CROMATOGRAFIA

Marilena Meira

1. Histórico
Em 1903, o botânico russo Mikhail Tswett conseguiu separar pigmentos vegetais passando, através de uma coluna contendo CaCO3, uma solução de pigmentos dissolvidos em um hidrocarboneto.

Obteve um registro colorido do processo de separação cromatos: cor ; grafia: registro = CROMATOGRAFIA.

2. Definição de Cromatografia:
Método físico-químico de separação baseado na migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes graus de interação entre duas fases imiscíveis, uma móvel e outra fixa. • Fase móvel: solvente (gás ou líquido) que se move através do sistema (coluna ou placa), carregando os solutos. • Fase Estacionária: sólido (ou líquido impregnado em um sólido) que permanece fixo no sistema (coluna ou placa).

3. CLASSIFICAÇÃO
1. PELA FORMA FÍSICA DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO:
• • CROMATOGRAFIA PLANAR CROMATOGRAFIA EM COLUNA

2. PELA FASE MÓVEL EMPREGADA:
• • • LÍQUIDA GASOSA SUPERCRÍTICA

3. PELA FASE ESTACIONÁRIA UTILIZADA: • SÓLIDA • LÍQUIDA • QUIMICAMENTE LIGADA 4. PELO MODO DE SEPARAÇÃO: • ADSORÇÃO • PARTIÇÃO • TROCA IÔNICA • EXCLUSÃO

CROMATOGRAFIA

TÉCNICA

PLANAR

COLUNA

FASE MÓVEL

LÍQUIDA

LÍQUIDA

GASOSA

FASE ESTACIONÁRIA

LÍQUIDA

SÓLIDA

LÍQUIDA

SÓLIDA

LÍQUIDA

SÓLIDA

CP

CCD

CLL

CLS; CE

CGL

CGS

4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
1. CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO OU LÍQUIDOLÍQUIDO (CLL) 2. CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI) 3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE) 4. CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO OU LÍQUIDO-SÓLIDO (CLS)
CL CLS CTI CE

CLL

4.1. CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO OU LÍQUIDO-LÍQUIDO (CLL)
• A separação é baseada nos diferentes coeficientes de partição (solubilidade) dos componentes da mistura entre dois solventes imiscíveis, um fixo (fase estacionária) imobilizado na superfície de um suporte sólido e o outro móvel.

FASE MÓVEL

F. ESTACIONÁRIA

EXEMPLO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDOLÍQUIDO: CROMATOGRAFIA EM PAPEL (CP) • A celulose do papel forma pontes de hidrogênio com a água, que fica retida formando a fase estacionária. • A separação da mistura é baseada nas diferentes solubilidades relativas dos componentes na fase móvel e estacionária. • A fase móvel sobe por ação capilar. • Os componentes mais solúveis na fase estacionária serão seletivamente retidos, tendo uma movimentação mais lenta.

FATOR DE RETENÇÃO (Rf)
Rf =
Distância percorrida pela substância Distância percorrida pela fase móvel

dm
ds1 ds2

Rf = ds dm

SUBSTÂNCIAS SEPARADAS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL
• COMPOSTOS HIDRÓFILOS (HIDROSSOLÚVEIS) COMO ÁCIDOS ORGÂNICOS E ÍONS METÁLICOS.

4.2.CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)
Trocador catiônico

+
+

Trocador aniônico

+ -

• A fase estacionária é constituída por uma matriz com grupos funcionais ionizáveis. • Trocadores catiônicos, têm sítios carregados negativamente adsorvendo cátions. • Trocadores aniônicos têm sítios ativos carregados positivamente adsorvendo ânions.

TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAS NA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)
• Derivados sulfônicos de copolímeros do estireno e divinilbenzeno. Fortemente catiônica. • Amina quaternária de copolímeros do estireno e divinilbenzeno. Fortemente aniônica. • Resinas com o grupo ácido carboxílico. Fracamente catiônicas. • Resina com o grupo funcional amina primária. Fracamente aniônicas. • Derivada da celulose: por tratamento químico, em geral sulfonação. • Sílica-gel impregnada com trocadores iônicos líquidos (ex: triisoctilamina)

TROCADOR CATIÔNICO: ESTIRENODIVINILBENZENO SULFONADO.
CH C CH C CH C H2 H2 H2

CH CH2

SO3-H+ SO3-H+ CH C CH C CH C H2 H2 H2

CH

SO3-H+ C CH C CH C CH C H2 H2 H2 H2

SO3-H+

CH

SO3-H+ CH

TROCADOR ANIÔNICO: AMINA TERCIÁRIA ESTIRENO-DIVINILBENZENO.
CH C CH C CH C H2 H2 H2

CH2NR3+OH-

CH2NR3+OH-

CH CH2

CH C CH C CH H2 H2

C H2

CH2NR3+OH-

CH2NR3+OH-

CH

C CH C CH C CH C H2 H2 H2 H2

CH

CH2NR3+OH-

CH

TIPOS DE FASES MÓVEIS NA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)

• Soluções tampões (pH 3,0 – 8,0): Tampão de Fosfato de pH = 8,0. Tampão de Fosfato de sódio de pH = 3,4. • Soluções de sal: 0,1 – 0,2 M de LiCl ou NaCl. • Água destilada. • Qualquer solvente orgânico.

4.3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE): Cromatografia de permeação ou filtração por gel • Baseia-se em um processo puramente mecânico. A fase estacionária é uma matriz de composição inerte, com partículas de forma, tamanho e porosidade uniformes. • As moléculas menores são capazes de penetrar em todos os poros da fase estacionária, ficando mais tempo retidas, enquanto as maiores são excluídas de todos os poros, passando entre os grânulos, arrastadas pela fase móvel.

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE):

A fase estacionária mais usada é um gel de dextrano (um polissacarídeo com unidades de glicose), conhecido comercialmente como Sephadex.

4.4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO: CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO
• Baseia-se na adsorção seletiva dos componentes da mistura pela fase estacionária por ação de forças eletrostáticas e nas diferentes solubilidades que estes componentes têm na fase móvel. • São exemplos: Cromatografia em coluna (CC) e Cromatografia em camada delgada comparativa e preparativa (CCDC e CCDP).

Adsorção e Absorção
• Absorção: penetração de um material na massa de outro por ação molecular ou química. A substância absorvida infiltra-se na substância que a absorve. • Adsorção: adesão das moléculas de um material sobre a superfície de um sólido ou líquido em que estas estão em contato. Quanto maior a superfície do adsorventes mais forte a adsorção.

Escolha do adsorvente e eluente na Cromatografia por Adsorção
• 1. 2. 3. Pontos a considerar: Características da amostra O Adsorvente ou fase estacionária O eluente ou fase móvel

Características da amostra:
1. 2. • • • Acidez, basicidade, caráter iônico, solubilidade, reatividade com o adsorvente e solventes, Constituição química: ligações duplas, particularmente conjugadas aumentam adsorção. Compostos com pontes de H intramoleculares são menos adsorvidos que seus isômeros. Grupos funcionais aumentam afinidade de adsorção. Este efeito decresce na ordem: COOH, -CONH2, -OH, -NHCOCH3, -NH2, OCOCH3, -COCH3, -NO2, -OCH3, -H, -Cl.

Pontes de hidrogênio intramoleculares fazem com que o composto seja menos adsorvido que seu isômero:
H O O OH COOH
2

OH

1

Com a formação das pontes de H intramoleculares, menos moléculas do composto orto (1), relativamente ao para (2) , estarão formando pontes de H com a sílica, daí maior rapidez na eluição.

1

2

Escolha do Adsorvente
COMPOSTOS LIPOFÍLICOS ADSORVENTES ÓXIDO DE ALUMÍNIO SÍLICA-GEL

HIDROFÍLICOS

CELULOSE CELULOSE COM TROCADORES DE ÍONS KIESELGUR POLIAMIDA

Principais adsorventes
• Sílica-gel: Separa bem aldeídos, cetonas, alcalóides, açúcares, fenóis, esteróides, terpenóides, ácidos graxos e aminoácidos. • Alumina ou óxido de alumínio: Útil na separação de hidrocarbonetos policíclicos, alcalóides, aminas, vitaminas lipossolúveis e algumas cetonas. Inadequado para flavonóides e cetonas insaturadas. • Kieselgur (Terras diatomáceas ou diatomita). Ácido silícico de origem fóssil. É utilizado como suporte nas separações por partição.

Principais adsorventes
• Óxido de magnésio: Usado para compostos aromáticos e substâncias com várias ligações duplas conjugadas (Ex: carotenóides). • Celulose e celulose modificada: Para compostos hidrofílicos (aminoácidos, ácidos nucléicos, açúcares, glicosídeos. • Poliamida: Separa flavonóides, fenóis, nitroanilinas, benzofenonas e derivados de aminoácidos.

Escolha da Fase móvel
• Sua escolha depende do adsorvente utilizado, sua atividade e da classe de compostos da amostra. • Misturas equieluotrópicas: Misturas de solventes distintas que originam iguais deslocamentos de uma mesma amostra.

Ordem crescente da capacidade eluotrópica do solvente
• • • • • • • • • • • • • • • • Éter de petróleo Hexano Tetracloreto de carbono Dissulfeto de carbono Benzeno Diclorometano Clorofórmio Éter dietílico Acetato de etila Éter dipropílico Propanol MeOH Piridina Água Ácido Orgânico diluído Fenol

4.4.1. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
Aplicações: 1. Para determinar o número de componentes de uma mistura. 2. Para determinar a identidade de duas substâncias. 3. Para monitorar o progresso de uma reação 4. Para determinar a eficiência de uma purificação. 5. Para determinar o melhor sistema de solvente para uma separação em coluna cromatográfica. 6. Para monitorar uma coluna cromatográfica.

CCD

UV 254 nm: detecta compostos aromáticos, compostos com duplas conjugadas e alguns compostos insaturados.

REVELADORES EM CCD
CLASSE Triterpenos e esteróides Flavonóides Alcalóides Compostos insaturados REVELADOR Reagente de Liebermann-Burchard Solução de cloreto de alumínio Reagente de Dragendorff Vapores de iodo

DETERMINAÇÃO DO MELHOR SISTEMA DE SOLVENTES PARA SEPARAÇÃO DE UMA MISTURA.

• Deve-se fazer uma série de placas por CCD em sistemas de diferentes polaridades com a mistura a ser separada. • O melhor sistema é aquele que dê um valor de Rf na faixa de 0,25-0,35 para o componente mais rápido na placa.

CALCULANDO O Rf

solvente 1 solvente Mais lento (álcool) Mais rápido (cetona) Rf álcool Rf cetona 3.95 0.6 1.45 0.15 0.37

solvente 2 3.9 0.35 1.0 0.09 0.26

solvente3 4.0 0.35 1.0 0.088 0.25

solvente 4 4.1 0.25 0.8 0.061 0.20

solvente 5

solvente6 4.0 0.1 0.6 0.025 0.15

solvente 7

4.0 0.1 0.65 0.025 0.16

4.05 0.1 0.45 0.025 0.11

O Rf do componente mais rápido deve estar na faixa de 0.25-0.35. Os solventes 1, 2 e 3 estão nesta faixa. Para uma melhor resolução a diferença de Rf de cada componente deve ser no mínimo 0,1: solvente 1: Rf cetone - Rf álcool = 0.37 - 0.15 = 0.22 solvente 2: Rf cetone - Rf álcool = 0.26 - 0.09 = 0.17 solvente 3: Rf cetone - Rf álcool = 0.25 - 0.088 = 0.16 Os sistemas 1, 2 e 3 dão diferença de Rf superior a 0,1. Escolhe-se o sistema 3 por ser o menos polar.

CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)

CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Pré-eluição

Empacotamento

Carregamento

ELUIÇÃO: EXEMPLO DE MONITORAÇÃO POR CCD • A amostra foi eluída com o sistema de solventes previamente escolhido por CCD. Recolheu-se 6 frações que foram testadas por CCD.
Eluição

CCD DAS SEIS PRIMEIRA FRAÇÕES

•Frações 1 e 2 não têm nenhum componente. •Nas Frações 3, 4 e 5 saiu o primeiro componente, deve-se juntar estas frações. •Pode-se agora aumentar a polaridade do sistema de solvente para sair o segundo componente.

CCD DAS FRAÇÕES 7 a 12

Nas frações 7, 8 e 9 saiu o segundo componente Nas frações 10 a 12 não saiu mais nada Pode-se encerrar a coluna e juntar 7, 8 e 9.

BIBLIOGRAFIA
• COLLINS, Carol H.; Braga, Gilberto L.; Bonato, Pierina S. Introdução a Métodos Cromatográficos. 7ª ed. Editora da Unicamp. 1997. Degani, A. L. ; Cass, Quezia B; Vieira, P. C. Cromatografia, um breve ensaio. Química Nova na Escola, 07, 21-25, 1988.

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