desvio padrão, já que o verdadeiro desvio
padrão só pode ser calculado quando n tende para infinito. Entretanto, s só pode ser
empregado quando n é maior que 10. Como normalmente n é muito pequeno (3 a 5
determinação em paralelo), emprega-se em seu lugar a segunda estimativa do desvio padrão
(sR):
sR = Kn R (eq. 23)
onde R é a amplitude, ou seja, a diferença entre o valor (resultado analítico) maior e o

valor menor. O valor de Kn é obtido da Tabela 15.1.
15.3. Avaliação da exatidão
Na realidade, erro de exatidão é o erro sistemático, que seria corrigido

pelo próprio método analítico, conforme afirmado acima. Entretanto, o analista pode
cometer erros operacionais que resultem em erro sistemático (ex.: uso de solventes
contendo impurezas que interfiram na identificação). O erro sistemático pode ser avaliado
com auxílio do teste t (de Student), que compara a concentração real de uma solução
padrão, preparada com todo critério (por exemplo, preparada por um Laboratório de
Referência) com a concentração do padrão empregado na calibração do equipamento. A
equação seguinte é aplicada, com auxílio da Tabela 15.2:
Tabela 15.1 - Valores de Kn para cálculo de sR.
n 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Kn 0,8862 0,5908 0,4857 0,4299 0,3946 0,3698 0,3512 0,3367 0,3249
X n
t (eq.24)
s
onde X é a média aritmética das n determinações,  é a concentração real, s é calculado
de acordo com a eq. 22 (p. 63) e t é comparado com o valor tabelado (Tabela 15.2). Se o
valor de tcalc for menor ou igual ao de t tab na coluna P = 95%, para o correspondente valor
de n-1, o Laboratório em avaliação está correto.
Tabela 15.2 - Valores de t para aplicação do teste t.
P (%)
n-1 90 95 99
1 6,314 12,706 63,657
2 2,920 4,303 9,925
3 2,353 3,182 5,841
4 2,132 2,776 4,608
5 2,015 2,571 4,032
6 1,943 2,447 3,707
7 1,895 2,365 3,499
8 1,860 2,306 3,355
9 1,833 2,262 3,250
10 1,812 2,228 3,169
15.4. Avaliação da reprodutibilidade
O objetivo é comparar a precisão de um Laboratório, de um analista, de

um equipamento ou de um método (ou um determinado procedimento) com outro. Aplica-
se o teste F, que compara a dispersão de um conjunto de dados com a de outro. Se as
diferenças em precisão forem estatisticamente significativas, o valor de F calc será maior
que o valor de Ftab (Tabela 15.3). Para uso da eq. 25, o maior desvio padrão é colocado no
numerador, de modo a ter-se um valor de F maior que 1.
s2A
F (eq. 25)
s2B
Tabela 15.3 - Valores de F para aplicação do teste F
(n -1) (n - 1) PARA O MÉTODO A

de B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 161 200 216 225 230 234 237 239 241 242
2 18,5 19 19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4 19,4 19,4
3 10,1 8,6 9,9 9,1 9,0 8,9 8,8 8,8 8,8 8,8
4 7,7 6,9 6,6 6,4 6,3 6,2 6,1 6,1 6,0 6,0
5 6,6 5,8 5,4 5,2 5,1 5,0 4,9 4,8 4,8 4,8
6 6,0 5,1 4,8 4,5 4,4 4,3 4,2 4,2 4,1 4,1
7 5,6 4,7 4,4 4,1 4,0 3,9 3,6 3,7 3,6 3,6
8 5,3 4,5 4,1 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,3
9 5,1 4,3 3,9 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 3,1
10 5,0 4,1 3,7 3,5 3,3 3,2 3,1 3,1 3,0 3,0
15.5. Número ideal de repetições
O número ideal de repetições (determinações em paralelo) é calculado

com aplicação das eq. 26 e 27:
t.s
 = R
n
(eq. 26) L = 100/ (eq. 27)
Os dados são organizados no Quadro abaixo (os valores são exemplo fictício), para
facilitar a interpretação. Na última coluna é indicada a diferença entre o valor de L atual e
o da linha anterior. No momento em que a diferença (vale dizer, a diminuição na
dispersão dos valores, ou ainda o aumento na precisão) fica desprezível, a critério do
analista, este adota o número anterior como sendo o número ideal de repetições.
n amostra A:  = 1%
 L Dif.
2 0,260 26,0 -
3 0,072 7,2 18,8
4 0,046 4,6 2,6

5 0,036 3,6 1,0
6 0,030 3,0 0,6
15.6. Expressão do resultado final
Para explicitar o grau de confiabilidade em uma análise, é necessário

indicar os limites de confiança. Na prática, é comum definir os limites a partir da
amplitude. Assim, um resultado Re é representado como:
Re = X + R/2
Na realidade, caso o método tenha sido submetido a uma avaliação
estatística completa, emprega-se a relação:
R
Re  X  t.Kn.
n
15.7. Cálculo do coeficiente de correlação (r)
Na Seção 10.4 (p. 54) foi solicitado o cálculo do coeficiente de

correlação. Este cálculo é realizado com uso da eq. 28:
(eq. 28)
Para ordenar os cálculos, faz-se uso do quadro abaixo, onde x e y são,

respectivamente, concentração e área do pico.
Ponto no x y x.y x2 y2
1 x1 y1 x1.y1 x12 y12
2 x2 y2 x2.y2 x22 y22
... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... ...
n xn yn xn.yn xn2 yn2
Totais x y x.y x2 y2

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SUMÁRIO

2 - Tipos de Processos Cromatográficos, 3

2.1. Cromatografia de adsorção, 3

3 - Tratamento teórico da Cromatografia, 14

3.1. Equação de Van Deemter, 14

4.1. O Cromatógrafo a Gás, 18

7. Otimização do processo analítico, 39

7.1. Parâmetros analíticos, 39

8. Técnicas adicionais de identificação, 50

10. Apêndice 1 (Características Básicas dos Detetores), 53

11. Apêndice 2 (Técnicas de introdução da amostra), 55

12. Apêndice 3 (Sistemas de aquisição de dados), 57

13. Apêndice 4 (O desenvolvimento cromatográfico), 58

14. Apêndice 5 (Outros detetores utilizados em Cromatografia), 60

15. Apêndice 6 (Estatística), 64

Cromatografia é um termo genérico, aplicado a um processo de

Num processo cromatográfico são envolvidas uma fase móvel e uma

A fase móvel pode ser um líquido ou um gás. No primeiro caso,

A Cromatografia pode ainda ser classificada em função da técnica

 Cromatografia em Fase Gasosa

Esta última é mais conhecida pela iniciais de seu nome em inglês

GPC (do inglês Gel Permeation Chromatography) é empregada na

2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS

2.1. Cromatografia de Adsorção

Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido

a) Cromatografia de Adsorção b) Cromatografia de Partição

Figura 2.1 - Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.

Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos

M2 = Mo [kpV1(V2 + kpV1)]2 (eq. 3)

A eq. 3 pode ser generalizada para

Mn = Mo [kpV1(V2 + kpV1)]n (eq. 4)

Para este segundo tipo de procedimento, a eq. 4 não é válida. Em seu

Esquema 2.1 - Distribuição (partição) de duas substâncias (A e B), em dois líquidos (1 e

Mn = Mo [V2(V2 + kpV1)]n (eq. 5)

A partição, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo

2.3. Cromatografia em Fase Líquida

O exemplo mais simples de cromatografia a líquido é a separação em

O líquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os

Fig. 2.2 - Cromatografia em Camada

Neste exemplo, a amostra contém dois

A necessidade de se controlar a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna,

O ponto A’ indica o nível da fase estacionária e o ponto A

2.4. Fatores que influem na separação

Independentemente do processo envolvido na separação cromatográfica

Natureza da fase estacionária Vazão da fase móvel

A polaridade da fase estacionária é um fator importante a se

B  ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0 oC)

Figura 2.4 – Separação em função da Figura 2.5 - Efeito da polaridade sobre a

A concentração da fase estacionária líquida também influi na separação,

Coluna: diglicerol, 20%, 6 metros

A- n-nonano (154oC) D- etanol (78oC) H- água (100oC)

B  ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)

Figura 2.7 - Uma separação malsucedida

Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte/FE sólida sobre a separação cromatográfica

malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min)

Figura 2.8 - Efeito da concentração da fase estacionária

onde: V 1 < V2 < V3 < V4

Figura 2.9 - Efeito da vazão da fase móvel sobre a separação

Figura 2.10 - Efeito da temperatura sobre a separação cromatográfica.

TIPO FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA EFEITO

2.5. Cromatografia Em Fase Gasosa (CFG)

Na Cromatografia a Gás empregam-se colunas bem mais longas que

A amostra (gás, líquido ou sólido em solução) é injetada (ver Apêndice