Definição de CLAE HPLC

Cromatografia líquida de alta eficiência

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, em inglês: High
performance liquid chromatography, HPLC) é um método de separação de compostos
químicos em solução. Tem sido amplamente utilizada como ferramenta em várias
áreas da química e biologia.

Princípios gerais da cromatografia

O princípio básico da cromatografia é a separação de misturas, no qual os
componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma fase
estacionária e uma fase móvel, como mostrado na figura 1.

Figura 1: Esquema simplificado de separação de duas misturas.

Entre os diferentes tipos de cromatografia, a cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE, em inglês: High performance liquid chromatography, HPLC) tem
sido amplamente utilizada como uma ferramenta na bioquímica e análise de
separação, identificação e quantificação de compostos ativos (HAYES et al., 2014). Um
esquema simplificado de CLAE está descrito na figura 2.

Figura 2: Esquema de um HPLC: a) Reservatório da fase móvel; b)

Desgaseificador; c) Bomba; d) Injetor de amostra; e) Compartimento de colunas
termostatizado; f) Coluna de separação; g) Detector; h) Processador de dados.
 Os principais componentes da cromatografia líquida são: a bomba, que
movimenta a fase móvel e a amostra através da coluna; uma coluna, que contêm a fase
estacionária, geralmente formada por partículas de sílica, porosas, esféricas e diâmetro
em torno de 35 μm, e um detector que mostra os tempos de retenção das moléculas,
sendo que o tempo de retenção varia de acordo com as interações da amostra com as
fases estacionária e móvel (MALVIYA et al., 2010).

Parâmetros cromatográficos

Tempo de retenção
O tempo de retenção (tR) é o tempo gasto por um componente desde a sua
injeção até a sua detecção na saída do sistema. O tempo de retenção engloba todo o
tempo que um componente fica no sistema cromatográfico, seja diluído na fase móvel,
seja retido na fase estacionária. A Figura 3 ilustra um cromatograma típico. O tempo
indicado no primeiro sinal do cromatograma indica o tempo gasto pelas moléculas da
fase móvel para atravessar a coluna e atingir o detector. Esse tempo é chamado de
tempo morto (tM), e normalmente é determinado por algum composto ou impureza
presente na mistura em análise que não é retido pela fase estacionária. Para a
determinação dos tempos de retenção corrigidos (t’R) é necessário conhecer o tempo
morto, uma vez que a correção é feita simplesmente descontando o seu valor do valor
do tempo de retenção (MEYER, 2010).

Figura 3: Cromatograma típico para cálculo de parâmetros cromatográficos.

Fator de retenção ou capacidade

O fator de retenção é a medida da capacidade da coluna em reter um
componente da amostra, ou seja, é a medida de retenção na fase estacionária (MILLER,
2005). O fator de retenção é dada pela equação abaixo:

onde,
k= fator de capacidade
tR = tempo de retenção
tM = tempo morto
 Coeficiente de separação ou seletividade
O coeficiente de separação (a) é calculado pela razão entre os fatores de
capacidade (k’) de dois compostos que resultem em picos adjacentes no cromatograma
(MILLER, 2005). Por definição a seletividade é sempre maior que 1, e pode ser
calculada pela equação abaixo:

onde,
a = fator de capacidade
k’B = fator de capacidade do composto B
k’A = fator de capacidade do composto A
trB = tempo de retenção do composto B
trA = tempo de retenção do composto A
tm = tempo morto

Eficiência
Para estimar a eficiência de uma coluna cromatográfica podemos usar dois
termos que estão relacionados entre si: o número de pratos teóricos (N) e a altura
equivalente a um prato teórico (H ou HETP), que se relacionam pela equação a seguir:

onde,
L = o comprimento da coluna cromatográfica
A altura equivalente de um prato teórico é utilizada para comparar a eficiência
entre colunas de diferentes comprimentos. Quanto menor a altura do prato teórico,
maior será a eficiência da coluna (MEYER, 2010).

Resolução
Para determinar a resolução entre duas bandas, consideram-se as larguras das
bandas assim como seus respectivos tempos de retenção, de acordo com a equação a
seguir:

Embora os parâmetros de citados acima sejam importantes, a separação de

substâncias não depende somente deles. O alargamento das bandas, assim como a
eficiência e a seletividade influenciam em uma boa resolução. Pode-se resumir a
resolução como um relação complexa entre a eficiência (N), seletividade (α) e a
retenção (k) (MEYER, 2010):
 Alargamento de banda
Uma baixa eficiência de separação pode ser explicada pelo alargamento da
banda de um composto. Há muitas razões que contribuem para o alargamento da
banda, os fatores intrínsecos podem ser explicados pela equação de Van Deemter.

onde,
A = difusão por turbilhonamento (difusão de eddy)
B = difusão longitudinal
C = desequilíbrio local ou resistência à transferência de massa
A equação de Van Deemter é a equação fundamental para a descrição da
performance de uma coluna, e mostra a relação da altura equivalente de um prato
teórico, com a velocidade da fase móvel, u.
A difusão por turbilhonamento (A) é consequência dos diversos caminhos que
as moléculas da amostra podem percorrer através da coluna. A difusão de três
moléculas são mostradas na figura 4. Todas as três começam na mesma posição inicial,
mas elas tendem a seguir caminhos diferentes ao longo da coluna empacotada. Devido
ao fluxo constante da fase móvel, as três moléculas chegam com tempos diferentes e
consequentemente se separando. A molécula que pegou o caminho direto (molécula 3)
termina na parte da frente da banda, por exemplo. Esse termo da equação pode ser
minimizado usando-se colunas de tamanho reduzido, com diâmetros internos
menores, com enchimentos eficientes e partículas uniformes.

Figura 4: Ilustração da difusão de eddy ou efeito dos caminhos múltiplos.

O termo B, difusão longitudinal, se refere a difusão do soluto na fase móvel. Se
a amostra permanece por um determinado período dentro da coluna, ela tenderá a se
difundir em todas as direções (é como se fosse um cubo de açúcar dissolvendo no café
sem agitar) (figura 5). Uma forma de minimizar este efeito é empregando-se altas
velocidades lineares de fase móvel.
 Figura 5: Alargamento da banda por difusão longitudinal
A resistência à transferência de massa, termo C, se refere ao processo de
movimentação da amostra dentro e fora da fase estacionária e da fase móvel. Conforme
a transferência de massas for mais rápida, melhor é a eficiência. Este processo pode ser
melhorado pelo uso de camada mais finas de fase estacionárias, partículas menores,
fases móveis de baixa viscosidade, assim como altas temperaturas (MILLER, 2005;
MEYER, 2010).

Detectores de HPLC
O detector cromatográfico é um dispositivo conectado logo após a coluna
cromatográfica que quando em contato com os analitos presentes no eluente, emite
sinais elétricos que são registrados na forma de picos. Através deste registro, podem-
se obter dados qualitativos e quantitativos sobre os analitos presentes na amostra.
Existem vários tipos de detectores, sendo que a escolha dependerá fortemente
das características químicas ou físicas das espécies a se detectar. Os detectores de
HPLC devem possuir várias características, entre elas:
Alta sensibilidade, seletividade, linearidade (correspondente a aumento da
concentração do analito), pouco sensível às variações de temperatura e fluxo, preciso e
com reprodutibilidade. Assim, o detector ideal é aquele adequado ao seu sistema
cromatográfico, a fase móvel (eluente) utilizada e principalmente as propriedades dos
analitos alvos presentes na análise.
O primeiro detector considerado na cromatografia líquida foi o olho humano,
que através dos experimentos clássicos utilizando uma coluna de vidro, permitiu-se
separar os compostos de colorações diferentes. Os primeiros detectores comerciais
utilizados em um sistema de HPLC foram os detectores de índice de refração e de
condutividade, entretanto, com a introdução do detector de UV em técnicas de HPLC,
ampliaram-se as possibilidades de uso da cromatografia líquida na química analítica.

Detectores de UV-visível
São os detectores mais utilizados em HPLC, pois apresentam o mais baixo custo,
aceitam o uso de gradiente e geralmente não são afetados por pequenas mudanças de
fluxo e temperatura. Ele consiste em um fotômetro que mede a absorção de luz dos
compostos, em certo comprimento de onda, compreendido entre as regiões visível e
ultravioleta.
O princípio da detecção por UV-vis pode ser definido através da concentração
do analito relacionada à fração da luz transmitida pela célula do detector pela lei de
Beer-Lambert, onde:
A = Log (I0 / I ) = b.c. ε
Onde:
A – Absorbância ;
I0 – Intensidade da incidência de luz;
ε – Absortividade molar da substância;
b -Comprimento do percurso da célula do detector (cm) ;
c- Concentração da amostra em mols/L.
 A absorvidade molar para um grande número de compostos pode ser
encontrado na literatura. A absorbância geralmente é proporcional à concentração da
amostra.
A configuração de um detector de UV-vis de comprimento de onda fixo pode ser
representada pela seguinte figura 1:

figura 1 – detector de UV-vis de comprimento de onda fixo

A lâmpada, também chamada de fonte luminosa, pode ser de tungstênio,
deutério, mercúrio, zinco, cádmio, xenônio ou outros, que será aplicada de acordo com
a configuração do detector e comprimento de onda desejado.
As configurações mais comuns dos detectores de UV-vis são: Detector de
comprimento de onda fixo, detector de comprimento de onda variável e detector de
rede de diodos (diode array). Este último permite determinar os espectros das
substâncias presentes da amostra no eluente com diferentes comprimentos de onda
durante a análise cromatográfica.
A detecção por UV-vis é geralmente aplicada em compostos cujas moléculas
possuam algumas características para a absorção na região de UV-vis. Abaixo segue
tabela com os grupos principais que compõe os analitos analisados:

Tabela 1 – PRINCIPAIS GRUPOS QUE ABSORVEM NA REGIÃO DE UV-

Vis

Ligação dupla adjacente a um átomo com um par de elétrons livres

Bromo, iodo ou enxofre

Grupo carbonila (C=O )

Grupo nitro ( NO2 )

Duas ligações duplas conjugadas

Anel aromático

Íons inorgânicos: Brometo,iodeto, nitrito, nitrato

A intensidade da absorção da molécula dependerá dos grupos presentes

e da influência que eles podem exercer sobre os outros grupos presentes.
 Detector de Fluorescência

São sensíveis, seletivos e com alta especificidade entre os detectores de HPLC.

A sensibilidade deste tipo de detector pode ser de 10 a 1000 vezes mais que os
detectores de UV-vis. O funcionamento do detector de fluorescência consiste em uma
lâmpada de excitação (de espectro de bandas ou contínuo) seguida por um filtro ou
uma rede de difração, incidindo o feixe luminoso sobre a célula da amostra e excitando
a mesma, originando a emissão de um feixe de luz ao retornar ao estado fundamental,
o qual é em seguida dirigido a um filtro ou monocromador, que seleciona o
comprimento de onda emitido, fazendo-o incidir no fotodetector. Aplica-se em
análises de HPAs, aminoácidos, esteroides, vitaminas e aditivos, corantes alimentares.

Detector de índice de refração (RI – Refrative index)

Também chamado de refratômetro diferencial, é conhecido como detector

universal por apresentarem resposta para qualquer espécie de amostra. A análise
baseia-se na mudança do índice de refração do eluente por causa dos componentes da
amostra. Quanto maior a diferença do índice de refração da fase móvel e o componente
da amostra, mais intenso é o sinal. Há três tipos de sistema óptico utilizados nos
detectores de índice de refração: Fresnel, Deflexão e interferômetro.

A figura 2 demostra a configuração típica de um detector de índice de refração.

figura 2 -configuração típica de um detector de índice de refração

Este detector possui as seguintes características:
– Versatilidade, pois detecta todos os solutos;
-Moderada sensibilidade, sendo o detector de UV 1000vezes mais sensíveis,
assim não recomendável para análise de traços;
-Sensível a qualquer alteração de temperatura alterando a resposta do detector.
-Fácil de operar;
– Pouco recomendável realizar gradiente;
– Não é destrutivo.

Os detectores de índice de refração são empregados quando outros disponíveis

não correspondem aos compostos de interesse e a sensibilidade não for muito
importante, em separações preparativas e nas análises de macromoléculas em
cromatografia de exclusão por tamanho.
 Detector eletroquímico (amperométrico)

A detecção é feita através da oxidação ou redução de compostos em célula de

fluxo a partir dos eletrodos de trabalho e de referência na presença de um potencial
elétrico. Pode apresentar um limite de detecção extremamente baixo e muito utilizado
em análises de traços de compostos orgânicos com grande seletividade.

Detector condutimétrico

Aplicado em cromatografia Iônica, estes detectores têm alta sensibilidade e

seletividade. A medição é realizada através da medida da condutividade total (eluente
e componentes da amostra) com uma célula contendo entre dois a seis eletrodos de Ag,
Pt ou aço inoxidável. Em alguns métodos, pode ser necessário o supressor, um artificio
utilizado para reduzir os interferentes da fase móvel na medição. O detector
condutimétrico é utilizado principalmente para determinação de cátions, ânions,
metais, sulfactantes e ácidos orgânicos.

Espectrômetro de massas

Introduzido inicialmente em sistemas de HPLC com métodos bioanalíticos na

determinação de fármacos em plasma e urina, os detectores de espectrômetro de massa
para HPLC são muito utilizados em pesquisas e desenvolvimento permitindo a
informação estrutural de compostos e a identificação de componentes desconhecidos
presentes em amostras através da determinação de massa, carga e estrutura
proveniente da forma ionizada dos componentes . Possui alta sensibilidade e aplicável
a diversos analitos. O avanço nas formas de nebulização para vaporização da amostra,
minimizando os efeitos do eluente, permitiu uma ampla aplicação do espectrômetro de
massas na cromatografia líquida, antes mais restrita a detecção por cromatografia
gasosa para análise de compostos voláteis.

Os sistemas de HPLC-MS e HPLC- MS/ MS dispõe de dispositivos acoplados ao

sistema para viabilizar a vaporização do eluente + compostos para pesquisa dos
espectros/massa. Os mais comuns são ionização eletronebulização (ESI- electrospray
ionization) e ionização química em pressão atmosférica (APCI – atmospheric pressure
chemical ionization).

Além dos detectores citados, há muitos outros detectores para HPLC com
diversas aplicações, específicos ou não, entre eles:
– Detectores de radiotividade;
– Detectores de quimioluminescência de nitrogênio;
– Detectores quirais;
– Detectores de espalhamento de luz (light-scattering).