UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO:

CROMATOGRAFIA :
COMPONENTES DE UM
CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE
ALTA EFICIÊNCIA

DISCIPLINA: ANÁLISE INSTRUMENTAL

CURSO: ENGENHARIA QUÍMICA
DOCENTE: Profa. Dra. Débora Nobile Clausen Peraro
 Cromatografia
É um método físico-químico de separação, no qual
os constituintes da amostra a serem separados são
particionados entre duas fases uma estacionária e a outra
um fluido insolúvel, fase móvel, que percola através da
primeira.

1) Fase Estacionária : sólido ou líquido

2) Fase Móvel:

Líquida: Cromatografia Líquida ou em Fase Líquida

Gás: Cromatografia Gasosa ou em Fase Gasosa.

 • CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA (CLAE OU HPLC)

• A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em inglês,

High performance liquid chromatography, (HPLC) é um método de separação de
compostos químicos em solução, a qual é utilizada na química analítica para
identificar e quantificar cada componente em uma mistura.

• Nos anos de 1960 que se desenvolveu essa tecnologia para produzir e

utilizar recheios com diâmetros de partículas tão pequenos como 3 a 10 µm.

• O termo cromatografia líquida de alta eficiência é sempre empregado para

distinguir essa tecnologia dos procedimentos cromatográficos realizados em
colunas simples que os precederam.

CROMATOGRAFIA CÁSSICA
 Cromatografia
Fase móvel t0 t1 t2 t3 t4 t5

Amostra (A+B)
Detector
Fase estacionária

ANÁLISE
QUANTITATIVA

B A

Área de pico
RESPOSTA ANALÍTICA ANÁLISE
QUALITATIVA

Tempo de retenção (min)

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA –
INSTRUMENTAÇÃO CLAE

Cromatograma
 INSTRUMENTAÇÃO CLAE
1) RESERVATÓRIO DE FASE MÓVEL

É equipada com um ou mais reservatórios de

vidro (500 mL ou mais de um solvente);

Remoção de gases dissolvidos e partículas nos

líquidos

Evitar alargamento de bandas!!

Interferem no desempenho da
maioria dos detectores!!
 INSTRUMENTAÇÃO CLAE
1) RESERVATÓRIO DE FASE MÓVEL

ELUIÇÃO ISOCRÁTICA: eluição com um único

solvente ou com uma mistutra de solventes de composição
definida;
Ex.: metanol; metanol:acetonitrila (95:5)

ELUIÇÃO POR GRADIENTE: a composição do

solvente é alterada continuamente ou em uma série de
etapas;
Ex.: eluição de metanol por 10 min e após esse tempo,
eluiçãode metanol:acetonitrila (80:20)
 INSTRUMENTAÇÃO CLAE
2) SISTEMAS DE BOMBEAMENTO: movimenta a fase
móvel e a amostra através da coluna

Requisitos dos sistemas de bombeamento

 Cromatografia Líquida
Sistemas de Bombeamento

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 INSTRUMENTAÇÃO CLAE
3) Sistemas de injeção de amostras

Suportam pressões de até 7.000 psi;

Volumes típicos: 5 a 500 ml;
Microamostragem: 0,5 a 5ml;
 Cromatografia Líquida
3) Sistemas de injeção de amostras

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seringa
 INSTRUMENTAÇÃO CLAE
4) Colunas para CLAE
As colunas geralmente são
construídas de aço inox, embora
tubos de vidro com paredes
resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes
últimos são restritos a pressões
mais baixas do que 600 psi;

Existem comercialmente centenas de colunas

empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares;
 Instrumentação CLAE
4) Colunas para CLAE

COLUNAS TÍPICAS
•Material: aço inox;
•Comprimento: 10 a 30 cm;
•Diâmetro: 4 a 10 mm;
•FE: Partículas de 5 a 10 µm;
•Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro;
Tipos de colunas
COLUNAS: DEFINIÇÕES BÁSICAS
 CUIDADOS COM A COLUNA: CLAE
o manter a coluna sempre tampada;
o evitar choques de pressão, térmicos e mecânicos;
o usar pré-coluna (guard column);
o pré-tratamento das amostras devem considerar a
eliminação de partículas e de impurezas que possam
ficar adsorvidas;
o obedecer a faixa de pH em que a FE é estável
(2< pH < 8)
o eliminar sais, tampões, e aditivos da FM antes de
armazenar a coluna;
o LIMPEZA:
o SÍLICAS = HEXANOS /DICLOROMETANO
o FASE REVERSA = METANOL OU ACETONITRILA
100%
 PRÉ- COLUNA:
(GUARD COLUMN)
Aumenta a vida útil da coluna

Instalada entre o injetor e a coluna , com cerca de 2 cm

de comprimento e tem as seguintes funções:
1. Remover partículas;
2. Remover substâncias que tenham forte interação com
a coluna;
3. Remover substâncias que possam precipitar quando
em contato com a FM ou a FE
4. Resumindo: aumentar o tempo de vida da coluna
cromatográfica.

5. DEVEM SER SUBSTITUÍDAS REGULARMENTE

 TERMOSTATO PARA COLUNAS:

o para muitas aplicações um controle rigoroso da

temperatura não é necessário;

o mas obtem-se melhores cromatogramas mantendo-

se a coluna à temperatura constante (˚C);
 Instrumentação CLAE
5) Detectores para CLAE
Detector: mede as mudanças de concentração
ou a massa dos compostos da amostra que
está deixando a coluna.
As características desejáveis para os detectores para
CLAE não são diferentes daquelas para CG.

Existem dois tipos de detectores:

• Propriedades universais (índice de refração, densidade

ou constante dielétrica);

• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc);

 Instrumentação CLAE
5) Detectores
Características ideais:

1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s;

2.Boa estabilidade e reprodutibilidade;

3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de

grandeza;

4. Tempo de resposta curto e independente da vazão;

5. Alta confiabilidade e facilidade de uso;

6. Similaridade de resposta para todos os solutos;

7. Não destrutivo;

8. Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão;

 Tipos de Detectores
a)Espectrofotométricos: medem as mudanças na
absorção de luz monocromática e
fluorescênica.

b)Índice de refração: mede as mudanças do

índice de refração do efluente da coluna.

c) Eletroquímico: mede as mudanças das

características elétricas da solução.

d)Espectrômetro de massa: mostra a relação

massa/carga.
 Tipos de Espectrofotométricos
Detectores:
Os detectores UV-VIS são os mais utilizados em HPLC, pois apresentam o
mais baixo custo, aceitam o uso de gradiente e geralmente não são afetados por
pequenas mudanças de fluxo e temperatura.

Ele consiste em um espectrofotômetro que mede a absorção de luz dos

compostos, em comprimento de onda pré-programado, compreendido entre as regiões
visível e ultravioleta.

O princípio da detecção por UV-VIS pode ser definido através da

concentração do analito relacionada à fração da luz transmitida pela célula do detector
pela lei de Beer-Lambert.
 Cromatografia Líquida
Detectores
Cromatograma múltiplo em diferentes comprimentos de onda;
 Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência por partição
É o tipo de CLAE mais utilizado: na qual a
fase estacionária é um segundo líquido que é
imiscível com o líquido da fase móvel.

Pode ser subdividida em:

1) Partição Líquido-Líquido;
2) Partição com Fase Ligada
1) Cromatografia por partição Líquido-Líquido: a
fase estacionária é um solvente que é
imobilizado por adsorção sobre a superfície das
partículas do recheio;

2) Cromatografia por partição com Fase Ligada: a

fase estacionária é uma espécie orgânica que é
imobilizada na superfície das partículas do
material de recheio por meio de ligações
químicas.

Mais usadas devido sua estabilidade !!!

Recheios com Fases Ligadas: Recheios de Fase
Normal e Reversa

Cromatografia em fase normal: fase

estacionária polar

Cromatografia em fase reversa: fase

estacionária de baixa polaridade
Fase normal: FASE ESTACIONÁRIA POLAR
FASE MÓVEL APOLAR
Fase normal: FASE ESTACIONÁRIA POLAR

QUEM ELUI PRIMEIRO?

SUBSTÂNCIAS APOLARES OU
POLARES??????
Aplicável em análises de substâncias insolúveis
em água: óleos, gorduras e lipídeos.
 Fase Normal:

Na cromatografia de fase normal, o

analito menos polar é eluído primeiro.
Fase reversa: FASE ESTACIONÁRIA APOLAR
FASE MÓVEL RELATIVAMENTE POLAR

MECANISMO DE INTERAÇÃO EM FASE REVERSA

C18: ADSORÇÃO DO ANALITO NA FASE

ESTACIONÁRIA

Van der waals:

INTERAÇOES RESIDUAIS – LIGAÇÕES DE

HIDROGÊNIO
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
Fase estacionária menos polar que a fase
móvel
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente

Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de

Carbono < Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio
< Éter Etílico < Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol <
Ácido Acético;
APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA

 seu emprego tem crescido nos

últimos anos, uma vez que permite a
separação de espécies químicas
muito semelhantes.

 pode ser empregada para

identificação qualitativa e
quantitativa;
 ANÁLISE - PRIMEIROS PASSOS

ANALITO????

• Escolha do tipo de coluna

• Modo de detecção

• Escolha da Fase Móvel

• Otimização de parâmetros para cromatografia

• Validar o método
 ANALITO: Colunas

• As características do analito determinam quais as escolhas

acertadas quanto ao tipo de equipamento utilizado e suas
configurações RESULTADOS

AMOSTRA APOLAR AMOSTRA POLAR

COLUNA DE FASE NORMAL COLUNA DE FASE REVERSA

Recheio é polar Recheio é apolar
 ANALITO: Detecção
DETECÇÃO:

• O analito apresenta fluorescência natural ou pode

ser derivatizado?
DETECTOR DE FLUORESCÊNCIA

• O analito absorve a luz branca?

DETECTOR UV, UV-VIS
 OUTROS DETECTORES:

• Detector de índice de refração: diferença de

refração entre o solvente e o soluto.

• Detector eletroquímico: oxidação ou redução de um

composto.

• Espectrometria de massas: combinação de

processos de ionização, fragmentação e separação
iônica.
 DETECTORES:
• Seletivos: UV fixo e variável, fluorescência

• Universais: IR e MS

• UV, fluorescência e MS podem utilizar eluição gradiente,

o IR não.

• Quantidade Mínima Detectada:

♦ UV: ng
♦ IR: µg
♦ Fluorescência: pg
♦ MS: ng-pg
 ESCOLHA DA FASE MÓVEL
• CONSIDERAÇÕES GERAIS:
– Alto grau de pureza
– Força do solvente
– Polaridade
– Seletividade

• Polaridade ou Força: determina por quanto tempo os

eluentes são retidos (TR)

• Seletividade: retenção relativa pode afetar o formato dos

picos
 ESCOLHA DA FASE MÓVEL

• Modo de eluição?
• Tempo de retenção?
• Presença de interferentes?
• Resolução de picos.
• Linha de base.
• Repetibilidade.
 FASE MÓVEL

• Nem todos os solventes podem ser utilizados em

conjunto!
- Podem interagir quimicamente;
- Viscosidade (pressão);
- Alta pressão de vapor (bolhas);
- Interferir na detecção do analito;
- Devem ser filtrados e degaseificados.
 ANÁLISE DE
DERIVADOS DE PURINAS:
 Parâmetros cromatográficos:

- CLAE (Agilent 1100)

- Alantoína, creatinina, ácido úrico, hipoxantina e xantina
- Diluição / centrifugação
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm (Zorbax)
- FM - tampão A: NH4H2PO4 0,0025 M e tampão B (tampão A:MeOH,
19:1)
- Detector: UV-VIS
- Volume de Injeção de 20 µL (automática)
- Quantificação em ppb
- Qualificação por comparação espectral
DERIVADOS DE PURINAS:

CREATININA

ÃC. ÚRICO
 ATIVIDADE

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica utilizada na

análise de compostos tóxicos. Uma vez aceito o material para análise, o técnico
deve preparar a amostra para injetar no Cromatógrafo, de forma que preencha
os seguintes requisitos, EXCETO: *

a) Não conter compostos que podem interferir na análise.

b) Ter uma concentração compatível com o volume da válvula de injeção

e com a característica do detector empregado.
c) Não ter compostos que sejam insolúveis que possam entupir a coluna.

d) Ser solúvel na fase móvel.

e) Ser adsorvida irreversivelmente ou reagir quimicamente com a fase

estacionária.
 ATIVIDADE
2. Um grupo de pesquisadores realizou uma análise de um medicamento que era
composto por orfenadrina (ORF), cafeína (CAF) e paracetamol (PAR) por HPLC. Para essa
análise foram usadas as seguintes condições cromatográficas: coluna C18, temperatura de
25˚C e fase móvel acetonitrila/água (20:80, v/v), pH 2,5. Os tempos de retenção obtidos
para os compostos de ORF, PAR e CAF foram 2,5, 3,8 e 4,7 minutos, respectivamente. Com
base nas condições cromatográficas e tempos de retenção, ASSINALE a alternativa correta:
a) O paracetamol é um composto mais apolar que a cafeína.
b) A orfenadrina é o composto mais apolar dentre os 3 compostos analisados.
c) A cafeína é o composto mais apolar dentre os 3, pois apresentou maior tempo de
retenção.
d) A orfenadrina é o composto mais polar, pois apresentou maior interação com a fase
estacionária.
e) Todos os compostos apresentam a mesma polaridade nessas condições
cromatográficas.
 ATIVIDADE
3. Na cromatografia líquida de alta eficiência há duas fases: estacionária e móvel. A fase
móvel pode ser usada no modo isocrático e no modo gradiente. Com base nessa
afirmação, assinale a alternativa correta:
a) No modo isocrático o analista altera a composição da fase móvel durante a corrida.
b) No modo isocrático o analista altera a composição da fase estacionária durante a
corrida.
c) No modo gradiente o analista altera a composição da fase estacionária durante a
corrida.
d) No modo gradiente o analista altera a composição da fase móvel durante a corrida.