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CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE

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CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE

CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE

INSTRUMENTAO EM SISTEMAS CROMATOGRFICOS EM FASE LQUIDA 13. Instrumentao 13.a. Reservatrios para fase mvel 13.b. Sistemas de bombeamento 13.c. Injetores 13.d. Caractersticas da fase mvel 13.e. Colunas e recheios por tcnica

INSTRUMENTAO

Figura 28-4 Skoog instrumental p644 verso portugus

INSTRUMENTAO reservatrio da fase mvel e sistemas de tratamento de solvente


reservatrio de 200 1000 mL, vidro ou ao inox equipados com dispositivo para remoo de gases dissolvidos (evitar formao de bolhas: causam alargamento ou interferem na eficincia do detector) desgaseificadores: bomba de vcuo sistema de destilao dispositivos para aquecimento e agitao do solvente borbulhamento de gases inertes de baixa solubilidade filtro de entrada: remoo partculas de poeira (fase pode ser filtrada previamente cmara de mistura: eluies em gradiente

INSTRUMENTAO sistemas de bombeamento


REQUISITOS: presses de at 6000 psi (600 bars) vazo contnua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos) vazes de 0,01 a 10 mL/min (aplicaes analticas) e at 100 mL/min (aplicaes preparativas) controle de vazo e reprodutibilidade melhor que 1 % inrcia qumica: componentes resistente corroso 2 TIPOS: bombas pneumticas bombas mecnicas: recprocas (pisto ou diafragma) deslocamento (tipo seringa)

INSTRUMENTAO bombas recprocas


2 vlvulas (esferas de safira) so abertas e fechadas alternadamente para controlar a vazo de solvente dentro e fora do cilindro; solvente est em contato direto com o pisto VANTAGENS: pequeno volume interno (35 a 400 L) presses elevadas de sada (at 10000 psi) DESVANTAGENS: fluxo pulsado que deve ser amortecido (rudo de fundo na linha de base) fcil adaptao a eluio em gradiente vazo constante fluxo independe da presso de retorno da coluna e da viscosidade do solvente

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INSTRUMENTAO bombas tipo seringa


cmara em forma de seringa, equipada com mbolo acionado por um parafuso controlado por um motor VANTAGENS: sada livre de pulsos fluxo independe da presso de retorno da coluna e da viscosidade do solvente DESVANTAGENS: capacidade limitada de solvente ( 250 mL) inconvenincia quando solvente precisa ser trocado

INSTRUMENTAO bombas pneumticas


fase mvel contida em reservatrio compressvel, inserido dentro de um vaso que pode ser preesurizado com gs comprimido VANTAGENS: baratas e livres de pulsao

DESVANTAGENS: limitao de capacidade e presso de sada fluxo depende da presso de retorno da coluna e da viscosidade do solvente

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INSTRUMENTAO controle de vazo e sistemas de programao

dispositivo controlado por computador para medida de vazo: determinao da queda de presso por um restritor localizado na sada da bomba diferenas detectadas em relao a um valor pr-estabelecido fazem com que a velocidade do motor da bomba seja alterada. muitos equipamentos possuem dispositivos para controle da composio do solvente: vlvula proporcional

INSTRUMENTAO sistema de injeo de amostras

fator limitante da preciso: repetibilidade da injeo volumes devem ser pequenos (evitar alargamento de banda e sobrecarga da coluna, overload): < 500 L conveniente injetar amostra sem despressurizar o sistema sistema mais comum: ala de injeo (loop) mediante seringa; escolha de 0,5 a 500 L; permite injeo a presses de at 7000 psi; preciso melhor que 1%

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INSTRUMENTAO colunas

em geral, tubos de ao inoxidvel, mas tubos de vidro com paredes resistentes tambm so encontrados (restritos a presses mais baixas, 600 psi) diversidade de colunas recheadas so disponveis comercialmente, com preos variando entre US$ 200 a 500

INSTRUMENTAO colunas
Colunas analticas: em geral de 10 a 30 cm; 4 a 10 mm dimetro com partculas de 3, 5 e 10 m (60000 pratos/m) Pr-coluna: introduzida antes da coluna de separao para aumentar a vida til desta remove material particulado e contaminantes provenientes do solvente serve para saturar a fase mvel com fase estacionria minimizando a sangria da coluna composio deve ser similar a da coluna analtica, com tamanho de partcula em geral maior (minimizar queda de presso) Termostatizao: em geral coluna operada a temperatura ambiente; no entanto, cromatogramas de melhor qualidade so obtidos quando a temperatura da coluna controlada; fornos aquecidos at 100-150 C esto disponveis

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CARACTERSTICAS DAS FASES MVEIS


alto grau de pureza ou de fcil purificao (permitir alta sensibilidade nos detectores de absorvncia ou fluorescncia) dissolver a amostra sem decompor os seus componentes (se possvel, solvente da amostra a prpria fase mvel) no decompor ou dissolver a fase estacionria (uso da pr-coluna para saturao da fase mvel com fase estacionria; fase ligada ou slida dispensam esse procedimento) ter baixa viscosidade (favorecer transferncia de massa) ser compatvel com o tipo de detector utilizado (particularmente importante na eluio por gradiente) ter polaridade adequada para permitir separao conveniente dos componentes da amostra

PROPRIEDADES DAS FASES MVEIS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA


SOLVENTE

n-Hexano CCL4 ter dietlico THF Clorofrmio Etanol MeOH ACN Etileno glicol gua

NDICE DE REFRAO

1,.372 1,457 1,350 1,405 1,433 1,359 1,326 1,341 1,431 1,333

VISCOSIDADE PONTO DE NDICE DE cP EBULIO C POLARIDADE

0,30

81

0,04

FORA DO ELUENTE*

-0,2

0,46

66

4,0

0,57

Acetato de etila 1,370 0,54 0,34 0,89 65 82 100 5,1 5,8 10,2 0,95 0,65 grande

*sobre Al2O3

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CARACTERSTICAS DAS FASES MVEIS

OTIMIZAO DA SEPARAO

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OTIMIZAO DA SEPARAO

CARACTERSTICAS DAS FASES ESTACIONRIAS


alumina, celulose, slica gel e zeolita: cromatografia lquida clssica TIPOS DE RECHEIO slidos rgidos (slica), semi-rgidos (partculas porosas de poliestireno entrecuzado) ou no rgidos (agarose ou dextrose) partculas porosas ou peliculares partculas esfricas ou irregulares partculas com diferentes dimetros
partculas microporosas

partculas porosas

partculas peliculares

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SLIDOS E SUPORTES para cromatografia lquido-slido (CLS), cromatografia lquido-lquido (CLL) e com fase ligada (CLFL)
SLIDOS PARA CLS partculas totalmente porosas de 5-10 m ou materiais maiores (30-40 m) com pelcula porosa quase todas as separaes so limitadas a alguns tipos de adsorventes: slica ou alumina componentes mais polares da amostra so retidos preferencialmente: ordem usual de eluio: hidrocarbonetos saturados < olefinas < hidrocarbonetos aromticos haletos orgnicos < sulfetos < teres < steres aldedos cetonas < lcoois aminas < amidas < cidos carboxlicos SUPORTES PARA CLL preferncia para materiais inertes; no entanto como no existem materias inertes com rigidez e uniformidade necessrias, usa-se slica, por vezes desativada, porosa ou superficialmente porosa

SLIDOS E SUPORTES para cromatografia lquido-slido (CLS), cromatografia lquido-lquido (CLL) e com fase ligada (CLFL)
EXEMPLOS slidos microporosos: slica esfrica: srie LICHROSPHERE-Si (E-Merck); dimetro de partcula (3, 5 e 10 m ) ; tamanho de poro (6, 10 e 30 nm); volume de poro (1,1-1,4 mL/g); rea da superfcie (60-400 m2/g) slica irregular alumina esfrica alumina irregular: ALOX 60D (Macherey-Nagel); dimetro de partcula (5 e 10 m ) ; tamanho de poro (6 nm); rea da superfcie (60 m2/g) carbono grafitizado polmeros de estireno divinilbenzeno; polmeros de vinilpiridina e polmeros de propilamida-6
Tabela IX-5 Collins, p199

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SLIDOS E SUPORTES para cromatografia lquido-slido (CLS), cromatografia lquido-lquido (CLL) e com fase ligada (CLFL)
EXEMPLOS slidos peliculares: slica ativa: CORASIL I (Waters); dimetro de partcula (37-50 m); rea da superfcie (7 m2/g) slica inativa (somente usado como suporte): ZIPAK (DuPont); dimetro de partcula (26-37 m); rea da superfcie (1 m2/g) alumina: PELLUMINA HS (Whatman); dimetro de partcula (37-44 m); rea de superfcie (8 m2/g)

Tabela IX-6 Collins, p200

FASES ESTACIONRIAS cromatografia a lquido com fase ligada (CLFL)


A superfcie da slica o suporte mais popular, que pode ser modificado por uma dessas reaes: formao do ster silicato (Si-O-R) por reao do grupo silanol com um lcool: Si-OH + ROH Si-O-R + H2O formao da ligao siloxano (Si-O-SiR) por reao do grupo silanol com um organoclorosilano: Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-R3 + HCl formao da ligao silcio-carbono pelo tratamento do grupo silanol com cloreto de tionila e, em seguida, com um composto organometlico: Si-OH + SOCl2 Si-Cl + RLi Si-Cl + HCl + SO2 Si-R + LiCl

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EXEMPLOS fases microporosas:

FASES ESTACIONRIAS cromatografia a lquido com fase ligada (CLFL)

apolar: PARTISIL ODS-1 (Whatman); grupo ligado (octadecil-polmero); %Carbono, em peso (5,0); NUCLEOSIL100-C8 (Macherey-Nagel); grupo ligado (octil); %C (7,0) polaridade mdia: -BONDAPAK CN (Waters); grupo ligado (cianopropil); %C (6,0); HYPERSIL PHENYL (Shandon); grupo ligado (fenil); %C (5,0) polaridade alta: ZORBAX-NH2 (DuPont); grupo ligado (alquilamina); ACCUSPHERE-DIOL (J&W Scientific); grupo ligado (propildiol); %C (2,5) todas as fases so ligadas a um ncleo slido (citado anteriormente) e, em geral mantm o mesmo nome a maioria contm o grupo Si-O SiRR2 onde R o grupo ligado (octadecil, octil, fenil, amino e nitrilo so os mais comuns) e R em geral o grupo metil fases apolares: grupos silanis residuais so desativados por reaes de capeamento (end-capping) com trimetilmetoxisilano ou similar
Tabela IX-7 Collins, p201 e 202

FASES ESTACIONRIAS cromatografia a lquido com fase ligada (CLFL)


EXEMPLOS fases peliculares: apolar: PERISORB RP18 (E. Merck); grupo ligado (octadecil) polaridade mdia: BONDAPAK PHENYL (Waters); grupo ligado (fenil) polaridade alta: ZIPAC PAM (DuPont); grupo ligado (poliamida)

Tabela IX-8 Collins, p203

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FASES ESTACIONRIAS cromatografia por troca inica


Os materiais usados como recheio para cromatografia por troca inica tm grupos (ctions ou nions) quimicamente ligados a partculas porosas de resinas polimricas, a slica com camada pelicular, a micropartculas porosas de slica e a micropartculas porosas de resinas polimricas. Os grupo quimicamente ligados, presentes em todo tipo de material para troca inica so: -SO3-: trocadores fortes de ctions -COO-: trocadores fracos de ctions -NR3+: trocadores fortes de nions -NH2R+: trocadores fracos de nions

FASES ESTACIONRIAS cromatografia por troca inica

estrutura de poliestireno/divinilbenzeno sulfonado

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FASES ESTACIONRIAS cromatografia por troca inica


EXEMPLOS: aninica: PARTISIL SAX (Whatman); suporte (slica); grupo funcional (-NR3+); capacidade (<1 meq/g); IONPAC-AS (Dionex); suporte (polmero); grupo funcional (-NR3+) catinica: AQUAPORE CX-300 (Brownlee); suporte (slica); grupo funcional (-SO3-); capacidade (5,0 meq/g); PRP-200 (Hamilton); suporte (estireno-divinilbenzeno); grupo funcional (-SO3-); capacidade (0,35 meq/g)

Tabela IX-9 Collins, p205

FASES ESTACIONRIAS cromatografia por excluso


Materiais para cromatografia por excluso variam de acordo com a rigidez e intervalo de tamanho das molculas a ser separadas: materiais fracos (no rgido): gis de polidextrano (Sephadex), poliacrilamidas (Bio-Gel P) e poliagaroses (Sepharose e Bio-Gel A); usados com fase mvel aquosa; cromatografia de coluna clssica materiais semi-rgidos (resistem a presses de 100 a 150 bar): microesferas de copolmero como poliestireno-divinilbenzeno; usados com fases aquosas e orgnicas; tambm para cromatografia clssica materiais rgidos: partculas de slica porosa ou de vidro poroso (desativados)

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FASES ESTACIONRIAS cromatografia por excluso


Estrutura parcial da Sephadex Figura VI-4 Collins p106 Estrutura parcial da agarose Figura VI-5 Collins p107 Estrutura parcial da Sepharose com ligaes entrecruzadas Figura VI-6 Collins p108 Estrutura parcial de Sephacryl Figura VI-7 Collins p109

FASES ESTACIONRIAS cromatografia por excluso


EXEMPLOS fases microporosas: BIOGEL SEC (BioRad); material (estireno-divinilbenzeno); dimetro da partcula (10 m); faixa de massa molecular (103 8x106) -BONDAGEL (Waters); material (slica); dimetro da partcula (10 m); faixa de massa molecular (2x103 7x106) OHPAK-Q (Showa Denko); material (polivinil lcool); faixa de massa molecular (500 - 5000)

Tabela IX-10 Collins, p206

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DETECTORES PTICOS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA 13.f. Detectores 13.f.1. Detectores de absorvncia no UV-vis 13.f.2. Detectores de absorbncia no Infravermelho 13.f.3. Detectores de fluorescncia 13.f.4. Detectores Refratomtricos 13.f.5. Outros: eletroqumicos, espalhamento, radioatividade 13.f.6. Detectores por Espectrometria de Massas

DETECTORES
monitoramento do efluente que sai da coluna ESTRATGIAS: medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas, amostras e fase mvel medidas de uma propriedade da amostra que no apresentada pela fase mvel deteco aps eliminao da fase mvel

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DETECTOR IDEAL
alta sensibilidade e baixo limite de deteco resposta rpida a todos os solutos insensibilidade a mudanas de temperatura e na vazo da fase mvel resposta independente da fase mvel pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto no destruio do soluto segurana e convenincia para uso informao qualitativa do pico desejado

DETECTORES
2 TIPOS: SELETIVO versus UNIVERSAL UNIVERSAL: responde s propriedades da fase mvel (ndice de refrao, constante dieltrica ou densidades, moduladas pela presena do soluto) SELETIVO: responde s propriedades do soluto (absorvncia no UV-vis, fluorescncia, corrente de difuso) que a fase mvel no possui

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UV-vis: detector por espectrofotometria no UV-vis FLU: detector por fluorescncia

IRef: detector por ndice de refrao ELETR Hg: detector eletroqumico (Hg gotejante)

COND E: detector por condutividade eltrica

detector

CARACTERSTICAS DE ALGUNS DETECTORES


UV-vis FLU IRef ELETR Hg

COND E

princpio de operao tipo quantidade mnima de deteco (g/mL) faixa de linearidade volume da cela (mL) sensibilidade temperatura sensvel vazo da fase mvel til com gradientes aplicaes
Tabela IX-12 Collins p219

PARMETROS (da tabela anterior)


sensibilidade: relao entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal (termo relativo, depende da amostra) linearidade: faixa linear do sistema onde o sinal do detector diretamente proporcional concentrao do soluto; se concentrao da amostra muito alta (diluies apropriadas) limite mnimo de deteco: menor quantidade da substncia que pode ser detectada, produzindo um sinal igual ao dobro do nvel de rudo do instrumento; rudo a variao do sinal do instrumento que no atribuda amostra e pode ser produzida por falhas eletrnicas, aparelhos mal aterrados, variaes de vazo ou temperatura, flutuaes na tenso, bolhas de ar no detector, etc. variaes na composio da fase mvel podem produzir grandes flutuaes na linha de base, principalmente nos casos de eluio por gradiente

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NMERO DE TRABALHOS PUBLICADOS EM LC


at 1982: 365 trabalhos publicados 71%: UV-vis 15%: fluorescncia 5,4%: ndice de refrao 4,3%: eletroqumico 4,3%: outros UV-vis: 39%: baseados em linhas de emisso do Hg) 13%: radiao filtrada de uma fonte de deutrio 48%: radiao emitida de um monocromador de rede

DETECTORES DE ABSORVNCIA
PRINCPIO: absorvncia da luz por parte da amostra ao passar atravs desta qualquer radiao eletromagntica (normalmente do ultravileta at o infravermelho) resposta seletiva: s detecta os componentes da amostra que absorvem a radiao no comprimento de onda selecionado; grande maioria das substncias absorvem radiao UV (substncias com eltrons ou eltrons desemparelhados), por exemplo olefinas, compostos aromticos e compostos contendo >C=O, >C=S, -N=O e N=N-

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DETECTORES DE ABSORVNCIA CELA EM Z

volume mantido pequeno para minimizar alargamento de banda: 1-10 L comprimento: 2-10 mm P < 600 psi (redutor de presso requerido

DETECTORES DE ABSORVNCIA
2 TIPOS: comprimento de onda fixo (fotomtrico): sensvel e econmico comprimento de onda varivel (espectrofotomtrico): verstil ambos, relativamente insensveis a variaes de vazo ou temperatura; sensiblidades de at 0,001 unidades de absorvncia; possvel a deteco de dcimos de nanograma (10-10g) muitos instrumentos so de duplo feixe: um feixe passa pela cela da amostra/eluente, e outro passa por um filtro que reduz sua intensidade; detectores piezoeltricos geminados so usados para comparar a intensidade dos dois feixes; alternativamente, um sistema de recorte de feixe usado em conjuno com um nico fototubo; cromatogramas: grficos do log da razo dos sinais dos transdutores em funo do tempo instrumentos de feixe simples tambm so encontrados: medidas da intensidade do solvente so armazenadas em memria e depois recuperadas para o clculo da absorvncia

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DETECTORES DE ABSORVNCIA comprimento de onda fixo


radiao de uma fonte de mercrio de baixa presso transmitida atravs da amostra quantidade de radiao no absorvida (transmitida) atinge a clula fotoeltrica da amostra (fotomultiplicador) a radiao da fonte dirigida atravs de um divisor de feixe para a cela de referncia, e atinge a clula fotoeltrica de referncia a diferena de corrente das duas clulas fotoeltricas alimenta um amplificador, que gera um sinal de sada para o registrador

a maioria dos detectores de comprimento de onda fixo opera em 254 nm (filtro) e 280 nm

DETECTORES DE ABSORVNCIA faixa do visvel


alguns compostos absorvem na regio visvel do espectro eletromagntico e podem ser analisados com detectores que funcionam nessa regio do espectro reagentes podem ser adicionados ao efluente de maneira contnua, ou peridica, para formar compostos coloridos que podem ento ser monitorados (derivao ps-coluna); exemplo: aa com ninidrina (cor prpura) detectado a 570 nm detectores de absorvncia (lmpadas de tungstnio) podem ter comprimento de onda fixo ou varivel com monocromador

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cobrindo a faixa de 190 a 800 nm; atravs de monocromador que seleciona o desejado do feixe de luz emitido por lmpadas de deutrio (UV) ou tungstnio (vis) VANTAGENS sobre os instrumentos de onda fixo: maior versatilidade: atravs da escolha apropriada do possvel trabalhar nas regies de alta absorvncia dos componentes da amostra (alta sensibilidade) maior seletividade: possvel escolher onde um determinado componente da amostra absorve e outros no otimizar eluies por gradiente: selecionar onde a fase mvel no apresenta variao de absorbncia com a concentrao obteno do espectro de absorvncia de cada componente da amostra durante sua eluio (arranjo de diodos) ou interrompendo a vazo da fase mvel no momento de deteco

DETECTORES DE ABSORVNCIA comprimento de onda varivel

ESQUEMA DE UM DETECTOR DE ABSORVNCIA NO UV-VIS COM COMPRIMENTO DE ONDA VARIVEL

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DETECTORES DE ABSORVNCIA arranjo de diodos

alto custo relativamente complexo toda a luz da fonte passa pela cela da amostra a luz emergente dispersada por uma grade hologrfica (rede de difrao a radiao dispersada resultante (comprimentos de onda distintos) focalizada sobre uma fila de fotodiodos (256-512nm) todo o espectro da substncia passando pelo detector armazenado no microcomputador

DETECTORES DE ABSORVNCIA arranjo de diodos

possvel exibir um cromatograma para cada comprimento de onda selecionado possvel exibir o espectro em cada tempo determinado, ou seja, o espectro do pico cromatogrfico
Figura IX-13 Collins p223

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DETECTORES DE ABSORVNCIA no infra-vermelho


a absorvncia na regio do infra-vermelho pode ser usada como detector universal ou especfico sensibilidade em geral muito pequena usados principalmente em sistemas de cromatografia por excluso tcnica de parar a vazo da fase mvel com a amostra na cela e tirar o espectro infravermelho limitado a fases mveis transparentes no comprimento de onda utilizado

DETECTORES DE FLUORESCNCIA
deteco especfica para compostos que fluorescem e uma das mais sensveis tcnicas de deteco (picogramas, 10-12g); comparvel ao detector por captura de eltrons em GC alta intensidade de fluorescncia esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou que no podem produzir estruturas fortemente inicas reaes de derivao ps-coluna (esterides podem produzir fluorescncia quando aquecidos com cido sulfrico) aplicaes: rea farmacutica, alimentos, caracterizao de destilados do petrleo de alto p.e. fase mvel deve ser criteriosamente selecionada (intensidade de emisso depende do meio; efeito quencher)

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ESQUEMA DE UM DETECTOR POR FLUORESCNCIA

filtro primrio escolhido para deixar passar somente o comprimento de onda de excitao filtro secundrio escolhido para eliminar o comprimento de onda excitante, e deixar passar o comprimento de onda emitido pela amostra

DETECTORES POR NDICE DE REFRAO


acompanha continuamente a diferena de no ndice de refrao entre a fase mvel e o efluente que sai da coluna resposta universal e sensibilidade moderada (micrograma, 10-6g) controle rigoroso de temperatura (0,001 C): circulao de gua de uma fonte termostatizada atravs do refratmetro ou controle da temperatura ambiente sensvel a variaes de vazo e mudanas na composio da fase mvel (dificulta/impede seu uso na eluio por gradiente); difcil encontrar um par de solventes com ndices de refrao idnticos no so instrumentos muito estveis, nem de fcil manipulao emprego mais importante: em cromatografia por excluso (polmeros, amostras de interesse biolgico) e em cromatografia preparativa

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ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMTRICO tipo Fresnel


na interface entre um prisma de vidro e um lquido, a quantidade de luz transmitida e refletida proporcional ao ngulo de incidncia da luz e ao ndice de refrao do lquido a luz da fonte atravessa um seletor, um filtro de infravermelho, outro seletor e uma lente os seletores e a lente produzem dois raios colimados que entram no prisma e incidem sobre a interface vidro-lquido das celas de referncia e amostra o ajuste grosso e fino do ngulo de incidncia nas interfaces realizado atravs da rotao do corpo do projetor

ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMTRICO tipo Fresnel


as celas so cavidades ovaladas de teflon (3 L) presas entre o prisma e a uma placa de ao inoxidvel que contm os tubos de entrada e sada a diferena de intensidade da luz transmitida atravs das celas funo do Ind. Refr. de ambos os lquidos e se determina por meio de um fotodetector duplo, o qual gera um sinal eltrico, transmitido para o registrador desvantagem: para cobrir a faixa de Ind. Refr. normal ( = 1,31 a 1,63), so necessrios dois prismas

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ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMTRICO por deflexo


a luz emitida pela fonte limitada pelo seletor, colimada pela lente e passa atravs da clula

a cela tem os compartimentos de amostra e referncia separados por um pedao de vidro quando a composio da fase mvel muda na cela da amostra, a mudana do ndice de refrao causa uma deflexo na posio final do raio de luz no fotodetector

ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMTRICO por deflexo


uma luz incidente passa atravs da cela, deflectada, refletida pelo espelho atrs da cela e, de novo defletada a lente focaliza a luz deflectada no fotodetector que produz um sinal eltrico proporcional posio da luz o sinal ento amplificado e registrado detector por deflexo possui ampla faixa de linearidade menos sensvel a variaes de temperatura muito sensvel aa vibraes ou movimento do instrumento celas no so to pequenas como as do tipo Fresnel (10 a 15 L)

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DETECTORES outros tipos


detectores eletroqumicos: alta seletividade (anlise de traos); princpios: amperometria, polarografia, coulometria e conductometria; uso comum do detector condutomtrico: cromatografia por troca inica, por excluso ou fase reversa por pares de ons detectores de espalhamento de luz por evaporao: efluente da coluna passa por nebulizador no qual convertido em uma nvoa fina por um fluxo de nitrognio ou ar; as gotculas so ento conduzidas atravs de um tubo com temperatura controlada no qual ocorre evaporao da fase mvel, levando formao de finas partculas do soluto; a nuvem de partculas do soluto passa atravs de um feixe de laser; a radiao espalhada detectada perpendicularmente ao fluxo por um fotodiodo detectores de radioatividade: projetados para detectar solutos radiomarcados; aplicaes cromatogrficas com emissores ou - forte (131I, 210Po e 125Sb),usando sistemas de cintilao ou mesmo contador Geiger, tm sido reportados

DETECTORES espectrometria de massas


PRINCPIO: analito ionizado na fonte; ons com razo carga-massa (m/z) discreta so separados e focalizados no analizador de massas; o feixe focalizado atinge um detector (electron multiplier) que determina sua intensidade FONTE DE ONS (mtodos de ionizao): electron ionization (EI), chemical ionization (CI), fast-atom bombardment (FAB), electrospray ionization (ESI), thermospray (TSI), laser desorption (LD) so utilizadas nas aplicaes de cromatografia a lquido ANALIZADOR DE MASSAS magnetic sector, quadrupole, time-offlight (TOF), Fourier transform ion cyclotron esonance (ICR) exemplo: LCQ (Finningan): ESI, octapole (quadrupolo duplo), seguido de um ion-trap

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P4. PR-TRATAMENTO DE AMOSTRAS PARA CROMATOGRAFIA 1. Introduo 2. Tipo de amostras 3. Processamento preliminar de amostras slidas e semi-slidas 3.a. Reduo do tamanho de partcula 3.b. Secagem da amostra 3.c. Filtrao 4. Pr-tratamento de amostras lquidas 4.a. LLE 4.b. SPE 4.c. SPME 4.d. MSPD (matrix solid-phase dispersion) 4.c. Membranas 5. Pr-tratamento de amostras slidas 5.a. Mtodos tradicionais de extrao 5.b. SFE 5.c. Microwave-assisted Solvent Extraction 5.d. Accelerated Solvent Extraction 6. Column switching 7. Derivatizao 7.a. Detectabilidade (UV e fluorescncia) 7.b. Derivatizao pr e ps-coluna
Snyder p100; anotaes Emanuel Carrilho

OPES PARA PR-TRATAMENTO DE AMOSTRA


AMOSTRAGEM: amostra representativa (procedimentos estatsticos) ESTOCAGEM E PRESERVAO: frascos apropriados; compostos volteis, instveis ou reativos requerem tratamento especial; amostras biolgicas podem requerer congelamento PROCESSAMENTO PRELIMINAR: secagem; moagem; peneiramento PESAGEM E DILUIO: material volumtrico aferido e balanas aferidas MTODOS ALTERNATIVOS DE PROCESSAMENTO: troca de solvente; dessalinizao; evaporao, freeze-drying REMOO DE PARTICULADOS: filtrao; SPE; centrifugao EXTRAO: mtodos para amostras lquidas e slidas (tabelas a seguir) DERIVAO: aumentar a detectabilidade; promover a separao

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MTODOS TPICOS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS GASOSAS


princpios e comentrios CAPTURA EM FASE SLIDA: amostra gasosa passa atravs de um tubo contendo sorvente (slica gel, carvo ativo); os analitos so capturados e eludos posteriormente com um solvente forte; vazo deve ser controlada para evitar formao de aerossis, sobrecarga e adsoro irreversvel do analito; complexantes podem ser adicionados para melhorar eficincia da captura (purge and trap technique) CAPTURA EM LQUIDO: amostra gasosa passada por uma soluo que captura os analitos; vazo de gs deve ser baixa o suficiente para no criar espumas ou aerossis; complexante pode ser adicionado ao solvente para auxiliar captura;temperatura pode ser baixada para espcies volteis

MTODOS TPICOS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS LQUIDAS


princpios e comentrios EXTRAO EM FASE SLIDA: amostra lquida passa atravs de uma fase slida que remove seletivamente o analito; analito ento eludo com solvente forte; em alguns casos os interferentes so retidos; vrias fases disponveis comercialmente para uma ampla faixa de aplicaes (anlise de traos) EXTRAO QUIDO-LQUIDO: amostra distribuda entre 2 fases imiscveis, escolhidas para apresentarem a mior diferena possvel de solubilidade; formao de emulses possvel (quebrar com aquecimento, adio de sal); o coeficiente de distribuio, KD, alterado pelo tipo de solvente e aditivos (tampes para ajuste de pH, sais para ajuste de fora inica, agentes complexantes, reagentes para pareamento inico); recomenda-se extrao contnua para KD pequenos ou grandes volumes

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MTODOS TPICOS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS LQUIDAS


DILUIO: amostra diluda com solvente apropriado para a fase mvel escolhida; para evitar sobrecarga (overload) ou para estar dentro da faixa linear de resposta do detector; para evitar alargamento de banda, solvente da amostra no seve ser muito forte comparado com a fase mvel; dilute and shoot EVAPORAO: lquido removido por aquecimento brando a presso ambiente sob fluxo de ar ou gs inerte ou sob vcuo; perdas de amostras podem ocorrer por evaporao rpida, adsoro nas paredes do frasco; uos de gases inertes aconselhvel; evaporador rotatrio; sistemas automatizados (Turbovap) DESTILAO: amostra aquecida ao ponto de ebulio do solvente e analitos volteis so concentrados na fase de vapor, condensados e coletados; uso limitado para amostras facilmente volatilizadas; amostra pode decompor se aquecida em demasia; destilao a vcuo, por arraste de vapor so recomendadas

MTODOS TPICOS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS LQUIDAS


MICRODILISE: membrana semipermevel colocada entre 2 fases aquosas lquidas e os solutos so transferidos de um lquido para outro de acordo com suas concentraes diferenciais; tcnicas de enriquecimento, como SPE, so por vezes requeridas para concentrao dializatos; microdilise usada para exame de fluidos extracelulares em tecidos de plantas e animais, em estudos de fermentao; j foi usada on-line com micro-LC; dilise com membranas especficas para certas massas moleculares so amplamente usadas para desproteinizar amostras antes da injeo cromatogrfica; ultrafiltrao e osmose reversa so usadas de forma semelhante LIOFILIZAO: amostra aquosa congelada e a gua removida por sublimao sob vcuo; excelente para compostos no volteis; grandes quantidades de amostra podem ser manipuladas; possvel perda de componentes volteis; sais inorgnicos so concentrados no processo

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MTODOS TPICOS DE PR-TRATAMENTO PARA SUSPENSES


princpios e comentrios FILTRAO: amostra passada atravs de filtros de papel ou membrana para remover partculas em suspenso; altamente recomendado para prevenir problemas com presso de retorno e para preservar a vida da coluna; filtros de membrana devem ser compatveis com o solvente para evitar sua dissoluo durante o tratamento da amostra; uso de filtros de alta porosidade (>2 m) recomendado para vazes altas e filtros de posidade baixa (<0,2 m) so usados para remover batrias CENTRIFUGAO: amostra colocada no tubo da centrfuga fechado e submetida a alta rotao para decantao; remoo dos slidos do fundo do tubo pode apresentar problemas prticos; ideal quando o sobrenadante contm o analito de interesse

MTODOS TPICOS DE PR-TRATAMENTO PARA SUSPENSES


SEDIMENTAO: amostra levada sedimentao em um tanque, permanecendo al por um tempo longo; velocidade de decantao depende do raio de Stokes; processo extremamente lento; recuperao manual de partculas de diferentes tamanhos pode ser obtida em tempo determinados, que dependem da velocidade de sedimentao

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MTODOS TRADICIONAIS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS SLIDAS

princpios e comentrios

EXTRAO LQUIDO-SLIDO: amostra colocada em um frasco fechado e solvente adicionado para dissolver o analito de interesse; soluo separada do slido por filtrao (shaker/filter method); solvente algumas vezes aquecido ou usado sob refluxo para aumentar a solubilidade; amostra deve ser finamente dividida; amostra pode ser agitada manualmente ou automaticamente; amostra filtrada, decantada ou centrifugada para separar slidos insolveis EXTRAO EM SOXHLET: amostra colocada em um reservatrio poroso descartvel (thimble (dedal) ou papel); refluxo constante de solvente passa pelo dedal e dissolve os analitos de interesse que so coletados continuamente em um frasco de destilao; extrao ocorre em solvente puro; amostra deve ser estvel no p.e. do solvente; lento, mas o processo no necessita superviso (extrao exaustiva); barato; recuperaes excelentes; em geral usado como mtodo de referncia

MTODOS TRADICIONAIS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS SLIDAS


FORCED-FLOW LEACHING: amostra colocada em um tubo pelo qual forada a passagem de solvente; tubo aquecido a temperaturas prximas ebulio do solvente; adequado para amostras particuladas; solvente deve ser bombeado ou forado atravs da amostra com o auxlio de presso externa (nitrognio); requer um volume menor que o Soxhlet, com recuperaes semelhantes e mais rpida HOMOGENEIZAO: amostra colocada em um liquidificador (blender) juntamente com solvente; amostra dividida em finamente durante processo; solvente filtrado para tratamento posterior; usado para tecidos de plantas e animais, na anlise de alimentos e amostras ambientais; solventes orgnicos ou inorgnicos podem ser usados; gelo seco ou terra diatomceas podem ser adicionados

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MTODOS TRADICIONAIS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS SLIDAS


SONICAO: amostra finamente dividida dispersa em solvente e submetida radiao em um banho de ultra-som; dissoluo promovida pelo processo de ultra-som; banho pode ser aquecido; seguro; rpido; melhor para partculas grossas ou materiais granulares; contato eficiente da amsotra e solvente DISSOLUO: amostra tratada com solvente extrator e levada diretamente soluo com ou sem reao qumica; slidos inorgnicos requerem solues cidas ou bsicas para dissoluo completa; amostras orgncias podem ser dissolvidas diretamente em solvente; filtrao pode ser indicada aps dissoluo

MTODOS MODERNOS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS SLIDAS

princpios e comentrios

ACCELERATED SOLVENT EXTRACTION (ASE): amostra colocada em um frasco apropriado fechado e aquecida acima do seu ponto de ebulio, causando um aumento de presso no frasco; amostra extrada removida automaticamente e transferida para um vial para tratamento posterior; aumenta grandemente o processo de extrao slido-lquido; automatizado; amostra extrada diluda, portanto deve ser posteriormente concentrada; questes de segurana EXTRAO EM SOXHLET AUTOMATIZADA: combinao de solvente aquecido e extrao em Soxhlet; amostra colocada no thimble (dedal?) e imersa em solvente aquecido; em seguida procede-se extrao por Soxhlet convencional; usa menos solvente que a extrao convencional; solvente recuperado para uso posterior; diminui o tempo de extrao devido ao processamento em duas etapas

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MTODOS MODERNOS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS SLIDAS


EXTRAO EM FLUIDO SUPERCRTICO: amostra colocada em um frasco apropriado fechado onde um fluido supercrtico (CO2, por exemplo) passado; aps despressurizao do sistema, o analito extrado coletado diretamente em solvente ou capturado em um sorvente slido, requerendo dessoro deste ltimo por passagem de solvente; verses automatizadas e manuais esto disponveis; modificao da polaridade do fluido, sua densidade pode ser alterada pela adio de solvente; amostra coletada geralmente concentrada e livre de contaminantes (CO2 removido aps extrao)

MTODOS MODERNOS DE PR-TRATAMENTO PARA AMOSTRAS SLIDAS


EXTRAO ASSISTIDA POR MICRO-ONDAS: amostra colocada em um frasco aberto ou fechado, com solvente apropriado, e aquecida pela energia de micro-ondas; solvente de extrao pode absorver a radiao do micro-ondas ou no; no primeiro caso, a amostra colocada em um frasco especial que resiste a altas presses e aquecida a temperaturas bem superiores ao seu p.e.; no caso do solvente no absorvente de radiao micro-ondas, o frasco pode ser aberto, pois no h aumento de presso; precaues com uso de solventes orgnicos e altas presses EXTRAO TRMICA: forma de amostragem por headspace onde a amostra aquecida a temperaturas elevadas (at 350 C); sistema pode ser construdo com quartzo ou slica fundida para evitar reao dos analitos extrados com o material do frasco; usado para solutos com baixa presso de vapor

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SPE SELEO DE FASES E SOLVENTE


AMOSTRA MM<2000 SOLVEL EM GUA INICA CATINICA ANINICA POLAR MODERADAMENTE POLAR APOLAR NO-INICA INSOLVEL EM GUA

Figura 4.7 Snyder p133

SPE SELEO DE FASES E SOLVENTE


AMOSTRA MM<2000 INICA CATINICA CEX -COOH (WCX) -SO3H (SCX) tampes cidos
Figura 4.7 Snyder p133

SOLVEL EM GUA NO-INICA ANINICA AEX amino (WAX); 1,2-diamino (WAX); quat. amino (SAX) tampes bsicos

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SPE SELEO DE FASES E SOLVENTE


AMOSTRA MM<2000 INICA POLAR n-BPC -CN; diol; 1,2diamino C6; CHCl3; CH2Cl2; acetona; MeOH; IPA
Figura 4.7 Snyder p133

SOLVEL EM GUA NO-INICA MODERADAMENTE POLAR LSC SiO2; florisil; alumina C6; CHCl3; CH2Cl2; EtOAc; MeOH; IPA APOLAR RPC C18; C8; ciclohexil; fenil; C2; C4; -CN C6; CH2Cl2; MeOH; H2O

SPE SELEO DE FASES E SOLVENTE


AMOSTRA MM<2000 INSOLVEL EM GUA

POLAR n-BPC -CN; diol; 1,2diamino C6; CHCl3; CH2Cl2; acetona


Figura 4.7 Snyder p133

MODERADAMENTE POLAR LSC SiO2; florisil; alumina C6; CHCl3; CH2Cl2; EtOAc; MeOH; IPA

APOLAR

RPC C18; C8; ciclohexil; fenil; C2; C4; -CN C6; CH2Cl2; acetona; ACN; MeOH; H2O

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P2. INTRODUO AOS MTODOS CROMATOGRFICOS EM FASE LQUIDA 17. Aplicaes 17.a. Fases tpicas 17.b. Exemplos

ESCOLHA DA TCNICA CROMATOGRFICA EM FUNO DAS CARACTERSTICAS DA AMOSTRA


MASSA MOLECULAR

< 2000

AMOSTRA

> 2000
Figura IX-2 Collins p 194

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ALTA MASSA MOLECULAR


MASSA MOLECULAR PROPRIEDADES

INSOLVEL EM GUA NOINICO SOLVEL EM GUA BSICO INICO CIDO


Figura IX-2 Collins p 194

> 2000

SP: sulfopropil DEAE: dietilaminoetil

CE: cromatografia por excluso CTI: cromatografia por troca inica

> 2000 INSOLVEL EM GUA SOLVEL EM GUA NOINICO

MODALIDADE

FASE FASE MVEL ESTACIONRIA tpica tpica

CE

gel de poliestireno gel de dextrano SPdextrano DEAEdextrano

THF CHCl3 H2 O MeOH tampo aquoso tampo aquoso

CE

BSICO INICO CIDO

CTI CTI

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BAIXA MASSA MOLECULAR


MASSA PROPRIEDADES MOLECULAR

SOLVEL EM HEXANO SOLVEL EM METANOL NOINICO INICO

NO POLAR MODERADAMENTE POLAR POLAR BASE FORTE BASE FRACA CIDO FORTE CIDO FRACO

INSOLVEL EM GUA

< 2000 SOLVEL EM GUA

Figura IX-2 Collins p 194

FR: fase reversa FN: fase normal CN-nitrilo silca*=slica desativada ACN=acetonitrila MeOH=metanol pr-OH: propanol CLFL: cromatografia em fase ligada CLS: cromatografia lquido-slido

< 2000 INSOLVEL EM GUA

MODALIDADE

FASE FASE MVEL ESTACIONRIA tpica tpica

NO POLAR moderada mente POLAR

CLS CLFL/FR

slica C18 C8 slica slica* CN C8

n-C7H16/ CHCl3/C6H5CH3 MeOH/H2O ACN/H2O MeOH/H2O n-C7H16/CHCl3 n-C7H16/CHCl3 n-C7H16/ CHCl3/pr-OH ACN/H2O

SOLVEL EM HEXANO SOLVEL EM METANOL

CLFL/FR CLS CLS

POLAR

CLFL/FN CLFL/FR

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FR: fase reversa pi: pareamento inico MeOH: metanol ACN: acetonitrila AHS: c. hexanossulfnico TBA: hidrxido de tetrabultilamnio CLFL: cromatografia em fase ligada CTI: cromatografia por troca inica

< 2000 SOLVEL EM GUA NOINICO INICO BASE FORTE BASE FRACA

MODALIDADE

FASE FASE MVEL ESTACIONRIA tpica tpica

CLFL/FR

C18

MeOH/H2O ACN/H2O

CTI CLFL/FR-pi CTI CLFL/FR-pi

trocador de ctions C18 trocador de nions C18

tampo aquoso AHS/H2O tampo aquoso TBA/H2O

CIDO FORTE CIDO FRACO

P2. INTRODUO AOS MTODOS CROMATOGRFICOS EM FASE LQUIDA P10. DETECTORES PTICOS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA 14. Mtodos qualitativos 15. Mtodos quantitativos 16. Validao

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MTODOS QUALITATIVOS

Spiking com padres Razo de comprimentos de onda (antigas anotaes de CE) Coleta de fraes para IR, NMR e MS (MS como detector)

MTODOS QUANTITATIVOS

MEDIDA DO SINAL: rudo (constante de tempo) altura de pico rea de pico MTODO QUANTITATIVO Normalizao da rea Fator de resposta Calibrao externa Padronizao interna Adio de padro FONTES DE ERRO ANLISE DE TRAOS
Collins p168; Snyder p 643

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VALIDAO EXATIDO comparao com padro de referncia recuperao adio de padro PRECISO LINEARIDADE INTERVALO LINEAR LIMITE DE DETECO LIMITE DE QUANTIFICAO ESPECIFICIDADE spiking com interferentes degradao da amostra aquisio de dados cross-check
Snyder p685; artigos: Ira Krull, Anal Chem,, USP25

ROBUSTEZ RESISTNCIA ESTABILIDADE EQUIVALNCIA t-teste F-teste ANOVA Q-teste

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