Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)

Instituto de Ciências Exatas

Depto. de Química

QUI 154 – Química Analítica V

Análise Instrumental

Aula 5 – Cromatografia Líquida

Julio C. J. Silva

Juiz de Fora, 2o semestre de 2018

 Introdução
• Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o tipo mais
versátil e mais amplamente empregado de cromatografia por
eluição.

• Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido, o qual

contém a amostra na forma de uma mistura de solutos.

• O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente

definido pelo mecanismo de separação ou pelo tipo de fase
estacionária:

• (1) partição ou cromatografia líquido-líquido;

• (2) adsorção ou cromatografia líquido-sólido;
• (3) troca iônica ou cromatografia de íons;
• (4) cromatografia por exclusão;
• (5) cromatografia por bioafinidade;
• (6) cromatografia quiral.
 CLAE (HPLC)
• Cromatografia líquida clássica (CLC) era realizada em
colunas de vidro com d.i. de 10 a 50 mm;

• Colunas recheadas com partículas sólidas recobertas com

um líquido adsorvido (FE);

• Recheada com partículas de 60 – 200 m;

• Não havia pressão para eluição (demorada);

• As tentativas de acelerar esse procedimento clássico por

meio da aplicação de vácuo ou pressão não foram efetivas
porque o aumento na vazão era acompanhado pela elevação
na altura de prato e pela redução da eficiência da coluna.

• Porém, a redução de H pode ser obtida reduzindo o

tamanho das partículas do recheio...
 CLAE (HPLC)

O efeito do tamanho de partícula do recheio e da vazão sobre a

altura de prato em CL
 CLAE (HPLC)
• Nos anos de 1970 que se desenvolveu a tecnologia para
produzir e utilizar recheios com diâmetros de partículas tão
pequenos como 1 a 10 µm;

• O termo cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é

empregado para distinguir essa tecnologia dos procedimentos
de CLC;

• Essa tecnologia necessitou de instrumentos capazes de

fornecer pressões de bombeamento muito mais altas que os
dispositivos simples que os precederam.

• Simultaneamente, os detectores foram desenvolvidos para

permitir o monitoramento contínuo dos efluentes das colunas.

• A cromatografia de coluna simples, contudo, ainda encontra

considerável uso para propósitos preparativos.
Tipos de CLAE (HPLC) x analito
 Instrumentação

• Cromatografia líquida moderna:

– Altas pressões de bombeamento  velocidades

razoáveis por recheios de partículas muito
pequenas (1 – 10 µm)

– Equipamentos mais complexos

– Equipamentos mais caros

Instrumentação
 Instrumentação
• Reservatório de fase móvel

• Sistemas de tratamento de solventes

– Gases dissolvidos e material particulado  devem ser

retirados

– Desgaseificadores  vácuo, sistemas de destilação,

aquecimento e agitação e sistema de “sparging”

– Sparging  sistema pelo qual os gases dissolvidos são

arrastados para fora de um solvente por pequenas bolhas
de um gás inerte e solúvel (ex. He)

– Eluição isocrática/gradiente
 Eluição
Isocrática/Gradiente

– Isocrático  constituição
do solvente permanece
constante

– Gradiente  composição do
solvente é alterada
 Sistema de Bombeamento
• Requisitos:
– Habilidade de gerar pressões altas (até 400 atm ou 6.000 psi)

– Saída livre de pulsação (solutos em baixas concentrações)

– Vazões na faixa 0,1 – 10 mL/min

– Reprodutibilidade relativa da vazão de 0,5% ou melhor

– Resistência a corrosão

• Tipos de bomba:
– De seringa

– Bomba recíproca

– Bomba pneumática de pressão

 Instrumentação
Sistema de Bombeamento
• Bomba de seringa (rosca):
– Saída livre de pulsação
– Pequena capacidade de volume ( ± 250 mL)
– Troca de solventes  difícil

http://www.analiticaweb.com.br/images/produtos/p52b318f8ccdb0/b
omba_infusao_phd_ultra_harvard.jpg
 Instrumentação
• Bomba recíproca:
– Fluxo pulsado que deve ser atenuado
– Pequeno volume interno
– Alta pressão de saída (10.000 spi)
– Eluição por gradiente
– Vazões constantes
 Instrumentação
Sistema de Injeção da Amostra
• Alça de amostragem
– Permite a escolha do volume (5 a 500 µL)
– Boa precisão ( 1%)

• Auto-amostradores
 Colunas para cromatografia

• Aço inoxidável

• Comprimento  10 a 30 cm

• Diâmetro (d.i.)  2 a 5 mm

• Recheio (sílica)  partículas de 3 – 10 µm

(altamente uniformes)

• Degradação  sujeiras ou partículas presentes na

amostra além de impurezas da amostra e da FM
(adsorção irreversível na FE)
 Colunas para cromatografia
• Pré-Coluna (guarda ou proteção)
– FE da coluna de guarda (curta) = FE da coluna
analítica (longa)
– Retém partículas
– Substancias fortemente adsorvidas na FE
– Aumenta a vida útil da coluna nalítica
– Reduz as perdas da FE da coluna analítica (saturada
a FM com FE)
– Troca periódica

• Aquecimento
–  Viscosidade   pressão   velocidade linear
–  Vida útil da coluna
Colunas para cromatografia
Colunas para cromatografia
 Fase Estacionária (partição)
• Cromatografia por partição  a fase estacionária
é um líquido imiscível com a fase móvel

• Cromatografia por partição líquido-líquido FE é

um solvente que é imobilizado por adsorção

• Cromatografia por partição com fase ligada  FE

é um composto orgânico imobilizado por ligações
químicas

• Amplamente empregada
 Detectores
• Pequeno volume morto (alargamento dos picos)

• Sensível

• Pequeno e compatível com a vazão de líquido

• Insensível a mudanças na temperatura/composição da FM

• Não deve formar bolhas (Sinal de BG)

• Não existe detector universal

• Tipos de detectores:
Detectores
Detector – UV-Vis
 Detector – UV-Vis
• Detectores mais usados

• Fotômetro (254 nm e 280 nm)

– Fontes: Hg, D2 ou W
– Filtros de interferência

• Espectrofotômetros
– Versáteis
– Varredura (arranjo de diodos)

• Detector de espectrometria de massas

Técnicas de CLAE
 CLAE POR PARTIÇÃO
• Mais usada

• FE é um líquido que é imiscível com o líquido da FM.

• Cromatografia líquido-líquido
– FE adsorvida fisicamente no suporte

• Cromatografia líquida com fase ligada.

– FE retida por meio de ligações químicas

– atualmente, contudo, os métodos de fase ligada

predominam por causa de sua maior
estabilidade.
 Recheios com fase ligada

Oragnosiloxano

• FE  diferentes polaridades Oragnoclarosilano

- Octil
- Octadecil
• Características: - Éteres
– Maior estabilidade - Nitrilas
- Hidrocarbonetos
– Compatível com CLAE por gradiente - Etc.
– Pequena capacidade de amostra

• Recheios de Fase Normal e Reversa

– Fase normal  A FE é polar e a fase móvel é apolar

– Fase reversa  A FE é apolar e a fase móvel é polar

 Escolha das Fases Móvel e Estacionária
• Deve-se levar em consideração as forças intermoleculares
existentes entre: Analito, FM e FE

• Forças intermoleculares são descritas qualitativamente em

termos da polaridade relativa de cada um dos três
componentes.

• Em geral, as polaridades dos grupos funcionais orgânicos na

ordem crescente são:

• hidrocarbonetos alifáticos  olefinas  hidrocarbonetos

aromáticos  haletos  sulfetos  éteres  compostos nitro 
ésteres aldeídos cetonas  alcoóis ≈ aminas  sulfonas 
sulfóxidos  amidas  ácidos carboxílicos  água.

• Polaridade dos solventes como FM: agua  acetonitrila 

metanol  etanol  tetraidrofurano  propanol  cicloexano 
hexano.
 Escolha das Fases Móvel e Estacionária

• Regra geral:

 iguala-se a polaridade do analito com a da FE

 Usas-se uma FM com polaridade diferente da FE

 Analito e FM com polaridades semelhantes não é vantajoso...

 Analito e FE com polaridades muito parecidas também não é

vantajoso...
 CLAE Líquido-Sólido (Adsorção)
• CLAE por adsorção  Os analitos são adsorvidos sobre
uma superfície de um sólido polar finamente dividido
(recheio)

• FE polar - partículas de sílica ou alumina

• FM apolar - constituída por um solvente orgânico ou por

uma mistura de solventes orgânicos (ex: hexano,
heptano, diclorometano, tetrahidrofurano, etc.)

• Coeficiente de distribuição (K)  só depende da FM !

• CCD e CLS
 Tipos de CLAE (Troca Iônica)
• Existem dois tipos  Baseadas em supressores e coluna
única

• Cromatografia de íons baseadas no uso de supressores:

• Detector de condutividade  sensíveis, universais para

espécies carregadas, simples, baixo custo e fáceis de serem
miniaturizados

• Limitação  alta concentração de eletrólito para eluição da

maioria dos íons dos analitos

• Consequentemente  alta condutividade e baixa

sensibilidade

• Porém, em 1975...
 Tipos de CLAE (Troca Iônica)

• Coluna supressora de eluente  coluna recheada com uma

resina trocadora de íons que converte os íons do solvente de
eluição para espécies moleculares de ionização limitada

• Na determinação de cátions (Eluente = HCl):

• Na determinação de anions (Eluente = NaHCO3):

 Tipos de CLAE (Troca Iônica)

Supressora Coluna
Tipos de CLAE (Troca Iônica)

Coluna de guarda
Tipos de CLAE (troca iônica)
 Tipos de CLAE (Exclusão)

• O fracionamento é baseado nos tamanhos

das moléculas

• Filtração em gel  recheio hidrofílico

(espécies polares)

• Permeação em gel  recheio hidrofóbico

(espécies apolares)
CLAE versus CG
 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Silva, L.L.R. Notas de Aula. FACET, UFVJM, 2008.

- Juliano, V. F. Notas de Aula. Depto de Química. UFMG. 2010
- Faria, L.C. Notas de Aula. Instituto de Química. UFG. 1995
-D. A. SKOOG, F. J. HOLLER e T. A. NIEMAN – Princípios de Análise
Instrumental, 5a ed., Saunders, 2002.
- A. I. VOGEL - Análise Analítica Quantitativa, LTC, 6ª ed., Rio de Janeiro.

- Galen W. Ewing. Métodos Instrumentais de Análise Química (Volume 1).

Editora Edgard Blücher/Ed. da Universida
- Cadore, S. Notas de Aula. IQ, UNICAMP, 2004.
- SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A., Princípios de Análise
Instrumental, 5ª edição, Editora Bookman, 2006.
- COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Fundamentos de Cromatografia,
Editora Unicamp, 2006.