Alexandre Schuler - Cromatografia

SUMRIO
1 - Introduo, 1
1.1. Histrico, 1
1.2. Classificao, 1
2 - Tipos de Processos Cromatogrficos, 3
2.1. Cromatografia de adsoro, 3
2.2. Cromatografia de partio, 4
2.3. Cromatografia em fase lquida, 6
2.4. Fatores que influem na separao, 7
2.5. Cromatografia em fase gasosa, 11
3 - Tratamento terico da Cromatografia, 14
3.1. Equao de Van Deemter, 14
3.2. Fase estacionria, 14
3.3. Suporte, 15
3.4. Coluna, 16
3.5. Fase mvel, 16
4 - O Cromatgrafo, 18
4.1. O Cromatgrafo a Gs, 18
4.2. O Cromatgrafo a Lquido, 20
4.3. Detetores, 23
5 - Anlise Qualitativa, 30
6 - Anlise Quantitativa, 31
6.1. Introduo, 31
6.2. Medio de rea, 31
6.3. Mtodos de clculo, 33
6.4. Seleo do melhor mtodo de clculo, 37
7. Otimizao do processo analtico, 39
7.1. Parmetros analticos, 39
7.2. Projetando um mtodo analtico, 41
7.3. Validao de um mtodo analtico, 43
8. Tcnicas adicionais de identificao, 50
8.1 Tempo de reteno e reteno relativa, 50

8.2. ndice de reteno, 50
8.3. Equivalncia entre fases estacionrias, 51
9. Bibliografia, 52
10. Apndice 1 (Caractersticas Bsicas dos Detetores), 53
10.1. Sensibilidade, 53
10.2. Nvel de rudo, 53
10.3. Limite de Deteco, 53
10.4. Faixa de Linearidade Dinmica, 54
11. Apndice 2 (Tcnicas de introduo da amostra), 55
12. Apndice 3 (Sistemas de aquisio de dados), 57
13. Apndice 4 (O desenvolvimento cromatogrfico), 58
14. Apndice 5 (Outros detetores utilizados em Cromatografia), 60
15. Apndice 6 (Estatstica), 64
Alexandre Schuler - Cromatografia
1 - INTRODUO
1.1. Histrico
Cromatografia um termo genrico, aplicado a um processo de separao
fsico-qumico, o qual baseado nos fenmenos de adsoro e partio. Este termo foi
escolhido porque as primeiras separaes foram realizadas com substncias coloridas.
Entretanto, o processo cromatogrfico no restrito a essa classe de substncias,
constituindo-se na atualidade no mtodo mais eficiente de separao, com aplicaes na
Qumica Analtica Qualitativa e Quantitativa, para compostos orgnicos e inorgnicos,
independentemente de seu estado fsico.
1.2. Classificao
Num processo cromatogrfico so envolvidas uma fase mvel e uma fase
estacionria. A fase estacionria um slido ou um lquido (Figura 1.1). No segundo caso,
este fica impregnado em um slido (suporte) e o fenmeno mais atuante a partio. No
primeiro caso, tem predominncia a adsoro. Assim, pode-se classificar a Cromatografia
em dois tipos gerais: Cromatografia de Adsoro e Cromatografia de Partio.
Figura 1.1 - O Processo Cromatogrfico. A Fase Mvel transporta a amostra atravs da Fase
Estacionria. A velocidade mdia das partculas da amostra depende da sua natureza. Desse
modo, cada componente atingir o final da coluna em um instante diferente.
A fase mvel pode ser um lquido ou um gs. No primeiro caso,

denomina-se o processo de Cromatografia em Fase Lquida e no segundo caso de
Cromatografia em Fase Gasosa, ou simplesmente Cromatografia a Lquido e Cromatografia
a Gs.
A Cromatografia pode ainda ser classificada em funo da tcnica
empregada:
Cromatografia em Papel
Cromatografia em Camada Delgada
Cromatografia em Coluna Clssica
Cromatografia em Fase Gasosa

Cromatografia em Fase Lquida de Alto Desempenho
Esta ltima mais conhecida pela iniciais de seu nome em ingls

(High Performance Liquid Chromatography - HPLC) e constituem-se variantes suas as
seguintes tcnicas:
Cromatografia de Permeao em Gel (GPC)
Cromatografia de Troca Inica (IEC)
GPC (do ingls Gel Permeation Chromatography) empregada na anlise
de polmeros, enquanto a IEC (do ingls Ion Exchange Chromatography) empregada na
anlise de ons (ctions e nions).
2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRFICOS
2.1. Cromatografia de Adsoro

Adsoro um fenmeno fsico-qumico atravs do qual um slido
(adsorvente) fixa em sua superfcie um lquido ou um gs, por meio de interaes
semelhantes s foras de Van Der Waals. Chama-se coeficiente de adsoro relao
ka
Na
Nn
onde Na e Nn so respectivamente o nmero de moles adsorvidos e no adsorvidos de uma

determinada substncia. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka, estes
variando com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vrios
componentes forada a passar atravs de um tubo contendo um adsorvente (coluna
cromatogrfica), cada componente necessitar de um intervalo de tempo diferente para
transpor a coluna. Esse intervalo de tempo denominado tempo de reteno (Tr). A Figura
2.1a ilustra um processo de Cromatografia por Adsoro. A substncia mais fortemente
adsorvida mais dificilmente arrastada pela Fase Mvel.
a) Cromatografia de Adsoro
b) Cromatografia de Partio
Figura 2.1 - Diferena entre Cromatografia de Adsoro e Cromatografia de Partio.

2.2. Cromatografia de Partio
Se uma substncia adicionada a um recipiente contendo dois lquidos

no miscveis, ela se dissolver parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a
relao C1 / C2, onde C1 e C2 so as concentraes da substncia em cada um dos dois
lquidos. Denomina-se coeficiente de partio relao
kp
C1
C2
Se M0 a massa total da substncia e M1 a massa dissolvida no solvente

1, podemos escrever
kp
logo,
M1
M1
V2
V1
( M 0 M 1)
V 1 M 0 M1
V2
M 1 M 0.
k pV 1
V 2 k pV 1
(eq. 1)
Se a substncia estava inicialmente dissolvida no solvente 1, M1 a

massa que permanece neste solvente aps adio do solvente 2, o qual extraiu a massa (M0 M1). Se as duas fases forem separadas (com auxlio de um funil de separao, por exemplo),
a adio de outra quantidade do solvente 2 vai extrair a massa (M1 - M2), onde
M 2 M 1.
k pV 1
V 2 k pV 1
(eq. 2)
Substituindo na eq. 2 o valor de M1 (eq. 1 ), fica

M2 = Mo [kpV1(V2 + kpV1)] 2
(eq. 3)
A eq. 3 pode ser generalizada para

Mn = Mo [kpV1(V2 + kpV1)] n
(eq. 4)
que d a massa Mn que permanece no solvente 1 aps n extraes com o solvente 2. D-se ao
processo agora descrito o nome de extrao. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de, por
'
exemplo, 2 componentes, com kp kp , um dos componentes ficar preferencialmente no
solvente 1 e o outro no solvente 2. Assim sendo, medida que n cresce, cada fase ficar mais
pura em um dos componentes. No caso anterior (extrao), a poro de lquido 1 era
sempre a mesma, renovando-se apenas o lquido 2. Agora, ambos so renovados. O
Esquema 2.1, onde o lquido 1 o superior, ilustra o processo, que pode ser
visualizado a nvel molecular na Figura 2.1.b.
Sejam duas substncias A e B, onde kA maior que kB. Isto significa que o
lquido 1 vai se enriquecendo de A e o lquido 2, relativamente, vai se enriquecendo de B, a
cada etapa do processo. Os nmeros da esquerda, em cada quadrcula, indicam a frao de
A e os da direita indicam a frao de B. Do mesmo modo, os nmeros superiores indicam a
frao de A e de B no lquido 1 e os inferiores indicam a frao de A e de B no lquido 2.
No exemplo, foi utilizada uma mistura com quantidades iguais de A e de B, cujos
coeficientes de partio valem, respectivamente, 3 e 1/3.
Para este segundo tipo de procedimento, a eq. 4 no vlida. Em seu
lugar, pode ser deduzida, de modo semelhante, a eq. 5, onde Mn a massa extrada aps n
etapas. A partir dos valores de MAn e MBn, pode-se calcular a composio da mistura (ou o
grau de pureza de cada componente) em cada solvente, aps n etapas (n parties).
Esquema 2.1 - Distribuio (partio) de duas substncias (A e B), em dois lquidos (1 e 2)

no miscveis.
Mn = Mo [V2(V2 + kpV1)] n
(eq. 5)
A partio, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo

cromatogrfico. O nmero de equilbrios (etapas) que ocorrem dentro de uma coluna (n)
conhecido como o nmero de pratos tericos, prato terico sendo um ponto de equilbrio
(entre uma fase e outra). A distncia entre dois pontos de equilbrio consecutivos chama-se
altura equivalente a um prato terico (H). Os parmetros n e H sero novamente
discutidos mais adiante.
IMPORTANTE ! Se kB tambm for maior que a unidade, a perda de B ser muito grande e
tambm a purificao de A ser muito demorada (exigir maior nmero de etapas).
2.3. Cromatografia em Fase Lquida
O exemplo mais simples de cromatografia a lquido a separao em uma
camada delgada de slica-gel depositada sobre uma placa de vidro (Cromatografia em
Camada Delgada). A Figura 2.2 ilustra o processo.
O lquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os
componentes de uma mistura binria (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicao). Quando
o solvente se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta removida da cuba que
contm o solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posio vertical e a um
nvel abaixo do ponto de aplicao. As razes de frente, RfA = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 so
caractersticas de cada substncia, dependendo da natureza da fase mvel e da fase
estacionria. A Cromatografia em Camada Delgada a mais empregada em Anlise
Qualitativa ou semi-Quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra utilizada,
menos indicada para fins preparativos, quando ento se emprega a Cromatografia em
Coluna Clssica. Neste segundo tipo de processo, a fase estacionria colocada em um tubo
de vidro (coluna cromatogrfica) colocado na posio vertical. A coluna dotada de uma
torneira na extremidade inferior (Fig. 2.3), que utilizada para controlar a vazo da fase
mvel, que desce por gravidade.
Fig. 2.2 - Cromatografia em Camada
Delgada.
Neste exemplo, a amostra contm dois
componentes, A e B, que so identificados
pelos respectivos valores de R f
A necessidade de se controlar a vazo da fase mvel e a temperatura da coluna,

alm da impossibilidade (naquela poca - anos 50) de se bombear um lquido
com fluxo constante e contnuo, levaram os projetistas a abandonar essa tcnica, passando a
utilizar um gs como fase mvel (1956).
Figura 2.3
Cromatografia
em Coluna
O ponto A indica o nvel da fase estacionria e o ponto A

indica o nvel da fase mvel. A diferena A - A deve ser o
menor possvel, para evitar a diluio do material a ser
cromatografado, o que resultaria em zonas (na Fig. 2.3, as faixas
1, 2 e 3) mais largas. Ao se fazer a eluio (passagem da fase
mvel), os componentes afastam-se do ponto de aplicao (topo
da coluna) a uma distncia d tal que d/ l = Rf ( l o comprimento
da coluna), obtendo-se assim uma coluna desenvolvida. A partir
da, continuando-se a eluio, cada componente pode ser
coletado isoladamente, quando atingir o final da coluna.
Denomina-se Volume de Reteno (V r ) o volume de fase mvel
necessrio para a eluio completa de um componente. D esse
modo, tem-se V r = V 1 / Rf, onde V 1 o volume ocupado pela
fase mvel dentro da coluna. A partir da pode ser calculado o
volume total de solvente necessrio para a eluio de todos os
componentes da amostra. No Apndice 4, so discutidos mais
detalhes sobre o desenvolvimento da coluna.
2.4. Fatores que influem na separao

Independentemente do processo envolvido na separao cromatogrfica
(adsoro ou partio), esta funo de uma srie de fatores, a saber:
Natureza da fase estacionria
Concentrao da fase estacionria
Natureza da fase mvel
Vazo da fase mvel

Temperatura
Granulometria e geometria do suporte
A polaridade da fase estacionria um fator importante a se

considerar. Em princpio, quando se tem uma fase estacionria no polar, os
diversos componentes da amostra eluem na ordem crescente de seus pontos de
ebulio e o processo assemelha-se bastante a uma destilao (Figura 2.4). Quando a
fase estacionria apresenta polaridade, essa ordem de eluio em funo do ponto de
ebulio fica alterada (Figura 2.5) e s obedecida quando os componentes
apresentam polaridade de mesma ordem de grandeza (componentes A-C e D-G da
Figura 2.6). Em alguns casos, a diferena de polaridade pode ser equilibrada com a
diferena de ponto de ebulio, fazendo com que dois componentes distintos eluam
juntos (Figura 2.7). Nesses casos, outros fatores podem auxiliar na separao, como
a ponte de hidrognio entre os componentes D-G da Figura 2.6.
FE: Esqualano (um hidrocarboneto de baixssima polaridade)
FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)
A Benzeno (ponto de ebulio = 80,2 oC)
Figura 2.4 Separao em funo da diferena

no ponto de ebulio
B ciclo-Hexano (ponto de ebulio = 81,0oC)
Figura 2.5 - Efeito da polaridade sobre a

separao cromatogrfica
A concentrao da fase estacionria lquida tambm influi na separao,

como pode ser observado na Figura 2.8. Alis, com o uso, normal diminuir a
concentrao, por arraste pela fase mvel, mesmo temperatura ambiente, de modo que
colunas com fase estacionria lquida possuem um tempo de vida til finito, que pode ser
bastante curto, medida em que a temperatura da anlise se aproxima da temperatura
limite, que por definio situa-se 150oC abaixo da temperatura de ebulio da fase
estacionria. Atualmente, tem sido desenvolvidas fases quimicamente ligadas (ver Seo
3.2 - Fase Estacionria; p. 14).
Coluna: diglicerol, 20%, 6 metros
A- n-nonano (154oC)
B- n-decano (174oC)
C- n-undecano (194oC)
no polar, no forma ponte
D- etanol (78oC)
E- n-propanol (94oC)
F- n-butanol (118oC)
G- n-pentanol (132oC)
polar, ponte de hidrognio mdia
H- gua (100oC)
polar, ponte de hidrognio fortssima
Figura 2.6 Efeito da ponte de hidrognio sobre a separao cromatogrfica
FE: Apiezon (um hidrocarboneto)
Outro fator importante,

principalmente em HPLC, a polaridade da
fase mvel. Alis, esse o principal recurso
para implementar uma separao (ver
Gradiente de Polaridade, na Seo 4.2; p.
22). Tambm a vazo da fase mvel muito
importante na separao. A Figura 2.9 ilustra a
situao, que foi alvo de um estudo semiterico realizado por van Deemter (Captulo
3). Tambm a temperatura (a que est
A Benzeno (ponto de ebulio = 80,2 oC)
o
submetida a coluna) fator determinante na
B ciclo-Hexano (ponto de ebulio = 81,0 C)
separao, particularmente em CFG, conforme
resume o quadro anexo Figura 2.10.
Figura 2.7 - Uma separao malsucedida
Finalmente, a granulometria da fase
estacionria slida (ou do suporte slido da fase estacionria lquida), conforme mostrado na Tabela
2.1, tambm influi na separao.
Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte/FE slida sobre a separao cromatogrfica
malha/polegada
nmx
60-80
4300
80-100
4600
100-120
5700
D.E. = 1/8; l = 4 m; C = 10 %
Hmn
0,93
0,87
0,70
Fo (mL/min)
20
20
24
Figura 2.8 - Efeito da concentrao da fase estacionria sobre
10
a separao cromatogrfica.
onde:
V 1 < V2 < V 3 < V 4
Figura 2.9 - Efeito da vazo da fase mvel sobre a separao

cromatogrfica.
Figura 2.10 - Efeito da temperatura sobre a separao cromatogrfica.
11
O quadro apresentado a seguir sumariza a relao entre o efeito e o tipo de processo.
TIPO
ADSORO
PARTIO
FASE MVEL FASE ESTACIONRIA

EFEITO
G
S
DIMINUI TR
L
S
DIMINUI TR
G
L
DIMINUI TR
L
L
NO ALTERA TR
2.5. Cromatografia Em Fase Gasosa (CFG)

Na Cromatografia a Gs empregam-se colunas bem mais longas que
aquelas usadas em Cromatografia a Lquido. O princpio o mesmo, mas a fora motora a
presso do gs e no a fora da gravidade, de modo que as colunas normalmente so
dobradas em espiral, a fim de ocupar menos espao dentro do cromatgrafo. A Fig. 2.11
esquematiza um cromatgrafo a gs.
A amostra (gs, lquido ou slido em soluo) injetada (ver Apndice 2),
com auxlio de uma microseringa ou vlvula apropriada, no Injetor, que tambm o
Vaporizador (V) e os seus vapores so arrastados para o interior da coluna pela fase mvel
(gs de arraste). Na sada da coluna, a amostra passa pelo Detetor (D), que envia um sinal
Fig. 2.11 - Cromatgrafo a Gs

para o Registrador (R). Como ser visto adiante (Detetores, p. 23), este sinal proporcional
quantidade de cada componente, o que permitir uma anlise quantitativa. Vale
acrescentar que a Cromatografia a Gs talvez o mtodo de anlise mais preciso. O sinal
eletrnico captado pelo registrador transformado num movimento da pena do mesmo.
Como o papel de registro est em movimento, obtm-se um grfico (Fig. 2.12) denominado
cromatograma.
12
Fig. 2.12 - Cromatograma de uma amostra com dois componentes.

As reas A1 e A2 sob as duas curvas do cromatograma da Fig. 2.12 so
proporcionais s quantidades dos dois componentes na mistura. Distncia de Reteno (Dr)
a distncia, no papel, entre o ponto registrado no momento da injeo (Incio) e o ponto
correspondente ao mximo de cada curva (pico). Dr varia com a velocidade do papel (z),
mas o tempo de reteno (Tr = Dr/z) uma caracterstica da substncia que varia com a
vazo da fase mvel, a natureza e a concentrao da fase estacionria e com a temperatura.
Por isso, o cromatgrafo possui controladores de vazo da fase mvel e da temperatura do
forno da coluna. A coluna (e consequentemente a fase estacionria) pode ser substituda, at
encontrar-se a coluna ideal para uma dada amostra. Alm disso, existe uma vazo ideal para
cada coluna, independentemente da natureza da amostra (ver Fig. 2.13). Assim sendo, a
temperatura da coluna o principal recurso disponvel para obter-se um mximo de
separao entre os diversos componentes da amostra.
Outro parmetro usado em CFG a Reteno Relativa (RR), que
tambm usado na identificao:
RR =
Tr2
Vr 2
Dr 2
=
=
Tr1
Vr 1
Dr1
Essas relaes so equivalentes, desde que Vr2 = F.Tr e F e z so constantes (F = vazo da

fase mvel).
13
Fig. 2.13 - Relao entre F e n ou H. Fi a Vazo Ideal (os parmetros A, B e C so

descritos na Seo 3.1, eq. 6).
Obs.: Experimentalmente determina-se H por medio da distncia de reteno e aplicao
das equaes:
n = (4Dr/L)2
H = l /n,
onde l o comprimento da coluna e L a largura do pico na base. A Figura 2.14 ilustra o

procedimento. O parmetro n mede a eficincia de uma coluna cromatogrfica (ver
Cap tulo 3 ).
Figura 2.14 - Procedimento para determinao do

nmero de pratos tericos. As duas
grandezas devem ser medidas em
milmetros (ou em minutos ou
segundos).
14
3 - TRATAMENTO TERICO DA CFG

3.1. Equao de Van Deemter
Van Deemter estabeleceu uma equao emprica (eq. 6) que relaciona as
diversas variveis da Cromatografia a Gs com H (altura equivalente a um prato terico).
Como H igual a l /n e n mede a eficincia do processo, buscam-se condies em que o
valor de H mnimo:
(eq. 6)
=
dp =
Dg =
=
K =
N=
df =
Dl =
v=
parmetro adimensional que mede as irregularidades no empacotamento da coluna.

dimetro mdio das partculas do suporte.
coeficiente de difuso da amostra na fase mvel.
fator de correo para a tortuosidade dos canais entre partculas.
k.Nl /Ng ; k = coeficiente de partio.
frao de fase estacionria (l) ou da fase mvel (g) dentro da coluna.
espessura efetiva do filme lquido (pelcula de fase estacionria na superfcie do suporte).
coeficiente de difuso da amostra na fase estacionria.
velocidade linear da fase mvel.
A equao de Van Deemter pode ser escrita sob a forma geral
H = A + B/v + C.v
(eq. 7)
que a equao de uma hiprbole (Fig. 2.13). Como pode ser visto na eq. 6, o modo de
empacotamento, o dimensionamento do suporte e o coeficiente de difuso da amostra em
cada fase so fatores que devem ser seriamente considerados, quando projetada uma
coluna. Temperatura talvez o fator mais importante, embora no aparea explicitamente
na eq. 6. que K e D so altamente dependentes da temperatura. Realmente, observa-se na
prtica que esta a varivel que mais influi na resoluo, variando drasticamente a reteno
relativa. De um modo geral, o tempo de reteno depende da natureza da fase estacionria,
da temperatura de operao e da vazo da fase mvel.
3.2. Fase estacionria
A fase estacionria um slido (Cromatografia de Adsoro) altamente poroso
(mais de 150 m2/g), ou, mais comumente, um lquido (Cromatografia de Partio). No segundo
caso, o lquido depositado sobre um slido (suporte), que ser discutido mais adiante.
15
Interaes entre dipolos, polaridade e pontes de hidrognio so os

principais fatores, na fase estacionria, que determinam a separao cromatogrfica. Esses
fatores so dependentes da temperatura, da tambm a necessidade de um controle dessa
varivel. Os Cromatogramas 3.1.a e 3.1.b ilustram a influncia da polaridade e da ponte de
hidrognio sobre a separao. Em ambos, como so usadas fases estacionrias polares, os
picos aparecem na ordem crescente de polaridade dos componentes. Mas, no
Cromatograma 3.1.b, como a fase estacionria (diglicerol) interage com o etanol (ponte de
hidrognio), o tempo de reteno deste bastante aumentado (ver tambm Seo 2.4; p. 7).
Alto ponto de ebulio e inrcia qumica e cataltica (em relao
amostra, fase mvel e ao material de que constitudo o tubo da coluna) so os principais
requisitos para uma fase estacionria. Em relao ao ponto de ebulio (PE) deve ser
lembrado que a temperatura limite para operao com uma dada coluna 150 0C abaixo do
PE da fase estacionria. Acima dessa temperatura, a perda por volatilizao excessiva. Em
anos recentes tem sido utilizada a FQL (Fase Quimicamente Ligada), onde a FE une-se ao
suporte mediante uma reao qumica. As fases estacionrias mais freqentemente
utilizadas, com um amplo espectro de aplicaes, so polmeros derivados de silcio, as
polisiloxanas (ou siliconas), como a SE-30, por exemplo. Outra fase tambm bastante
utilizada o polietilenoglicol (ex.: Carbowax 20M).
3.3. Suporte
O suporte tem a funo de fixar dentro da coluna a fase estacionria.
necessrio que o suporte seja qumica e cataliticamente inerte. O material a ser empregado
tambm no pode exibir rea superficial maior que 50 m2/g, alta porosidade, nem grande
poder de adsoro. Centros ativos (cidos ou bsicos) podem provocar modificaes
estruturais na amostra, devendo ser removidos. Terras diatomceas, graas sua baixa
capacidade de adsoro e sua baixa porosidade, so ainda muito empregadas como
suporte. Um excelente suporte base de diatomcea comercializado com um nome
constitudo da palavra Chromosorb seguida de uma ou mais letras (ex.: Chr WHP).
Atualmente, tm sido desenvolvidos materiais sintticos, copolmeros do etilvinilbenzeno
com divinilbenzeno. A depender do processo de fabricao, esses polmeros tambm podem
ser empregados como fase estacionria (Ex.: Porapak Q, Chromosorb 101, etc). Permitem
um bom empacotamento, graas uniformidade na granulometria e na prpria geometria
das partculas.
16
Figura 3.1 - Ausncia (a) e presena (b) de ponte de hidrognio entre FE e etanol
3.4. Coluna
O material de que constituda a coluna (tubo) pode ser ao inox 316,
alumnio, nquel, vidro ou teflon. Quando no se conhece o material a ser analisado, d-se
preferncia s colunas de vidro (trata-se de um vidro especialmente tratado, para remover
centros cidos de sua superfcie) ou de teflon, sendo que a ltima tem emprego mais
restrito, devido sensibilidade ao calor e presso. As colunas so classificadas quanto ao
dimetro externo:
- Coluna microanaltica (capilar) ............
- Coluna analtica ..................................
- Coluna semi-preparativa .....................
- Coluna preparativa ..............................
0,1 a 0,5 mm
1/8, 3/16 e 1/4
3/8, 1/2 e 5/8
5, 7 e 10 cm
As colunas analticas mais comumente empregadas possuem 2 a 3 m de

comprimento, com 1.000 a 10.000 pratos tericos. Colunas capilares so bem mais longas. As
primeiras capilares fabricadas possuam mais de 100 m. Com o avano da tecnologia, o
comprimento atual situa-se entre 20 e 40 m, embora com cerca de 100.000 pratos tericos. Tem-se
notcia de uma coluna capilar com cerca de 1600 m de comprimento e 1 milho de pratos tericos.
Atualmente foram desenvolvidas colunas com 0,53 mm (colunas
megabore) com excelentes resultados. Mais simples de instalar, renem as qualidades das
colunas analticas e das capilares.
As colunas usadas em CLAD (seo 4.2, p. 22) so bem mais curtas (10 a 40 cm)
e os dimetros encontrados mais comumente no comrcio especializado variam entre 3 e 5 mm.
3.5. Fase mvel
Em CFG, a fase mvel um gs inerte, devendo apresentar-se bastante
puro, principalmente quando tratar-se da anlise de traos. Os gases mais empregados so
H2, N2, He, Ar e Ne, podendo tambm serem utilizados outros, em casos especiais.
17
Na escolha da fase mvel (ou gs de arraste), devem ser considerados os

seguintes fatores:
- Disponibilidade/custo.
- Eficincia na separao.
- Efeito sobre o tempo de anlise.
- Segurana.
- Efeito sobre o sistema de deteco.
OBS.:
1 - A equao de Van Deemter simplificada (eq. 7), aplicada aos gases N 2 e H2,
apresenta os seguintes coeficientes (amostra: Propano), com uma dada coluna:
Ha = 0,1 + 0,07/v + 0,05v
Hb = 0,1 + 0,28/v + 0,05v
(N2)
(H2)
Esses dados comprovam a influncia da natureza do gs de arraste sobre a eficincia.

2 - A velocidade relativa de eluio aumenta na ordem H2 < N2 < He < Ar, fato que
demonstra a influncia da natureza do gs de arraste sobre o tempo de anlise.
A Tabela 3.1 resume a aplicao dos critrios acima mencionados, para
seleo da fase mvel em funo do detetor empregado.
Tabela 3.1 - Gases mais recomendados para CFG, por tipo de detetor.
TIPO DE DETETOR
Condutividade Trmica
Ionizao de Chama
Captura Eletrnica
GASES MAIS USADOS

(Ordem de prioridade)
H2 > He >> N2
N2 > Ne > He
N2 > He
Em Cromatografia a Lquido empregam-se como Fase Mvel

principalmente gua deionizada, metanol, acetonitrila, etc. A seleo depende do detetor a
ser empregado e a fase mvel deve ser imiscvel com a fase estacionria liquida.
18
4 - O CROMATGRAFO
4.1. O Cromatgrafo a Gs
A Fig. 2.11 (p. 11) representa esquematicamente um Cromatgrafo a Gs.
possvel agora descrever mais detalhadamente o instrumento.
a) Controles de Temperatura
O cromatgrafo dispe de termostatos para controle independente do
aquecimento dos trs principais setores: cmara de vaporizao, forno da coluna e bloco do
detetor. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistncia eltrica localizada na
base do forno, homogeneizado por um ventilador, que pode permanecer ligado aps o
final do aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse caso, o compartimento do
forno deve permanecer aberto, exceto nos equipamentos que possuam dispositivo de
resfriamento automtico.
Figura 4.1 - Fluxmetro de bolha
Figura 4.2 - Divisor de fluxo para coletor
b) Controles Pneumticos
Os cromatgrafos a gs normalmente possuem uma vlvula controladora
de presso e outra para ajuste da vazo da fase mvel. Idnticos sistemas existem para o
controle da vazo dos gases auxiliares (ver seo 4.3.2.b; p. 25). A vazo medida com o
auxlio de um fluxmetro de bolha, ou bolhmetro (Fig. 4.1). A pra (parte inferior)
contm uma soluo de sabo lquido. Comprimindo-se a pra, o nvel do lquido sobe e
o gs forma uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazo, suficiente
marcar com um cronmetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na
19
atualidade, existem no mercado alguns equipamentos totalmente microprocessados,

tornando obsoletos esses acessrios.
c) Coletor de Fraes
O coletor de fraes um acessrio utilizado em Cromatografia
preparativa. O material efluente da coluna pode passar por um divisor de fluxo (Fig. 4.2), de
modo que uma parte desviada para o coletor, onde cada componente, isoladamente,
condensado. Colunas de maiores dimenses permitem a injeo de uma maior quantidade
de amostra, permitindo assim a produo de pequenas quantidades de um material com alta
pureza (maior que 99,9999%), que pode ser empregado como padro, por exemplo.
d) Detetores
Por ser necessrio um estudo mais detalhado, sero discutidos mais adiante.
e) Eletrmetro
O eletrmetro um amplificador de sinal. Este mdulo pode ser
controlado a qualquer instante, de modo que um sinal fraco (componente menor) pode ser
ampliado independentemente dos outros, enquanto que um sinal muito forte (componente
maior) pode ser atenuado o suficiente para que seu pico fique contido no papel do
registrador. Os Cromatogramas 4.1 e 4.2 ilustram, respectivamente, a relao real de reas e
outro registro da mesma amostra, com ampliao do primeiro sinal e atenuao do terceiro,
ou mais exatamente, atenuao menor para o primeiro e atenuao maior para o terceiro, em
relao atenuao do segundo. Logicamente, as reas medidas no segundo cromatograma,
multiplicadas pelos respectivos fatores de atenuao, fornecem os valores reais das reas
relativas.
Cromatograma 4.1 - Mesma atenuao
Cromatograma 4.2 - Atenuaes diferentes
20
f) Registrador
O registrador um instrumento acessrio, que transforma o sinal emitido
pelo detetor e amplificado pelo eletrmetro, em um sinal mecnico. Na extremidade do
sistema mecnico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da
linha de base, proporcional quantidade do componente na amostra. Como o papel est
em movimento, obtm-se uma curva (cromatograma), onde a distncia do incio da anlise
(ponto de injeo) ao mximo de cada pico a distncia de reteno (Dr). Dividindo Dr por
z (velocidade do papel), obtm-se o tempo de reteno, Tr. Idealmente, com separao
completa e condies timas (incluindo seleo perfeita da fase estacionria), obtm-se uma
curva simtrica. No Apndice 3 so discutidas outras tcnicas de aquisio de dados.
g) Programador Linear de Temperatura
Quando a reteno relativa (RR) de alguns componentes prxima da
unidade (baixa resoluo) e no entanto a temperatura de ebulio dos componentes menos
volteis muito alta (Cromatograma 4.3), um aumento na temperatura da anlise
(temperatura da coluna), com o objetivo de reduzir o tempo de anlise e obter um pico mais
agudo para os ltimos componentes (o que inclusive diminuiria o erro na determinao de
Dr), acarretaria uma diminuio na j pequena reteno relativa dos primeiros componentes
(Cromatograma 4.4). Em situaes como essa, pode-se aplicar um gradiente de temperatura,
com o auxlio de um Programador Linear de Temperatura (PLT). A velocidade de
aquecimento pode ser controlada, sendo possvel tambm promover um aquecimento
isotrmico em algumas regies. Em operaes desse tipo deve-se indicar no cromatograma
a temperatura inicial (Ti), a temperatura final (Tf), que no deve diferir da temperatura de
ebulio da fase estacionria em menos de 1500C, e a velocidade de aquecimento, para que
o cromatograma possa ser reproduzido posteriormente (Cromatograma 4.5).
Cromatogramas 4.3, 4.4 e 4.5 - Anlises em diferentes temperaturas

4.2. O Cromatgrafo a Lquido
21
O cromatgrafo a lquido (mais comumente conhecido pela sigla inglesa

da tcnica, HPLC (High Performance Liquid Chromatography; em portugus:
Cromatografia Lquida de Alto Desempenho), um instrumento mais simples que o
cromatgrafo a gs nos seguintes aspectos:
a) s possui um canal analtico, enquanto CGs podem ter at quatro canais;
b) modulado, isto , sistema de bombeamento e detetor so independentes, o
que facilita a substituio de detetores;
c) opera geralmente temperatura ambiente;
A Figura 4.3 um diagrama em blocos de um CL tpico. Cada bloco descrito
a seguir:
Figura 4.3 - Diagrama em blocos de um HPLC tpico

a) Reservatrio de Fase Mvel
A Fase Mvel (um lquido puro ou uma mistura de composio definida) deve
ser filtrada em membranas com 0,46 m de dimetro de poros e desgaseificada (ver prximo
item).
b) Sistema de desgaseificao
A Fase Mvel deve ser desgaseificada, para evitar a formao de bolhas,
as quais podem provocar cavitao (com conseqente dano bomba) ou gerar picos falsos,
ao passarem pela clula do detetor. So conhecidas vrias tcnicas de desgaseificao:
- aquecimento com agitao;
- borbulhamento de gs hlio;
- ultra-som;
- vcuo
c) Bomba
22
O bombeamento da Fase Mvel realizado por uma bomba

controlada por um microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de suco (para
evitar vaporizao de fase mvel mais voltil) e a vazo (importante quando a anlise
realizada com Gradiente de Polaridade, em cujo caso h necessidade de uma segunda
bomba; ver mais adiante).
d) Vlvula de injeo
A amostra sempre introduzida com auxlio de uma vlvula,
porquanto a presso de trabalho nunca menor que 50 atmosferas (Apndice 2).
e) Coluna
As colunas empregadas em CL so retas, uma vez que seu comprimento
raramente ultrapassa 30 cm, ocupando portanto muito pouco espao no equipamento.
f) Detetor
Os detetores utilizados em CL sero descritos na prxima seo.
g) Sistema de aquisio de dados.
Os sistemas de aquisio de dados empregados em CL so exatamente os
mesmos empregados em CG, ou seja, registradores, integradores ou microcomputadores
(Apndice 3).
Gradiente de Polaridade
Quando o CL dispe de apenas uma bomba, evidente que a fase
mvel tem uma composio constante, do incio ao fim da anlise. Nessa situao, a
polaridade da mesma tambm constante. Diz-se ento que o processo isocrtico.
Quando dispe-se de duas bombas (ou mais), possvel variar a composio da fase
mvel, colocando-se em cada reservatrio um lquido de polaridade diferente. O
microprocessador altera a vazo de cada linha de lquido, de modo que a partir do
ponto de confluncia a vazo seja constante. Nesse caso, diz-se que o processo ocorre
com gradiente de polaridade. Substituindo-se temperatura por polaridade, pode-se
utilizar os Cromatogramas 4.3 e 4.4 (p. 20) como ilustrao de processos isocrticos
com polaridades diferentes e o Cromatograma 4.5 como ilustrao de um processo
com gradiente de polaridade.
4.3. Detetores
4.3.1. Generalidades
23
Os detetores mais empregados so do tipo diferencial. A sua resposta (R),

dada pelas reas relativas dos picos, proporcional concentrao de cada componente
(detetores de condutividade trmica) ou velocidade de fluxo de massa do componente
(detetores de ionizao):
R = K1.C
R = K2.
dm
dt
Dentre os detetores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso, os
seguintes: detetor de condutividade trmica (DCT), detetor de ionizao de chama (DIC) e
detetor de ndice de refrao (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicao.
A escolha do detetor importante e depende do material a ser analisado.
As principais caractersticas dos detetores, que devem ser consideradas quando da seleo
do detetor mais apropriado, so as seguintes (ver Apndice 1, p 53):
- Sensibilidade
- Nvel de rudo
- Resposta
- Faixa de linearidade dinmica

- Custo/vida til
- Universalidade
- Especificidade / Seletividade
- Condutividade trmica (para DCT)
4.3.2. Detetores empregados em Cromatografia a Gs

a) Detetor de Condutividade Trmica (DCT)
O sistema de deteco por diferena de condutividade trmica consiste de
dois filamentos (clula para amostra e clula de referncia), os quais fazem parte de uma
ponte de Wheatstone (Figuras 4.4a e 4.4b). Faz-se passar corrente pelos filamentos e estes
perdem calor para o gs de arraste. No momento em que a amostra atingir a clula
correspondente, o filamento perder calor para a soluo (gs de arraste + amostra). Como a
soluo possui condutividade diferente, a temperatura do filamento alterada, o mesmo
ocorrendo com a sua resistncia eltrica. Essa variao na resistncia medida pela ponte.
Note-se que quanto maior for a concentrao do material analisado, maior ser a variao
na corrente e portanto maior ser o sinal (R = K.C).
A sensibilidade de um detetor de condutividade trmica pode ser avaliada pela equao:
S = KI2 .
(g - s)
. (Tf - Tb)
(eq. 8)
onde:
S = sensibilidade (mV.cm3/mg)
K = constante da clula
= condutividade trmica do gs de arraste

= condutividade trmica da substncia
I = intensidade de corrente
R = resistncia do filamento
24
Tf = temperatura do filamento
Tb = temperatura do bloco
IMPORTANTE ! Se a cmara do detetor contiver ar atmosfrico no momento em que o

circuito for energizado ocorrer queima do filamento. Portanto, deve-se primeiro fazer
circular o gs de arraste.
Figura 4.4.a - Bloco do Detetor de Condutividade Trmica.

b) Detetor de Ionizao de Chama (DIC)
A figura 4.5 representa o circuito eletrnico de um DIC. Rv uma
resistncia varivel, cujo valor depende do nmero de partculas entre os eletrodos. O
efluente da coluna, ao passar entre os eletrodos, ionizado. Nos DIC, a fonte de ionizao
a chama resultante da combusto de hidrognio com ar (gases auxiliares). A corrente
contnua gerada pela fonte (fonte CC, Fig 4.5.b) transportada do polarizador para o
coletor (Fig 4.5.a) por impurezas existentes na fase mvel ou por partculas de fase
estacionria lquida arrastada pela fase mvel, por exemplo. No amplificador existe outra
fonte de corrente, sendo esta varivel e de sentido contrrio, permitindo assim zerar a
corrente resultante no circuito. Quando um componente da amostra atinge o detetor, caso
possua tomos de carbono e tomos de hidrognio, entrar em combusto, sendo
ionizado. Com a ionizao, aumenta a corrente sada do coletor, o que ir gerar uma tenso
(V), a qual ampliada pelo amplificador eletromtrico e enviada ao
registrador/integrador. Evidentemente, a sensibilidade do detetor depender da facilidade
relativa de ionizao de cada componente da amostra.
25
Figura 4.4b- Diagrama Eletrnico do DCT
Fig. 4.5.a- Estrutura fsica de um DIC

c) Detetor de Captura Eletrnica (DCE)
Embora possuindo circuito semelhante ao de um DIC, o DCE, ao
contrrio daquele, mede a queda de corrente quando da passagem de amostra pelos
eletrodos (Rv). Uma fonte de 3H-1 ou de 63Ni ioniza as molculas do gs de arraste (N2),
liberando os eltrons responsveis pela corrente (corrente de fundo). Se uma substncia
capaz de absorver esses eltrons passar pelo detetor, haver uma queda na corrente,
resultando num sinal que tambm ser amplificado e enviado ao registrador.
Aqui, a sensibilidade do detetor depende da capacidade de absoro de
eltrons por parte dos diversos componentes da amostra.
26
Fig. 4.5.b- Circuito eletrnico de um DIC / DCE

d) Propriedades dos detetores
A Tabela 4.1 auto-explicativa e sumariza as principais propriedades dos
detetores, auxiliando no trabalho de seleo do detetor mais apropriado para uma anlise. O
Apndice 5 descreve outros detetores de uso menos extensivo, como o DNP.
Tabela 4.1 - Propriedades dos principais tipos de detetores empregados em CFG.
PROPRIEDADES
Limite de deteco
Faixa de linearidade
Vazo da fase mvel
Quant. Tpica amostra
Comp. Detectados
reas de aplicao
DCT
1 ppm
104
3
1-10 mL/min
1 - 40 L
todos
DIC
100 ppb
107
1-200 mL/min
0,05 - 5 L
orgnicos
uso geral
orgnicos
DNP
0,1 ppb
104
10-100 mL/min
1 - 5 L
nitrogenados e
fosforados
resduos de
pesticidas
DCE
0,1 ppb
102
10-100 mL/min
1 - 5 L
halogenados
resduos de
pesticidas
4.3.3. Detetores empregados em CLAD

Os detetores mais empregados em Cromatografia a Lquido de Alto
Desempenho (CLAD), embora existam outros tipos de detetores so:
a) Detetores de ndice de refrao
27
semelhana do detetor de condutividade trmica, o detetor de ndice de

refrao o mais antigo, menos sensvel e o nico universal, dentre os detetores
empregados em CLAD. Baseando-se na diferena de ndice de refrao entre a fase mvel e
cada componente da amostra, conhecem-se dois tipos de detetores IR:
Os detetores tipo deflexo utilizam como elemento ativo um diodo capaz de gerar
uma corrente contnua cuja intensidade proporcional ao ngulo de incidncia
da luz que atravessa a clula (Figura 4.6). Ao passar pela clula analtica uma
substncia com ndice de refrao diferente daquele da fase mve l, haver uma
alterao no ngulo de incidncia, resultando numa variao na intensidade de
corrente, que proporcional concentrao dessa substncia na clula e
consequentemente tambm proporcional sua concentrao na amostra.
Figura 4.6 - Detetor de ndice de Refrao tipo deflexo.

Os detetores tipo Fresnel baseiam-se no fato da luz incidente sobre o sistema mostrado
na Fig. 4.7 ser fracionada em dois feixes: uma parte da luz refletida e a outra parte
refratada. De acordo com a Lei de Fresnel, a relao entre essas duas fraes funo
do ndice de refrao. Assim, ao passar uma substncia (transportada pela fase mvel)
pela clula, altera-se o ndice de refrao e portanto o percentual de luz refratada.
Utilizando-se como foto-detetor um diodo sensvel intensidade de luz, a corrente
gerada por este ser alterada de um modo proporcional concentrao dessa substncia
na amostra.
b) Detetores de UV-VIS
Os detetores de ultravioleta-visvel (UV-VIS) baseiam-se na Lei de
Lambert-Beer, que estabelece uma relao linear entre Absorbncia e Concentrao:
A=.l.c
28
onde l o caminho tico (distncia percorrida pela luz dentro da soluo; espessura da
clula). A constante de proporcionalidade denomina-se absortividade molar. A
absorbncia, por sua vez, proporcional transmitncia, frao de luz transmitida.
Quando o contedo da clula (Fig. 4.8) transparente radiao
empregada (UV ou VIS), a transmitncia 100 % e evidentemente a absorbncia ZERO.
Entretanto, quando chega clula uma substncia que absorva essa luz, o
sistema de deteco mede a diferena em intensidade, gerando o cromatograma
correspondente.
Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de
radiao uma lmpada de mercrio, cujo comprimento de onda principal (90 % do total da
radiao) mede 254 nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento de
onda fixo (e nico). A Fig. 4.8 representa um diagrama esquemtico desse tipo de
instrumento. Como a regio til da radiao UV varia de 190 a 300 nm, de se esperar que
mesmos os compostos que absorvem luz UV no venham a ser detectados em um detetor do
tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir uma
varredura em toda a regio UV, primordial, evidentemente, que a fonte de radiao
(lmpada de deutrio) possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de
interesse (fonte no monocromtica). Desse modo, o instrumento (UV varivel) necessita de
um dispositivo que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar a
amostra com uma luz monocromtica. Esse dispositivo chama-se monocromador. Para se
operar na faixa visvel (400-750 nm), emprega-se uma lmpada de tungstnio.
Figura 4.7 - Detetor de ndice de Refrao tipo Fresnel.
Figura 4.8 - Detetor de Ultravioleta fixo
29
30
6 - ANLISE QUALITATIVA
O tempo de reteno (Tr) uma caracterstica fsico-qumica e como tal
permite que se faa anlise qualitativa, desde que se disponha de um padro. Na falta do
padro, necessrio coletar cada componente isoladamente e identific-lo por outros
mtodos analticos; espectrometria, por exemplo. Atualmente, so comercializados
cromatgrafos cujo detetor um espectrmetro de massas.
Quando uma amostra submetida anlise, preciso fornecer ao analista
alguns dados a respeito da mesma:
- Origem (de sntese, natural, etc ?).
- Componentes provveis (espcie, nmero).
- Composio quantitativa provvel.
- Faixa de ponto de ebulio (amostra lquida).
- Outros dados relacionados com as variveis do processo.
Quanto maior for o nmero de informaes, mais rapidamente o analista
encontrar as condies ideais de anlise.
Como existe apenas uma vazo ideal para cada coluna, resta ao analista
procurar a coluna e a temperatura (ou programao de temperatura) ideais.
Existem outros modos de efetuar a identificao, os quais sero estudados
mais adiante (Captulo 8).
31
6 - ANLISE QUANTITATIVA
6.1. Introduo
Para se determinar a composio de uma mistura (Anlise Quantitativa)
necessrio medir as reas relativas dos picos de todos os componentes. Entretanto, nem
sempre o nmero de picos igual ao nmero de componentes, pois alm da probabilidade
de ocorrer superposio, alguns componentes podero no ser detectados, o tempo de
anlise poder ser inferior ao tempo de reteno de um componente menos voltil, etc.
O uso de uma referncia (padro) permite, contudo, determinar a
percentagem de um dado componente, mesmo que no apaream os picos dos outros
componentes.
Antes de se efetuar o clculo da composio, entretanto, preciso fazer as
correes das reas, pois a relao das reas de dois componentes quase sempre diferente
da relao entre as suas massas (composio em massa). Isto porque a sensibilidade
(Resposta) de um detetor a duas diferentes substncias normalmente diferente.
Analisando a eq. 8 (p. 23), observamos que alm de outros fatores, a
sensibilidade dos detetores de condutividade trmica depende da diferena g - s Como s
varia de substncia para substncia, podemos dizer que uma mistura binria qualquer
contendo 50% de cada componente muito provavelmente ter uma relao de reas
diferente da unidade.
Com os detetores de ionizao de chama (e tambm com os de captura de
eltrons) existe esse mesmo problema, pois a facilidade de se ionizar (ou de capturar
eltrons) varia de substncia para substncia. Alis, essa afirmao vale para qualquer outro
tipo de detetor, inclusive aqueles empregados em Cromatografia a Lquido.
Assim sendo, vale a pena repetir, necessrio primeiro determinar os
fatores de resposta para as reas e s depois efetuar o clculo da composio.
6.2. Medio de rea

A rea de um pico pode ser medida por vrios mtodos, a saber:
i - Com auxlio de um planmetro.
ii - Por pesagem (recorta-se cada pico e pesa-se em balana analtica).
iii - Com auxlio de um integrador:
32
a) de disco (eletromecnico)
b) eletrnico
ou
iv - Determinao grfica:
a) S = h.L ou
b) S = h.L,
onde h a altura do pico, medida desde a linha de base at o pice do mesmo, L

a largura na base (distncia entre os pontos em que a linha de base interceptada
pelas tangentes traadas nos dois ramos da curva) e L a largura do pico na
metade de sua altura, como se v na Figura 6.1. Essas grandezas devem ser
medidas em milmetro.
O planmetro um dispositivo mecnico, articulado. medida em
que se percorre o permetro do pico, um ponteiro percorre uma escala. A leitura
ao final do permetro a rea do pico. O tra ado do integrador de disco
mostrado abaixo do pico, na fig. 6.1. O uso de um integrador permite determinar a
rea com um erro da ordem de 0,1%. Entretanto, os erros dos outros mtodos, em
torno de 0,5 - 1%, bastante aceitvel para a maioria das finali dades. Dado o alto
custo dos integradores, principalmente os eletrnicos, muitos Laboratrios ainda
utilizam o mtodo grfico. Atualmente, encontram-se no mercado vrias verses
de softwares (com a respectiva interface), que substituem com muitas vantagens
(inclusive de custo) os integradores eletrnicos.
A utilizao do planmetro exige habilidade do operador, de modo
que o erro poder ser bem maior que 1% (a preciso normalmente baixa). O
mtodo de pesagem, por sua vez, pouco empregado em virtude de exigir a
destruio do cromatograma. Dentre os mtodos grficos ( a e b), o da meia altura
(b) recomendado para os picos cuja linha de base no est bem definida e
tambm por causa da impreciso no traado das tangentes. Entretanto, a medio
de uma largura L (da ordem de 5 mm) muitas vezes acarreta um erro da mesma
magnitude do erro da medida de L, de modo que os dois processos, em geral,
podem ser considerados igualmente precisos. A experincia indicar, em cada
ocasio, qual mtodo dever ser empregado.
Se os picos no esto completamente separados, ao ponto de no se
poder medir a largura L, utiliza-se o mtodo a (S = h.L), medindo-se L do
seguinte modo (Fig. 6.2):
1) Traar, como na Fig. 6.1, a tangente do pico; mas s as mostradas na fig. 6.2;
2) A partir do ponto A (Fig. 6.2), traar uma vertical at cortar a linha de base;
3) L1 e L2 so as bases dos dois picos da Fig. 6.2 e as suas reas so h1L1 e h2L2.
33
Fig. 6.1 - Mtodo grfico para determinao de reas relativas em

cromatografia.
OBS.:
Essa tcnica pode ser empregada tambm nos casos
em que A fica abaixo de L e denominada CORREO VERTICAL.
Se o primeiro pico for muito menor que o segundo (Fig. 6.3), o
procedimento exatamente igual. Por outro lado, na situao inversa, a
medio da rea do segundo pico feita como mostrado na Fig. 6.4. Essa
segunda tcnica chama-se CORREO TANGENCIAL. Se houver um
outro pico sobre a cauda do primeiro e o ponto A estiver acima da
tangente, procede-se a uma correo vertical entre os dois pequenos.
Figura 6.2 - Correo vertical
Figura 6.3 - Correo vertical
Fig. 6.4 - Correo horizontal
6.3. Mtodos de Clculo

Os mtodos de clculo descritos a seguir j incluem a correo da rea.
a) Normalizao de rea
Usa-se um dos componentes da mistura como referncia. Seja uma
mistura das substncias S1, S2, ... , Sn e Sr, onde Sr a referncia.
A seguinte relao vlida para um cromatograma dessa mistura:
mr
mi
=
Ar
Aci
Aci =
mi
. Ar
mr
(eq. 9)
onde Aci a rea corrigida de uma substncia qualquer i. Por outro lado, podemos dizer que:
34
A ci A i. Fi
(eq. 10)
onde Fi o fator de correo. Igualando-se os segundos membros das equaes 9 e 10, fica:
Ai.Fi =
mi
. Ar
mr
ou
Fi =
mi Ar
.
mr Ai
(eq. 11)
OBS.: Para uma mesma soluo, mi / mr = Ci / Cr, logo Fi = Ci / Cr . Ar /Ai (eq. 11) aplicandose a eq. 11 a uma amostra de concentrao conhecida (mistura padro), encontra-se Fi. Ento, a
partir da eq. 10 (aplicada amostra de concentrao desconhecida), calculada a rea corrigida
Aci. Finalmente, a composio dada pela eq. 12:
Ci =
Aci
. 100
Aci
(eq. 12)
Quando todos os componentes de uma mistura pertencem a uma

mesma funo qumica, os fatores de correo (tambm denominados fatores de
converso - pois convertem a rea em concentrao ou massa - ou fatores de
resposta) so praticamente iguais. Assim, admitindo-se que F 1 = F 2 = ... = F n = F,
pode-se fazer F = 1 e a equao 12 simplifica-se:
Ci
Ai
. 100
Ai
(eq. 12)
O caso geral conhecido como Normalizao de rea com Fator de

Resposta (Norm %) e o caso particular (eq. 12) como Normalizao de rea sem Fator de
Resposta, ou simplesmente rea %.
b) Padronizao Interna
Para a determinao da composio de uma amostra pelo mtodo da
Normalizao de rea, necessrio que todos os seus diversos componentes sejam
detectados (a eq. 12 exige que sejam calculadas todas as reas: Aci). Entretanto, no fcil
ter certeza absoluta de que todos os componentes foram realmente detectados. Alm disso,
se apenas um nico componente interessa ao analista, a sua determinao a partir de uma
amostra com muitos componentes traria dois outros agravantes:
i) Todo trabalho de medio e clculo dos picos de interesse.
ii) A probabilidade maior de um outro componente ter o mesmo tempo de
reteno do componente de interesse.
35
Para resolver o problema (ii) o analista preferiria usar um detetor que se

possvel s detectasse o componente de interesse. Mas, como resolver o problema inicial ?
A resposta a essas questes est na adio amostra de uma substncia nova, com as
seguintes caractersticas:
- Solvel na amostra.
- Detectvel.
- Possuir Tr diferente de qualquer componente detectvel.
- No reagir com a amostra.
Essa substncia denominada de padro interno.
Seja uma soluo padro contendo todas as substncias de interesse e o
padro interno (Pi), cujas concentraes e reas sejam respectivamente:
Ai e Ci
- um componente qualquer de interesse.
APi e CPi - o padro interno.
As relaes Ci /Ai = Ri (eq. 13) e CPi /APi = RPi (eq. 14) do a resposta do
detetor para qualquer componente, inclusive P i. Numa mesma soluo, a relao Ri / RPi
constante e igual a Fi (comparar com a eq. 11).
Ci Api
.
= Fi
Ai Cpi
(eq. 15)
A adio do padro interno a uma amostra de concentrao desconhecida,

resulta em uma soluo para a qual so vlidas as relaes:
Ci'
= Ri
Ai'
(eq. 16)
C'Pi
= RPi
A 'Pi
(eq. 17),
equivalentes s equaes 13 e 14. Logo,
Assim,
C'Pi
C'i
.
F
i = Ri =
A 'Pi
A 'i
A 'i
C'i =
. C'Pi . Fi
A 'Pi
(eq. 18)
(eq. 19)
36
OBS.: A preciso desse mtodo, bem como a do mtodo a, independe do erro de

injeo, mas a preciso de ambos depende do erro na preparao dos padres.
c) Padronizao externa
Mais prtico que o mtodo anterior e no necessitando tambm da
deteco de todos os componentes da amostra, o mtodo do padro externo, entretanto,
depende do volume injetado, de modo que sua preciso influenciada pelo erro de injeo.
Considerem-se as equaes 13 e 16. Numa soluo de composio
conhecida (soluo padro) e numa amostra desconhecida, tm-se respectivamente:
Ci
= Ri
Ai
C'i
= Ri
A 'i
Igualando-se os dois primeiros membros, tem-se, tirando o valor de C 'i :
C'i = A 'i .
Ci
Ai
(eq. 20)
Como Ri constante, uma vez determinado o seu valor, a partir da soluo

padro e para cada componente de interesse, o analista ter apenas que aplicar a eq. 21:
C'i = A'i . Ri
(eq. 21)
OBS.:
1 - Os valores de Ri, obtidos num determinado laboratrio, podem ser tabelados,
ou fornecidos a um computador (integrador/processador), para agilizao das anlises.
Devido a alteraes na sensibilidade do detetor (variao na relao de fluxo dos gases
auxiliares no DIC, corroso, decaimento natural na fonte radioativa do DCE, etc.), os
valores de Fi (ou de Ri) devem ser recalculados periodicamente. O analista dever
determinar experimentalmente a periodicidade.
2 - O mtodo do padro externo (regra de trs simples) uma simplificao do
mtodo do padro interno (regra de trs composta), onde se faz V ip = Via , onde Vip o
volume injetado de soluo padro e Via o volume injetado da amostra. Portanto, a
preciso deste mtodo de clculo depende da percia do analista na medio do volume a
ser injetado.
d) Tcnica para fechar uma anlise
37
Muitas vezes necessrio fazer duas injees. Isso acontece quando uma
nica coluna no consegue separar todos os componentes e/ou um nico detetor no detecta
todas as substncias.
Considere-se o mtodo de Normalizao de rea e uma situao em que
um dos componentes aparece isolado nos dois cromatogramas. Como nas duas injees o
volume no foi exatamente o mesmo, haveria um erro grosseiro se as diversas reas dos
dois cromatogramas fossem somadas diretamente.
No exemplo a seguir, a amostra possui cinco componentes, sendo que os
componentes (1), (2) e (4) so quantificados no cromatograma A. Observa-se que (2)
aparece nos dois cromatogramas. Teoricamente as suas reas, nos dois cromatogramas (Aa2
e Ab2) seriam iguais. Na prtica, geralmente encontra-se Aa 2 Ab2 . Qualquer uma das
reas correta, de modo que A ou B pode ser tomada como referncia, indiferentemente.
Tomando o cromatograma A como referncia, tem-se:
A a2
= K
A b2
(para corrigir as reas no cromatograma B)
Aa1.F1 + Aa2.F2 + Ab3.K.F3 + Aa4.F4 + Ab5.F5.K =
Aci ,
onde Aci qualquer termo do 1o membro. A concentrao de qualquer componente

calculada a partir da eq. 12.
6.4. Seleo do melhor mtodo de clculo
Para se decidir sobre o melhor mtodo de clculo para uma dada amostra,
basta responder s questes apresentadas no Esquema 6.1.
Esquema 6.1 - Critrios para seleo do melhor mtodo de clculo.
38
39
7 - OTIMIZAO DO PROCESSO ANALTICO

7.1. Parmetros analticos
Conforme foi visto ao longo dos captulos anteriores, muitos fatores
influem no processo cromatogrfico. Essa influncia no aleatria, podendo portanto ser
controlada pelo operador, com o objetivo de otimizar o processo de separao.
A Tabela 7.1 mostra a importncia do correto dimensionamento de uma
coluna cromatogrfica, enquanto que a Tabela 7.2 mostra a influncia do volume injetado
sobre L (largura do pico na base; ver Fig. 2.14, p. 13), n e H (ver Fig. 2.13, p. 13). O
Grfico 7.1 mostra a relao entre C e nmax () e entre C e Hmin(), onde C a
concentrao da fase estacionria. O Grfico 7.2 mostra como esses parmetros (n e H)
variam com o comprimento da coluna (l).
A temperatura (T) modifica o tempo de reteno (tr). A variao do tr com
T no linear. A relao
tr / T
depende do composto em estudo e da faixa de temperatura empregada. A Tabela 7.3, o
Grfico 7.3 e os Cromatogramas 7.1.a,b e 7.2.a,b,c evidenciam essas afirmaes.
Finalmente, a Tabela 7.4 mostra que nmax, Hmin e Fo (vazo ideal) dependem inclusive da
granulometria do suporte.
Tabela 7.1 - Efeito do comprimento da coluna e da concentrao da FE sobre a eficincia.
l (m)
1
2
4
9
16
4
4
4
4
Coluna *
C (%)
10
10
10
10
10
1
2
5
20
m (g)
0,13
0,24
0,57
1,24
2,15
0,05
0,12
0,26
1,18
Vazo Ideal
Fo
(mL/min)
30+5
20+5
28+5
21+5
38+5
18+5
26+5
34+5
37+5
n x 10-3
H (mm)
0,8
1,4
4,3
8,0
16,0
1,9
2,0
2,7
3,3
1,25
1,43
0,93
1,13
1,00
2,11
2,00
1,48
1,21
(*) a) Fase estacionria: Apiezon L; DE = 1/8; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh
b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna.
40
Tabela 7.2 - Efeito do volume injetado sobre L, n e H.

L (mm)
7
9
11
12
Volume (L)
0,5
1,0
1,5
2,0
n
15.800
9760
6800
5270
H (mm)
1,01
1,64
2,35
3,03
Tabela 7.3 - Efeito da temperatura sobre o tempo de reteno

Composto
n-pentano
n-hexano
n-heptano
n-octano
70oC
1,60
3,29
7,38
18,88
100oC
1,17
1,93
3,65
7,08
130oC
0,85
1,23
1,92
3,25
160oC
0,68
0,77
1,35
2,00
A partir dessas informaes possvel estabelecer, por exemplo, para uma

coluna com 1/8 de dimetro externo (coluna analtica), que:
Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, nmax funo linear de l.
O valor de nmax aumenta, quando diminui a granulometria do suporte.
O valor de nmax varia com C, sendo mximo quando C = 12 %, para suporte com faixa
de granulometria de 60-80 mesh ( malhas por polegada linear; equivale a um
dimetro de partcula de 175-230 mm).
A faixa de vazo ideal no varia com a temperatura.
41
O tempo de reteno diminui de maneira no linear com o aumento da temperatura; a

relao tr / T varia com a natureza do composto e o intervalo de temperatura
considerado.
7.2. Projetando um mtodo analtico
Para se projetar um novo mtodo analtico por cromatografia, so

necessrias vrias avaliaes, relacionadas a seguir:
Seleo do tipo de cromatgrafo (a gs ou a lquido);

Seleo do detetor, em funo dos compostos a serem analisados e de suas concentraes;
Parmetros de funcionamento do detetor;
Seleo da coluna:
natureza da Fase Estacionria (e sua granulometria, caso seja slida);
dimenses da coluna (comprimento e dimetro);
concentrao da Fase Estacionria (FE), natureza e granulometria do suporte, no
caso de FE lquida;
Seleo da temperatura (ou programao de temperatura) para a coluna, no caso de CFG;

Seleo do Gradiente de Polaridade, se necessrio, no caso de CFL (HPLC);
Determinao do Limite de Deteco (LD) e da Faixa de Linearidade Dinmica (FLD);
Determinao dos Fatores de Resposta;
Determinao das demais condies de anlise: volume injetado, tcnica de injeo,
atenuao (se no dispuser de sistema de integrao), temperatura do vaporizador (em
CFG) e do detetor e vazo da fase mvel (ou gradiente);
Concentrao dos componentes na soluo padro, natureza do solvente empregado e
tcnicas de amostragem e de preparao da amostra e da soluo padro;
Mtodo de clculo utilizado;
Nmero mnimo de determinaes em paralelo e erro mximo (reprodutibilidade);
Avaliao do erro estatstico global, associado s diversas operaes (preparao de
solues, tcnica de amostragem, tcnica de injeo e medio de rea); expresso do
resultado final;
Observaes:
a) na seleo do detetor, verificar se o material a ser analisado detectvel por ele e se
o seu Limite de Deteco compatvel com a faixa de concentrao de interesse
(ver, por exemplo, a Tabela 4.1 na p. 26);
b) na avaliao dos erros estatsticos, considerar todas as operaes envolvidas, tais como
pesagem, medio de volume, diluio, tcnicas de amostragem e de injeo, etc;
42
c) para clculos estatsticos, utilizar o Apndice 6 (ver Seo 7.3).;

d) em relao aos diversos mtodos de clculo, lembrar que:
Mtodo
rea %
Norm %
P. Ext.
P. Int.
(1)
prep.
Padro
No
Sim
Sim
Sim
prep.
Amostra
No
No
No
Sim
injeo
No
No
Sim
No
comp. No
detectados
Sim
Sim
No
No
como medida da rea; (2) dentro de uma faixa mais ou menos estreita de concentrao.
altura(1)
Sim
Sim
No(2)
No(2)
43
Tabela 7.4 Efeito da granulometria do suporte sobre a eficincia
Malha/polegada
nmx
60-80
4300
80-100
4600
100-120
5700
D.E. = 1/8; l = 4 m; C = 10 %
Hmn
0,93
0,87
0,70
Fo (mL/min)
20
20
24
44
7.3. Validao de um mtodo analtico

7.3.1. Objetivo
A identificao por Cromatografia (a gs ou a lquido) feita por
comparao dos tempos de reteno, para uma dada substncia, entre uma soluo
padro e a amostra. Entretanto, sabido que num determinado sistema
cromatogrfico (Fase Mvel, Fase Estacionria e Detetor), mesmo empregando-se
como fluxo da Fase Mvel aquele encontrado por ser o ideal (de acordo com os
experimentos de van Deemter), no nula a probabilidade de outro componente da
amostra apresentar o mesmo tempo de reteno que o da substncia de interesse.
Validar um mtodo analtico consiste em garantir que nas condies analticas, a
substncia-problema e apenas ela apresenta aquele tempo de reteno. Evidentemente
um mtodo validado deve ser operacionalizado atravs de um manual (Norma), o qual
determina
condies
padronizadas
que
garantam
a
sua
repetibilidade/reprodutibilidade. Deve ser enfatizado que um determinado mtodo
analtico validado para um determinado tipo de amostra no necessariamente vlido
para outro tipo de amostra (ex.: dosagem de um princpio ativo existente em um
determinado medicamento versus a mesma determinao nas vsceras do cadver de
uma suposta vtima de super-dosagem), posto que outro tipo de amostra pode conter
outras substncias tambm passveis de ser detectadas no mesmo tempo de reteno do
analito e que no tenham sido includas na pesquisa de validao.
7.3.2. Conceitos
Com o objetivo de garantir uma correta compreenso deste texto,
so apresentados a seguir os termos tcnicos aqui empregados, com suas
respectivas definies.
Nome
notao
Analito
Amostra
Padro
United States Pharmacopea USP
Concentrao
c
Soluo Estoque
SE
Soluo Intermediria
SI
Soluo de Trabalho
ST
descrio
Substncia-problema.
Qualquer material, independentemente de
sua origem, que contenha o analito.
O analito, comercializado com alta pureza.
Farmacopia Americana. Fonte de consulta.
Concentrao do analito (ou do padro).
Soluo do padro a alta concentrao
(pode ser guardada por alguns meses,
dependendo da natureza da substncia).
Soluo do padro, necessria para se
chegar Soluo de Trabalho.
Soluo do padro com concentrao
Faixa de Linearidade
FL
Curva de Calibrao
Coeficiente de Correlao r
Faixa de Trabalho
FT
Limite de Deteco do
Equipamento
Limite de Deteco da
Amostra
Limite Efetivo
LDE
Seletividade
Resoluo
Preciso
Rs
Exatido
Recuperao
Repetibilidade
Reprodutibilidade
LDA
LE
45
semelhante ao que se espera da amostra.

Intervalo de concentrao em que existe
relao linear com a rea do pico.
Curva construda com os dados da Faixa de
Trabalho.
Parmetro que mede a preciso com que a
Curva de Calibrao relaciona as reas com
as respectivas concentraes. usado para
avaliar o fim da regio linear na construo da
FL.
Intervalo contido na FL, compreendendo as
concentraes usuais da amostra.
Concentrao mnima detectvel do analito
no extrato injetado.
Concentrao mnima detectvel do analito na
amostra.
Concentrao mnima do analito que
corresponde a um erro mximo aceitvel.
Capacidade de separar a substncia-problema
dos demais componentes da amostra.
Mede a seletividade.
Avalia a rep etib ilid ad e o u a
reprodutibilidade de um mtodo analtico,
por medida da 1a ou da 2a estimativa do
desvio padro (Apndice 6).
Grau de fidelidade com que o resultado
exprime o valor real da concentrao do
analito. Avaliado com auxlio do teste t1 (de
Student), por comparao com uma soluo
padro (Apndice 6).
Nos casos em que se faz uma extrao,
necessrio determinar o percentual de
extrao e sua repetibilidade. Recomendase que a soluo padro seja submetida
mesma operao.
Mede a disperso dos resultados obtidos por
repetio da anlise, num mesmo Laboratrio,
com o mesmo equipamento e mesmo analista.
Ver Preciso.
Mede a disperso dos resultados obtidos por
repetio da anlise, em diferentes Laboratrios,
diferentes equipamentos ou diferentes analistas.
46
Usa o teste F (Apndice 6).

Mede a influncia sobre a repetibilidade,
das diversas operaes constantes do
mtodo.
Mede a influncia sobre a Reprodutibilidade,
das diversas operaes constantes do mtodo.
Consistncia
Robustez
7.3.3. Procedimento
a) Seletividade / Identificao
A principal fase do trabalho aquela em que testada a confiabilidade da
identificao. Isso inclui a determinao do tempo de reteno de toda e qualquer
substncia que possa eventualmente existir na amostra, quais sejam:
impurezas de sntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poder ser bastante penoso);
impurezas de degradao (essas informaes podem ser obtidas de estudos shelf-life);
excipientes, conservantes, aditivos e outros princpios ativos constantes da formulao (no
caso de associaes);
Deve ser lembrado que a identificao pura e simples por
cromatografia (mtodo no validado) no tem valor cientfico. Assim, o ideal, o
recomendado mesmo, associar tcnica cromatogrfica, a tcnica de Espectrometria
de Massas. Essa associao pode ser manual, atravs da separao fsica, por coleta
na sada da coluna, seguida da obteno do espectro de massas. A identificao
pode ser ainda complementada com auxlio de outra tcnica analtica, como a
Espectrometria de Ressonncia Magntica Nuclear, Espectrofotometria no
Ultravioleta-Visvel ou a Espectrofotometria no Infravermelho. Atualmente existem
cromatgrafos (CFG ou HPLC) acoplados a um espectrmetro de massas, o qual
substitui o detetor tradicional do cromatgrafo.
Embora os exemplos aqui apresentados sejam tpicos da indstria
farmacutica, os diversos procedimentos so igualmente aplicveis a qualquer outro tipo de
amostra. De um modo geral, produtos de sntese (de uso farmacutico ou no) podem ter
seu mtodo analtico validado sem auxlio da espectrometria (embora seu emprego d maior
credibilidade validao). Por outro lado, qualquer outro material (inclusive de uso
farmacutico) exige a associao de mtodos espectromtricos.
J se sabe que a eficincia (n) de uma coluna diretamente proporcional
ao tempo de reteno. Portanto, quanto maior for o tempo de eluio, maior ser a sua
eficincia. Assim, a seletividade pode ser medida como a razo dos tempos de reteno:
47
= tr1/tr2
Essa relao tambm denominada reteno relativa (p. 12) ou ainda fator de separao e
demonstra-se que equivalente s relaes dos coeficientes de partio:
= kp1/kp2
Entretanto, esse critrio algo insatisfatrio, posto que colunas com diferentes eficincias
podem apresentar mesmos fatores de separao, conforme pode ser visto na Figura 7.1.a,b.
Porisso, em vez da seletividade, emprega-se a resoluo (Rs), como medida efetiva da
capacidade de separao:
Rs = 2(tr2 tr1)/(L1 + L2)
ou seja, a resoluo igual diferena entre os tempos de reteno dividida pela mdia da
larguras na base (Figura 2.14, p. 13).
bvio que a resoluo diminui com o alargamento do pico e
evidentemente tambm diminui se a cauda, resultante de uma interao excessiva com a
fase estacionria, bastante pronunciada (Figura 7.2). Essa deformao do pico deve ser
considerada quando da seleo da coluna. Chama-se fator de deformao ou fator de
assimetria (TF, do ingls tailing factor) a relao
TF =
BC
AB
onde a distncia BD igual a 10 % da altura do pico ( DE ). O TF mximo admissvel 3.
48
Figura 7.2 Pico com cauda (deformao)

Figura 7.1 Resoluo a) baixa; b) alta
b) Detalhamento da Metodologia
A metodologia analtica inclui todos os parmetros explicitados na Seo
7.2 (pgina 41).
c) Avaliao estatstica
Para realizao dos testes estatsticos, sugere-se que qualquer
operao (preparao da soluo padro, tomada de alquotas, etc) seja realizada
em triplicata (ou mais) e que cada soluo obtida seja injetada pelo menos cinco
vezes. Nesses casos, deve ser empregada a 2 a estimativa do desvio padro (s R ;
Apndice 6). A 1 a estimativa (s) s deve ser empregada em conjuntos de dados
com mais de 10 itens.
d) Exemplo
A seguir, apresentado um exemplo, para ilustrar toda a operao. Para
este exemplo, foi selecionado o produto aspirina. A aspirina comercializada em vrias
formas, sendo selecionado como amostra o comprimido.
A aspirina (cido acetilsaliclico) produzida industrialmente a partir do
cido saliclico:
49
Desse modo, de se esperar que o precursor (AS) seja um contaminante

comum no produto (AAS). Consequentemente, o AS uma das substncias que devem ter
seu tempo de reteno medido, para verificar se coincide ou no com o do AAS.
Uma vez completada a etapa de identificao (vale repetir: confirmao
de que nada que eventualmente possa estar presente na amostra apresente o mesmo tempo
de reteno do AAS), parte-se para as avaliaes estatsticas.
i. Condies analticas:
Cromatgrafo a lquido modelo CG 480E, com detetor de ultravioleta CG 437B.

Comprimento de onda: 254 nm.
Coluna: RP-18, 250 mm X 4,6 mm, 10 m; temperatura ambiente.
Fase Mvel: H2O:Metanol:cido Actico (46:52,5:1,5); 1,5 mL/min (isocrtico).
Preparao das solues padro (para AAS e AS):

A soluo estoque foi de 500 mg/100 mL. As demais solues foram de 200, 100, 20, 10 e
5 mg/100 mL.
Preparao da amostra:
A partir de 5 comprimidos pulverizados em almofariz, foi tomada uma alquota pesando 55
mg (10% do peso mdio de um comprimido). O material foi dissolvido em 10 mL da fase
mvel, com auxlio de ultra-som e em seguida filtrado (0,46 m).
Injeo da amostra: vlvula Rheodyne, com loop de 20 L.
ii. Faixa de Linearidade e Limite de Deteco
As solues padro foram injetadas em triplicata, sendo que a mais diluda foi injetada
dez vezes. A partir da mdias das reas obtidas, foram construdas as respectivas Faixas de
Linearidade (Grficos 7.4 e 7.5), onde evidencia-se que as massas injetadas conforme prescrito
em Preparao da amostra permanecem dentro da regio linear. O rudo (medido com
50
atenuao mnima necessria para uma altura no inferior a 5 mm) foi de 7 mm, o que por
comparao com a mdia das alturas dos picos das dez injees da soluo mais diluda resultou
em um Limite de Deteco (para AAS e AS), da ordem de 0,3 mg/100 mL.
400
8,0x10
300
rea do pico
rea do pico
6,0x10
4,0x10
r = 0,99996
2
2,0x10
200
r = 0,99999
100
0,0
0
0
500
1000
1500
2000
100
Concentrao (mg/L)
200
300
400
500
Concentrao (mg/L)
Grfico 7.4 FLD do AAS.
Grfico 7.5 FLD do AS.
iii. Preciso e expresso dos resultados

A partir dos dados (reas) das dez injees da soluo mais diluda referida no
item ii acima, pode ser calculado o erro analtico (de repetibilidade) e a partir deste (1,2%),
determinar a forma correta de expresso do resultado (vlida para ambos os compostos):
Re = X 0,01 mg/L
51
8 TCNICAS ADICIONAIS DE IDENTIFICAO

8.1. Tempo de reteno e reteno relativa
A identificao feita tradicionalmente atravs da medio do tempo de
reteno (tr). Entretanto, a essa forma de medio est associado um erro, decorrente de
uma natural variao no tempo transcorrido entre a injeo e o acionamento do sistema de
registro. Esse erro costuma ser da ordem de 2 % em relao ao tempo de reteno.
pequeno demais, na maioria das vezes. Mas h casos em que a diferena de t r entre dois
componentes dessa mesma ordem de grandeza. Em tais casos recomendvel o emprego
da Reteno Relativa (RR). Um dos componentes tomado como referncia (RR = 1) e as
RRs dos demais so calculadas com auxlio da relao:
RRb = trb/tra ,
onde tra e trb so, respectivamente, os tempos de reteno da referncia e de outro componente.
8.2. ndice de reteno
Outro parmetro utilizado para identificao, o ndice de Reteno (Ir)
determinado experimentalmente a partir do cromatograma da mistura do desconhecido (i)
com duas parafinas normais com n e m (m = n + 1) tomos de carbono, desde que:
Vrn < Vri <Vrm onde Vr = volume de reteno = F.tr
A relao
pode ser substituda por:
Nesse sistema, assume-se que:
Padres para determinao do Ir :

a) como visto acima, as parafinas normais so, por definio, padres primrios,
com I r = 100n.
b) em qualquer srie homloga com mais de 5 tomos de carbono, o I r cresce de 100
unidades para cada CH2 adicional e no influenciado pela temperatura. Esses
compostos podem, portanto, ser utilizados como padres secundrios.
52
8.3. Equivalncia entre fases estacionrias

conhecida a relao
I pri I nri onde I pri e I nri so, respectivamente,
os ndices de reteno de um composto i numa fase polar qualquer e numa fase estacionria
no polar tomada como referncia (geralmente esqualano), medidos a uma mesma
temperatura. Essa relao permite avaliar a influncia, na separao, da fase estacionria e
de grupos substituintes presentes na molcula da substncia considerada.
McReynolds, baseado em trabalho inicial de Rohrschneider, tomou cinco
compostos como referncia e associou o somatrio dos seus valores de I com a polaridade
da fase estacionria, chegando a classificar centenas de fases estacionrias. A Tabela 8.1
apresenta alguns exemplos (observe-se que as FEs esto colocadas em ordem crescente de
polaridade). Os valores de I, denominados constantes de McReynolds, foram
determinados a 120oC. Os valores de Ir para os cinco compostos, com a fase estacionria
esqualano, so: benzeno, 653; n-butanol, 590; 2-pentanona, 627; nitropropano, 652 e
piridina, 699. Por comparao entre os nmeros de McReynolds de duas diferentes fases
estacionrias, possvel concluir se as mesmas so equivalentes ou no. possvel tambm
prever como melhor uma separao, comparando-se a natureza de duas substnciasproblema com duas das cinco substncias tomadas como referncia.
Tabela 8.1 Valores do Nmero de McReynolds (I) para algumas fases estacionrias.
FASE
ESTACIONRIA
Esqualano (*)
Nujol
Apiezon L
SE-30
SE-52
Hallcomid M-18 OL
QF-1
Carbowax 20M
Diglicerol
DEGS
TCEP
A
0
9
32
15
32
89
144
322
371
492
593
VALORES DE I
C
D
E
0
0
0
0
5
2
6
11
22
15
32
42
53
44
64
41
72
65
98
67
280
143
239
165
233
355
463
305
536
368
572
510
826
560
676
854
733
581
833
791
857
752 1028
915
9 BIBLIOGRAFIA(*)
1. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold, Holland. 1967.
I
0
33
143
217
334
916
1500
2308
3287
3430
4145
53
2. Ciola, R. Fundamentos da Cromatografia a Gs. Ed. Edgard Blcher Ltda., So Paulo, 1985.
3. Ciola, R. Tpicos em Cromatografia a Lquido. Inst. Cientficos C. G. Ltda., So Paulo, 1984.
4. Hadden, N. e Col. Basic Liquid Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1971.
5. McNair, H. e Bonelli, E. Basic Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1968.
6. Basics of Liquid Chromatography. Spectra-Physics, Cal. USA, 1977.
7. Fundamentals of Gas Analysis by Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1977.
8. Schuler, A. Caderno de Prticas de Cromatografia. Depto. Eng. Qumica/UFPE, 1994.
(*) A Literatura aqui apresentada serviu de base para a elaborao deste texto e recomendada
queles que pretendem aprofundar-se na matria.
54
10 APNDICE 1
Caractersticas bsicas dos detetores
10.1. Sensibilidade
A sensibilidade de um detetor medida pela sua Resposta, que a
magnitude do sinal recebido pelo Sistema de Aquisio de Dados (Registrador
potenciomtrico, Integrador ou Software), sob a forma de rea do pico. Assim, quanto
maior for a rea do pico de uma mesma amostra, maior ser a sensibilidade do detetor
empregado.
10.2. Nvel de rudo
O rudo uma caracterstica indesejvel dos detetores, ou melhor, de
qualquer dispositivo eletrnico. No caso do cromatgrafo, o rudo devido a um
conjunto de fatores, tais como:
- impurezas dos componentes eletrnicos
- mau contato em cabos e conectores
- interferncias na rede eltrica
- sangramento da coluna
- defeitos em circuitos eletrnicos
- contaminao na vlvula de amostragem
- contaminao no septo da coluna
- contaminao no detetor
- vazamento de fase mvel
- contaminao na coluna
Essas causas podem ser removidas, exceto a primeira, que depende

no s da qualidade do produto, mas tambm de suas caractersticas prprias. Assim,
existe um nvel mnimo de rudo que no pode ser removido. Evidentemente, um pico
com altura igual do rudo no poder ser reconhecido como tal. O rudo faz com que
a linha de base no seja uma reta perfeita, mas algo parecido com o traado mostrado
na Fig. 10.1.
Fig. 10.1. Linha de base com rudo.

10.3. Limite de Deteco
Limite de Deteco (LD), ou Quantidade Mnima Detectvel (QMD),
como o prprio nome o diz, a massa mnima injetvel que produza um pico que
possa ser identificado como tal. Por definio, LD uma massa cujo pico tenha uma
altura igual ao dobro da altura mdia do rudo (hr, Fig. 10.1).
10.4. Faixa de Linearidade Dinmica
55
Entende-se por Faixa de Linearidade Dinmica (FLD) o intervalo

compreendido entre a Quantidade Mnima Detectvel (QMD) e a massa mxima injetvel
cuja Resposta ainda seja linear. A Fig. 10.2 ilustra a situao. A linha vermelha
compreende a regio linear. Alguns detetores, possuem uma faixa ampla (DIC), enquanto
outros apresentam linearidade numa faixa bem mais estreita (DCE). Alguns operam com
massas altas (DCT, DIR), enquanto outros s apresentam linearidade a altas diluies
(DCE, DUV). Para se determinar a FLD
de um detetor, em relao a um
determinado composto, necessrio
preparar solues dentro do intervalo de
interesse e montar um grfico equivalente
ao apresentado na Fig. 10.2. Em seguida,
o analista deve calcular o coeficiente de
correlao (r; Apndice 6) para todos os
pontos e depois recalcular o coeficiente de
correlao aps retirar, sucessivamente, os
pontos n, (n-1), (n-2), etc, at que o valor
de r permanea estvel e prximo de 1.
No tendo havido erro grosseiro na
preparao das solues, nas injees,
Figura 10.2 Faixa de Linearidade Dinmica.
nem nas medies de reas, deve-se
encontrar um valor de r maior ou igual a
0,999.
56
11. APNDICE 2
Tcnicas de introduo da amostra
Tradicionalmente a amostra (slido em soluo, lquido ou gs)
introduzida com auxlio de uma microseringa (Figura 11.1). Em Cromatografia a Gs
(CFG), exceto com colunas capilares ou megabore (ver abaixo), recomenda-se injetar de 3
a 5 microlitros (L), sendo que o erro de medio inversamente proporcional ao volume.
Figura 11.1 Microseringa para amostras lquidas em CFG

Em se tratando de amostras gasosas, existem duas outras tcnicas:
seringa especial para gases (seringas gas-tight, que previnem contaminao ou
diluio da amostra com ar), que utilizada quando a amostra no est pressurizada e
a vlvula injetora de sete vias (Figura 11.2).
Em Cromatografia a Lquido (HPLC), a amostra (lquido ou slido em
soluo) introduzida com auxlio de uma seringa numa vlvula equivalente vlvula
da Figura 11.2, sendo do tipo rotativa e resistente alta presso empregada neste tipo
de equipamento. Ambas as vlvulas encarregam-se de medir o volume injetado, que
varia de umas poucas dezenas de microlitros (HPLC) a 1 2 mL (CFG).
No caso de colunas capilares (ou megabore), o volume mximo
injetvel muito pequeno para ser medido por uma microlitros (0,01 a 1 L). Alm
disso, o dimetro das mesmas to pequeno ( 0,53 mm) que a injeo no pode ser
feita diretamente na coluna, como acontece com as colunas de maior dimetro (CFG).
Nesses casos, necessrio um injetor especial, onde a amostra, uma vez vaporizada,
dissolvida na fase mvel e esta soluo sofre uma diviso (divisor pneumtico), de
modo que 1/100 ou uma frao ainda menor realmente enviada para a coluna,
enquanto que o restante descartado.
Figura 11.2.a Vlvula de injeo de amostra gasosa (posio carga)
Figura 11.2.b Vlvula de injeo de amostra gasosa (posio injeo)
57
58
12. APNDICE 3
Sistemas de aquisio de dados
Mesmo na atualidade ainda so empregados registradores para a
aquisio dos dados cromatogrficos. Qualquer que seja o detetor empregado (CFG ou
HPLC), o sinal gerado pelo mesmo uma tenso (corrente contnua). Trabalhando-se com
registrador, obtm-se um grfico (cromatograma), com auxlio do qual so medidos os
tempos de reteno e as reas dos diferentes picos. O tempo gasto nesse trabalho muito
grande e o erro s vezes bastante expressivo (5 a 10 %).
O integrador eletromecnico realizou uma verdadeira revoluo na
Cromatografia, particularmente em laboratrios de Controle de Qualidade, acelerando e
aumentando bastante a preciso do trabalho analtico (erro da ordem de 0,5 %).
Com o desenvolvimento da eletrnica, alguns registradores passaram a ser
comercializados com um integrador eletrnico cujo registro grfico era igual ao do
integrador eletromecnico, de modo que no houve diminuio visvel no erro de
integrao, pois a leitura continuava sendo analgica. Mas logo em seguida surgiram os
verdadeiros integradores eletrnicos. Os primeiros limitavam-se a imprimir a rea medida.
Os clculos eram ainda realizados pelo analista, embora com uma preciso na integrao
(medida da rea) da ordem de 0,001 %. A Segunda gerao de integradores veio
complementar o trabalho. Aps a integrao, o equipamento, utilizando o mtodo de
clculo previamente selecionado pelo analista, realizava a operao final, chegando a
imprimir a concentrao na unidade desejada. Esses equipamentos denominam-se
integradores-processadores. Alguns, mais sofisticados, imprimem o cromatograma, em
tempo real, utilizando os recursos de correo vertical e correo tangencial e inclusive
realizando clculos ps-anlise (geralmente em BASIC), alm de automatizar o
acionamento de vlvulas. Na realidade esses integradores de ltima gerao so
computadores dedicados. Seu alto custo, aliado a uma curta vida tecnolgica, decretou o
fim desses equipamentos.
Na atualidade, os laboratrios de cromatografia esto substituindo os
integradores por softwares bastante completos e sofisticados, que com auxlio de um
microcomputador tipo PC e de uma interface, realizam o trabalho do integrador com a
mesma eficincia, a um preo bem menor, alm de poderem monitorar at quatro
cromatgrafos de um modo totalmente independente.
59
13. APNDICE 4
O desenvolvimento cromatogrfico
As Figuras 1.1 (p. 1) e 2.1 (p. 3) mostram, respectivamente, a distribuio
das partculas slidas (fase estacionria slida ou suporte, no caso da fase estacionria
lquida) dentro de uma coluna empacotada e o processo de separao a nvel molecular
(pictoricamente). Na Seo 2.2 (p. 4) dado um pequeno tratamento matemtico ao
processo de separao por partio, quando ento h referncia a etapas ou pontos de
equilbrio. Entre as pginas 6 e 7 oferecida uma pequena discusso a respeito do que
acontece numa coluna de cromatografia clssica (fase estacionria slida), quando faz-se
referncia a uma coluna desenvolvida. No final da Seo 2.5, ao discutir as Figuras 2.13 e
2.14 (p. 13), feita referncia ao nmero de pratos tericos (n), como medida da eficincia
(capacidade de separao) de uma coluna cromatogrfica. Finalmente, no Captulo 3 (p.
14), apresentada a equao de van Deemter e seus diversos parmetros so discutidos.
O processo de separao cromatogrfica pode ser analisado, por analogia,
como uma destilao fracionada. No projeto de uma coluna de destilao contnua, o
engenheiro qumico calcula em que pontos devem ser colocadas bandejas (pratos) para a
retirada de fraes de diferentes pontos de ebulio. Numa destilao em batelada no
existem essas bandejas, mas evidentemente o clculo o mesmo. Como no existem pontos
de remoo ao longo da coluna, tudo sai pelo topo da mesma, na ordem crescente do ponto
de ebulio. O mesmo acontece com a cromatografia. A diferena que outros fatores
tambm interferem no processo, tornando-o mais complexo, porm tambm mais completo,
mais eficiente. Assim, enquanto uma coluna de destilao contm cerca de 40-60 bandejas,
uma coluna de cromatografia possui algumas centenas ou mesmo milhares de bandejas
(pratos tericos).
Cada componente da amostra, com diferente coeficiente de partio (ou
de adsoro), movimenta-se ao longo da coluna, transportado pela fase mvel, com uma
velocidade mdia diferente: quanto maior for sua afinidade com a fase estacionria (ou
menor com a fase mvel), maior ser o coeficiente e portanto maior ser seu tempo de
residncia (tempo de reteno) na coluna, ou seja, menor ser sua velocidade mdia. O
material eludo comporta-se como um pisto mvel, com concentrao mxima nas
proximidades da parte central e distribuio de concentrao quase gaussiana. medida em
que o tempo passa, a largura do pisto aumenta (por efeito da difuso), de modo que se o
tempo de eluio for muito grande, os picos coalescem e a separao ser incompleta (ver
Figura 2.9, vazo V1, na pgina 10). Por outro lado, se o tempo for muito curto, (vazo V 4
da Figura 2.9), pode ser insuficiente para permitir separao completa. Esse raciocnio
levou elaborao da equao abaixo, para o clculo da eficincia de uma coluna
cromatogrfica (Fig. 2.14, p. 13):
n = (4Dr/L)2
60
Pictoricamente, uma mistura de trs componentes apresentaria o

comportamento mostrado na Figura 13.1 e a distribuio de concentrao (ou de massa) de
cada componente mostrada na Figura 13.2. Observe-se que a Figura 13.2 no um
cromatograma. A substncia que sai primeiro da coluna a primeira a atingir o detetor. Do
mesmo modo, a primeira poro de cada componente a atingir o detetor a da extremidade
direita (na Figura). O cromatograma, por outro lado, traado da esquerda para a direita
(neste livro). Assim, enquanto a Figura 13.2 mostra uma cauda frontal, o cromatograma
correspondente mostraria uma cauda no ramo negativo (descendente) do pico de cada
componente.
Figura 13.1 Desenvolvimento cromatogrfico de uma

mistura ternria.
Figura 13.2 Distribuio de massa.
61
14. APNDICE 5
Outros detetores empregados em Cromatografia
14.1. Detetor de Nitrognio e Fsforo (DNP)
O DNP um detetor utilizado em cromatografia a gs e foi projetado
especificamente para a deteco de compostos nitrogenados (N) e fosforados (P) a nvel de
traos (concentraes da ordem de ppb). Tambm conhecido como detetor termoinico, o
DNP utiliza uma eletrnica (e o prprio hardware) equivalente ao DIC, inclusive com os
mesmos gases (Nitrognio como fase mvel e Hidrognio e Ar Sinttico como gases da
chama). O polarizador contm uma pastilha alcalina e a razo de fluxos dos trs gases (que
diferente para compostos nitrogenados ou fosforados) insuficiente para produzir chama,
mas o potencial eltrico estabelecido no local gera um estado de plasma, que aumenta de 1 4105 a sensibilidade do detetor frente a esses compostos, relativamente a outros compostos.
Devido a essas caractersticas, o DNP dito seletivo para compostos nitrogenados e
fosforados, unicamente para solues extremamente diludas, sendo portanto ideal para a
deteco de traos de pesticidas organo-clorados e organo-fosforados.
14.2. Detetor Fotomtrico de Chama (DFC)
O DFC basicamente um detetor de ionizao de chama, no que diz
respeito ao hardware. Entretanto, a deteco baseia-se na absoro da radiao emitida pelo
enxofre (e tambm pelo fsforo e ainda outros elementos) na regio visvel do espectro
eletromagntico. Trata-se portanto de um espectrofotmetro, obedecendo assim Lei de
Beer. A radiao emitida pela chama atravessa um filtro, o qual seleciona o comprimento de
onda desejado (394 nm para o enxofre e 526 nm para o fsforo). Para compostos contendo
um desses elementos, sua sensibilidade da mesma ordem de grandeza do DNP, sendo
portanto indicado para a deteco de traos (ppb) de pesticidas fosforados e sulfurados.
14.3. Detetor de ons
At os anos 70 a Cromatografia Instrumental apenas no era empregada
na anlise de ons (ctions e nions). Posteriormente foi observado que o bombeamento em
paralelo de um reagente complexante poderia transformar o on em um derivado (na sada
da coluna), colorido, o qual seria detectado num espectrofotmetro (ex.: detetor UV-VIS).
A separao cromatogrfica de ons, no discutida neste livro, ocorre
numa coluna contendo uma resina trocadora de ons apropriada, tratando-se portanto de
uma tcnica bastante antiga, mais largamente empregada na purificao de guas
(deionizao). O equipamento , em ltima anlise, um HPLC tpico.
Para evitar o trabalho de derivao, foi desenvolvido um detetor
especfico, o detetor de ons, que , em ltima anlise, um condutivmetro. Consta de um
62
par de eletrodos contidos numa clula termostatizada. Aplica-se um campo eltrico entre os
eletrodos. O efluente da coluna passa pela clula, variando a resistncia entre os
eletrodos, de acordo com a Lei de Ohm. A condutncia (L) inversamente proporcional
resistncia e medida em Ohm-1. Essa unidade atualmente denomina-se Siemens. Quando a
distncia entre os eletrodos de 1 cm, tem-se:
k = L/A
onde k a condutncia especfica e A a rea do eletrodo. Por outro lado, a condutncia
equivalente (Ce) relacionada com a condutncia especfica como:
Ce = 1000 k/c
onde c a concentrao do on em equivalente-grama/L.
14.4. Detetor de Fluorescncia
O Detetor de Fluorescncia, utilizado em HPLC, equivalente a um
Detetor de Ultravioleta. A nica diferena consiste na localizao (ortogonal e no linear)
em relao ao caminho tico. Desse modo, captada apenas a radiao proveniente do
processo de fluorescncia, caracterstico de certas classes de compostos. Assim, substncias
que no fluorescem podem existir na amostra sem interferir na deteco. Uma importante
aplicao a anlise de aminocidos em materiais biolgicos (ex.: teste do pezinho). Neste
exemplo, os aminocidos so transformados em derivados fluorescentes com o reagente
AQC (carbamato de aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidila). Nove aminocidos podem ser
analisados em aproximadamente dez minutos, em gradiente ternrio, com limite de deteco
menor que 10 mg/L.
14.4. Detetor Eletroqumico
O Detetor Eletroqumico, tambm utilizado em HPLC, basicamente uma
clula eletroqumica. O analito oriundo da coluna, ao passar pela clula, oxidado (ou
reduzido) pelo potencial aplicado, gerando uma corrente eltrica que proporcional sua
concentrao.
Existem dois tipos de detetores:
a) Detetor coulomtrico: a amostra passa atravs da clula. Desse modo, todo o
material oxidado (ou reduzido);
b) Detetor amperomtrico: a amostra passa pela superfcie do eletrodo. Assim,
apenas cerca de 1% a 5% do material realmente oxidado (ou reduzido).
63
Desenvolvido para detectar traos (ppb a ppt) de ons, este detetor exige alta
pureza de solventes e reagentes. A gua, por exemplo, deve ser deionizada, purificada em
sistema Milli-Q ou equivalente e filtrada em filtros com 0,2 m (membrana de nylon 66) e
sua resistividade deve ser ao menos 18,2 Mohm.cm. O fabricante inclusive aconselha que
ao sair do sistema Milli-Q a gua passe em coluna com fase mvel C18 para extrao.
64
15. APNDICE 6
Estatstica
15.1. Erro estatstico
Todo trabalho experimental dotado de erro. Trata -se aqui de dois
tipos de erro: a) erro estatstico e b) erro sistemtico.
O erro estatstico possui caractersticas aleatrias. Pode ser avaliado e
minimizado, mas nunca anulado. Apresenta um comportamento gaussiano, isto , em um
certo nmero de repeties, os valores que mais se afastam da mdia (aritmtica) ocorrem
com menor freqncia e erros positivos e negativos de mesma grandeza ocorrem com igual
freqncia. O erro sistemtico, por outro lado, um erro determinado, possui sinal (
positivo ou negativo). Em Cromatografia, o erro sistemtico corrigido automaticamente
pelo prprio mtodo de clculo (Seo 6.3; p. 33).
15.2. Avaliao do erro estatstico
Uma das maneiras de se medir o grau de disperso de um conjunto de
resultados analticos (repeties) o desvio padro (s), o qual pode ser calculado com
auxlio da equao
s = [(xi - x )/(n 1)]1/2
(eq. 22)
onde xi um resultado qualquer, x a mdia aritmtica e n o nmero de repeties. Esse
parmetro denominado primeira estimativa do desvio padro, j que o verdadeiro desvio
padro s pode ser calculado quando n tende para infinito. Entretanto, s s pode ser empregado
quando n maior que 10. Como normalmente n muito pequeno (3 a 5 determinao em
paralelo), emprega-se em seu lugar a segunda estimativa do desvio padro (sR):
sR = Kn R
(eq. 23)
onde R a amplitude, ou seja, a diferena entre o valor (resultado analtico) maior e o valor
menor. O valor de Kn obtido da Tabela 15.1.
15.3. Avaliao da exatido
Na realidade, erro de exatido o erro sistemtico, que seria corrigido
pelo prprio mtodo analtico, conforme afirmado acima. Entretanto, o analista pode
cometer erros operacionais que resultem em erro sistemtico (ex.: uso de solventes
contendo impurezas que interfiram na identificao). O erro sistemtico pode ser avaliado
com auxlio do teste t (de Student), que compara a concentrao real de uma soluo
65
padro, preparada com todo critrio (por exemplo, preparada por um Laboratrio de
Referncia) com a concentrao do padro empregado na calibrao do equipamento. A
equao seguinte aplicada, com auxlio da Tabela 15.2:
Tabela 15.1 - Valores de Kn para clculo de sR.
n
Kn
0,8862
0,5908 0,4857
0,4299 0,3946 0,3698
0,3512 0,3367
10
0,3249
X n
(eq.24)
onde X a mdia aritmtica das n determinaes, a concentrao real, s calculado de

acordo com a eq. 22 (p. 63) e t comparado com o valor tabelado (Tabela 15.2). Se o valor
de tcalc for menor ou igual ao de ttab na coluna P = 95%, para o correspondente valor de n-1,
o Laboratrio em avaliao est correto.
Tabela 15.2 - Valores de t para aplicao do teste t.
n-1
90
P (%)
95
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6,314
2,920
2,353
2,132
2,015
1,943
1,895
1,860
1,833
1,812
12,706
4,303
3,182
2,776
2,571
2,447
2,365
2,306
2,262
2,228
99
63,657
9,925
5,841
4,608
4,032
3,707
3,499
3,355
3,250
3,169
15.4. Avaliao da reprodutibilidade

O objetivo comparar a preciso de um Laboratrio, de um analista, de
um equipamento ou de um mtodo (ou um determinado procedimento) com outro. Aplica-se
o teste F, que compara a disperso de um conjunto de dados com a de outro. Se as
diferenas em preciso forem estatisticamente significativas, o valor de Fcalc ser maior que
o valor de Ftab (Tabela 15.3). Para uso da eq. 25, o maior desvio padro colocado no
numerador, de modo a ter-se um valor de F maior que 1.
66
s2A
s2B
(eq. 25)
Tabela 15.3 - Valores de F para aplicao do teste F

(n -1)
de B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
161
18,5
10,1
7,7
6,6
6,0
5,6
5,3
5,1
5,0
(n - 1) PARA O MTODO A
3
4
5
6
7
8
216
225
230
234
237
239
19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4
9,9
9,1
9,0
8,9
8,8
8,8
6,6
6,4
6,3
6,2
6,1
6,1
5,4
5,2
5,1
5,0
4,9
4,8
4,8
4,5
4,4
4,3
4,2
4,2
4,4
4,1
4,0
3,9
3,6
3,7
4,1
3,8
3,7
3,6
3,5
3,4
3,9
3,6
3,5
3,4
3,3
3,2
3,7
3,5
3,3
3,2
3,1
3,1
2
200
19
8,6
6,9
5,8
5,1
4,7
4,5
4,3
4,1
9
241
19,4
8,8
6,0
4,8
4,1
3,6
3,3
3,1
3,0
10
242
19,4
8,8
6,0
4,8
4,1
3,6
3,3
3,1
3,0
15.5. Nmero ideal de repeties

O nmero ideal de repeties (determinaes em paralelo) calculado
com aplicao das eq. 26 e 27:
t.s
(eq. 26)
L = 100/
(eq. 27)
Os dados so organizados no Quadro abaixo (os valores so exemplo fictcio), para facilitar
a interpretao. Na ltima coluna indicada a diferena entre o valor de L atual e o da linha
anterior. No momento em que a diferena (vale dizer, a diminuio na disperso dos
valores, ou ainda o aumento na preciso) fica desprezvel, a critrio do analista, este adota o
nmero anterior como sendo o nmero ideal de repeties.
amostra A: = 1%
L
Dif.
2
3
4
5
6
67
0,260
0,072
0,046
0,036
0,030
26,0
7,2
4,6
3,6
3,0
18,8
2,6
1,0
0,6
15.6. Expresso do resultado final

Para explicitar o grau de confiabilidade em uma anlise, necessrio
indicar os limites de confiana. Na prtica, comum definir os limites a partir da amplitude.
Assim, um resultado Re representado como:
Re = X + R/2
Na realidade, caso o mtodo tenha sido submetido a uma avaliao
estatstica completa, emprega-se a relao:
Re X t.Kn.
R
n
15.7. Clculo do coeficiente de correlao (r)

Na Seo 10.4 (p. 54) foi solicitado o clculo do coeficiente de
correlao. Este clculo realizado com uso da eq. 28:
(eq. 28)
Para ordenar os clculos, faz-se uso do quadro abaixo, onde x e y so,

respectivamente, concentrao e rea do pico.
Ponto no
1
x.y
x2
y2
x1
y1
x1.y1
x12
y12
2
...
...
...
n
Totais
x2
...
...
...
xn
x
68
y2
...
...
...
yn
y
x2.y2
...
...
...
xn.yn
x.y
x22
...
...
...
xn2
x2
y22
...
...
...
yn2
y2

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8.1 Tempo de reteno e reteno relativa, 50