Departamento de Bioquímica

Instituto de Química - USP

PROBLEMAS

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

QBQ 0316-Diurno
2018

Professores:
Carlos T Hotta
Ohara Augusto

Monitores:
Caio MPP Faria
Luiz Eduardo R Firmino

1
1. Foram preparados três lisados de levedura com uma volume total de 5 mL, os quais
foram utilizados para determinação da concentração de proteína total através do
reagente de Bradford (Coomassie Blue G). Com base nos dados dos experimentos
abaixo, calcule a concentração de proteína total de cada lisado.

Experimento 1:
Usando uma solução de albumina 1g/L foram preparados os tubos abaixo
Tubo Solução de Água Reagente de Absorbância em 595nm após 5
albumina (L) Bradford min de incubação
(L) (mL)
1 0,5 99,5 1 0,002
2 1 99 1 0,001
3 2 98 1 0,1
4 4 96 1 0,18
5 6 94 1 0,32
6 8 92 1 0,4
7 10 90 1 0,51
8 12 88 1 0,6
9 14 86 1 0,7
10 16 84 1 1,7
11 18 82 1 0,9
12 20 80 1 1
13 30 70 1 1,02
14 40 60 1 1,05

Experimento 2
Usando os três diferentes lisados foram preparados os tubos abaixo.

Tubo Diluição Reagente de Absorbância em

prévia Bradford 595nm após 5 min de
Lisado A (mL) (mL) incubação
1 0,1 Sem diluir 1 2
2 0,1 2x 1 0,55

Lisado B (mL)
3 0,1 5x 1 0,32
4 0,1 10x 1 0,15

Lisado C (mL)
5 0,1 Sem diluir 1 0,32
6 0,1 200x 1 0,01

2. Um aluno fez dois ensaios para a detecção da atividade enzimática da -

glicosidase. No primeiro ensaio o lisado de células de levedura foi diluído 20 vezes,
enquanto que no segundo ensaio a diluição usada foi de 2 vezes. Abaixo seguem as
condições de ensaio e os resultados.

Condições do ensaio
Substrato: p-nitrofenil alfa-glicosídeo 4 mM preparado em tampão citrato-fosfato 50
mM pH 6
Enzima: Lisado de levedura preparado em tampão fosfato 20 mM, pH 7.
Ensaio: 0,2 mL de lisado diluído (20 vezes ou 2 vezes) + 0,2 mL de substrato

2
 Incubação a 30°C por diferentes intervalos de tempo. Interrupção com tampão
carbonato.
Equação da curva-padrão de p-nitrofenolado (A420nm x nmoles de p-nitrofenolato): y =
0,0061x + 0,0097

Resultados experimentais
lisado 20x lisado 2x
tempo (min) A420nm A420nm
5 0,107 0,986
10 0,205 1,718
15 0,303 2,206
20 0,400 2,694

Baseando-se nos dados acima responda:

a) Qual a concentração de atividade de -glicosidase no lisado de levedura?

Apresente gráficos e cálculos para justificar a resposta.

b) Os resultados obtidos nas duas diferentes diluições são coerentes entre si?
Justifique sua resposta explicando os resultados obtidos.

3. Uma indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes linhagens.

Em todas as amostras usou 1 g de células e obtiveram 10 mL de lisado. Esses lisados
foram utilizados para ensaios enzimáticos, empregando p-nitrofenil α-glicosídeo
(pNPαglc) como substrato (curva padrão: y= 0.0061 + 0.097; onde y=Abs420nm e
x=nmol). Foram obtidos os resultados a seguir:

linhagem diluição lisado água pNPαglc Abs420 nm Abs420 nm Abs420 nm Abs420 nm

diluído (µl) (µl) (µl) (15 min) (30 min) (45 min) (60 min)
A 100x 100 100 200 0,050 0,100 0,150 0,200
B 50x 20 180 200 0,080 0,160 0,240 0,320
C 8x 50 150 200 0,250 0,500 0,750 1,000
D 70x 200 0 200 0,100 0,200 0,300 0,400
E 500x 200 0 200 0,010 0,020 0,030 0,040
F 200x 200 0 200 0,075 0,150 0,225 0,300

As mesmas amostras foram submetidas à determinação de proteínas com o reagente

de Bradford (Coomassie blue G), obtendo-se os dados a seguir:

linhagem diluição lisado água (µl) Reagente Abs595 nm

diluído (µl) Bradford (15 min)
(ml)
A 20x 100 0 1 0,265
B 50x 20 80 1 0,320
C 10x 50 50 1 0,50
D 20x 80 20 1 0,105
E 5x 10 90 1 0,750
F 80x 100 0 1 0,415

Confeccionou-se também uma curva padrão usando albumina de ovo:

3
 Albumina água (µl) Reagente Massa de Abs595 nm
0,2 g/l (µl) Bradford (ml) proteína (mg) (15 min)
0 100 1 0,010
10 90 1 0,080
20 80 1 0,160
30 70 1 0,240
40 60 1 0,320
50 50 1 0,400
60 40 1 0,480
70 30 1 0,560
80 20 1 0,640
90 10 1 0,720
100 0 1 0,800

a) Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das

linhagens de levedura.
b) Calcule a atividade obtida por grama de células.
c) Calcule a concentração de proteína em cada um dos lisados e a atividade
específica de cada um dos materiais.
d) Se o próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima, qual das
linhagens é melhor para produzir essa enzima em larga escala? Justifique a
resposta.
e) Se for necessário purificar a enzima, qual das linhagens é a melhor fonte?
Justifique a resposta.

4. Um bioquímico iniciou a purificação de uma enzima de um lisado de células

utilizando precipitação com sulfato de amônio, e obteve os resultados esquematizados
abaixo.

a) Definir o que se entende por recuperação e enriquecimento da atividade de

uma enzima durante um procedimento de purificação.
b) Calcular a recuperação e o enriquecimento de cada fração obtida em todas
as etapas realizadas usando os valores do lisado como referência.

4
 c) Qual fração o bioquímico deverá utilizar para continuar com o processo de
purificação da enzima desejada? Justifique.

5. Um homogenato do epitélio do tubo digestivo de rato apresenta atividade da enzima

-glicosidase. Para as condições de preparação deste homogeneizado obteve-se uma
atividade enzimática de 80 mU/ml e uma atividade específica de 80 mU/mg. A fim de
purificar esta -glicosidase, 1,5 ml deste homogenato foram submetidos a uma
cromatografia de troca iônica em uma coluna DEAE-celulose e obteve-se o seguinte
perfil de atividade de alfa-glicosidase nos tubos coletados durante a cromatografia:

0,3 1
(linha contínua)
abs 420nm

0,2
0,5 [NaCl]
(M)
0,1 (linha
tracejada)

0 0
0 5 10 15 20
tubos

Os tubos com maior atividade de alfa-glicosidase foram reunidos. Este material com
volume de 1,0 ml foi denominado “material DEAE”. Em seguida, o material DEAE foi
utilizado para determinação de atividade enzimática e concentração de proteína total.
As condições do ensaio de atividade enzimática e os resultados obtidos estão
descritos na tabela abaixo:
Substrato Tempo de
(p-nitrofenil - Material DEAE incubação a Abs 420nm
glucosídeo 4 mM) 30°C
(min)
50 microlitros 50 microlitros 5 0,10
50 microlitros 50 microlitros 10 0,19
50 microlitros 50 microlitros 15 0,32
50 microlitros 50 microlitros 20 0,40

Nas condições de ensaio de atividade de alfa-glicosidase descritas acima, a curva

padrão utilizada para cálculo da atividade enzimática tem a equação y = 0.0056x
(y=Abs; x=nmols). As condições utilizadas para determinação da concentração de
proteína total estão descritas na tabela abaixo:

5
 Reagente de
Material DEAE Água Bradford Abs 595 nm
(ml) (ml) (comassie blue G)
0,01 ml 0,99 ml 1 ml 0,052
0,04 ml 0,96 ml 1 ml 0,13
0,05 ml 0,95 ml 1 ml 0,15
0,1 ml 0,90 ml 1 ml 0,35

A curva padrão do reagente de Bradford preparada nas mesmas condições de volume

que a tabela acima está apresentada a seguir.

0,2 y = 0,01x + 0,05

R² = 1
abs 595nm

0,1

0
0 2 4 6 8 10 12
microgramas de proteína

Utilizando essas informações e resultados, determine:

a) A atividade enzimática (mU/ml) do “material DEAE”
b) A concentração de proteína total (mg/ml) do “material DEAE”
c) A atividade específica do “material DEAE”
d) A recuperação de atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica
e) O enriquecimento da atividade enzimática após a cromatografia de troca
iônica

Dado: 1 mU (miliunidade) de atividade enzimática corresponde a quantidade de

enzima que catalisa uma reação química com a velocidade de formação de 1 nmol de
produto/minuto.

6. As figuras a seguir apresentam o perfil de eluição da atividade de uma -glicosidase

em uma cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-celulose. Cada uma das
cromatografias foi realizada utilizando um tampão com pH diferente (9,0 – 8,0 – 6,0).
Com base nos resultados responda qual a provável faixa de valores do pI (ponto
isoelétrico) dessa -glicosidase.

6
 0,3 1

(linha contínua)
0,8

abs 420nm
0,2 [NaCl]
0,6
(M)
0,4 (linha
0,1
0,2 tracejada)

0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos tampão pH 9

0,3 1
(linha contínua)

0,8
abs 420nm

0,2 [NaCl]
0,6
(M)
0,4 (linha
0,1
tracejada)
0,2
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
tampão pH 8

0,3 1

0,8
(linha contínua)
abs 420nm

0,2 [NaCl]
0,6
(M)
0,4 (linha
0,1 tracejada)
0,2

0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
tampão pH 6

7. Para obter um emprego de bioquímico, solicita-se que você assista a um vídeo que
mostra um colega purificando a citrato sintase a partir de coração de boi. Em
determinados passos do protocolo (descrito abaixo) o entrevistador para o vídeo e lhe
coloca questões. Responda as questões formuladas em “itálico”.

a) Vinte quilos de coração bovino são retirados de um matadouro e transportados ao

laboratório em gelo. O bioquímico começa a processar os corações e realiza todas as
etapas numa câmara fria (~5 oC) ou sob gelo. O tecido cardíaco é picado, suspenso
em uma solução de sacarose 0,2 M tamponada a pH 7,2 e homogeneizado com um
homogeneizador de alta velocidade. Porque foi utilizado tecido cardíaco e em grande
quantidade para purificar a citrato sintase? Qual o propósito de manter o tecido frio e

7
suspendê-lo em sacarose 0,2 M a pH 7,2? O que ocorre com o tecido quando é
homogenizado?

b) O homogenato do tecido, que é denso e opaco, é submetido a uma série de etapas

de centrifugação diferencial. O que se consegue com esse procedimento?

c) A purificação continua com a fração que contém principalmente mitocôndrias

intactas. Por que?

d) Essas são então lisadas osmóticamente. O lisado que é menos denso que o
homogenado, mais ainda opaco, consiste principalmente de membranas mitocôndriais
e conteúdo mitocôndrial interno. Qual a finalidde da lise?

e) Ao lisado, adiciona-se sulfato de amônio até uma concentração específica. A

solução é centrifugada, o precipitado descartado e o sobrenadante recolhido. A este,
que é mais claro que o lisado, adiciona-se mais sulfato de amônio. Nova centrifugação
é realizada, mas desta vez, o precipitado é recolhido porque contém a proteína de
interesse. Qual o objetivo de se adicionar sulfato de amônio? Por que a proteína
precipita? Qual a razão para se adicionar o sal em duas etapas?

f) O precipitado de sulfato de amônio é solubilizado e dialisado contra grandes

volumes de uma solução tamponada a pH 7,2. Qual é a finalidade da diálise? Por que
o sulfato de amônio não é incluído no tampão de diálise? Por que se utiliza uma
solução tamponada em vez de água?

g) A solução dialisada é aplicada em uma coluna de cromatografia por exclusão. A

eluição das proteínas da coluna é acompanhada por medidas de absorção de luz das
frações a 280 nm. A primeira fração protêica que sai da coluna é recolhida e todas as
outras frações são descartadas. Como as proteínas são separadas na cromatografia
de exclusão?Por que a absorção de luz a 280 nm é uma boa maneira de se monitorar
a presença de proteínas nas frações eluídas?

h) Para identificar as frações contendo citrato sintase foram realizadas medidas de

atividade da enzima. As frações contendo atividade citrato sintase foram reunidas e
aplicadas numa coluna cromatográfica de troca catiônica. Após desprezar a solução
inicial que deixa a coluna, o bioquímico adiciona uma solução de pH mais alto à coluna
e colhe a fração protéica que é imediatamente eluída. Qual a razão para o bioquímico
fazer isso? Qual é a carga de uma coluna de troca catiônica? Qual é a carga da
proteína nas condições da cromatografia?

8. Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir.

1º passo: cromatografia de troca aniônica em pH 10.
2º passo: cromatografia de filtração em gel em pH 6,0.

Após cada passo os tubos que continham a atividade de celulase foram reunidos. Para
esse material foi calculada a atividade enzimática total de celulase e também a
quantidade de proteína. A tabela abaixo resume estes resultados.

8
Passo Atividade de Atividade de Proteína total Proteína total
celulase aplicada celulase recuperada aplicada recuperada
(U) (U) (mg) (mg)
Troca iônica 500 100 1.0 0.05
Filtração em gel 100 80 0.05 0.02

Após cada cromatografia os tubos que continham atividade de celulase também foram
reunidos e analisados por SDS-PAGE. Os resultados são mostrados na Figura abaixo.
M T F P kDa
Início

45
31

23
14

Fim
Figura. SDS-PAGE dos materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação. M –
meio de cultura; T – material recuperado após cromatografia de troca aniônica. F –
material recuperado após cromatografia de filtração em gel; P – padrões de peso
molecular.

Para o experimento de filtração em gel usado na marcha de purificação, primeiramente

foi construída uma curva de calibração com proteínas de diferentes pesos
moleculares. Os dados obtidos estão descritos na tabela abaixo juntamente com o
resultado para cromatografia da celulase.

Tabela 2 – Volumes de eluição na cromatografia de filtração em gel em uma coluna

cujo, volume total é 25ml.

Material Volume de eluição (mL)

Proteína padrão de 2.000.000 daltons 7.53
Proteína padrão de 66.000 daltons 9.38
Proteína padrão de 45.000 daltons 10.46
Proteína padrão de 12.400 daltons 13.70
Proteína padrão de 6.500 daltons 16.22
ATIVIDADE CELULÁSICA 9.58

a) Calcule a recuperação da atividade enzimática após cada um dos passos da

purificação da celulase.

b) Calcule a atividade específica da celulase após cada um dos passos da

marcha de purificação.

c) Qual dos passos é melhor na purificação desta enzima? Por quê?

d) Calcule a massa molecular da enzima determinada por SDS-PAGE e por

filtração em gel. Compare os valores e formule hipóteses para explicar os resultados.

9
9. O gráfico abaixo representa a atividade enzimática de alfa-glicosidase eluída em
uma cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-celulose. Sabendo que o ponto
isoelétrico (pI) desta enzima é 7,0 e que esta cromatografia foi feita em tampão pH 8,
construa um esboço do gráfico esperado para cromatografias realizadas em pH 9,0 e
pH 4,0. Estes esboços devem indicar o ponto de eluição da atividade enzimática em
relação ao gradiente de NaCl.

(linha contínua) 0,3 1

0,8
abs 420nm

0,2 [NaCl]
0,6
(M)
0,4 (linha
0,1
tracejada)
0,2
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
tampão pH 8

10. Um dos objetivos do curso é que você seja capaz de planejar, executar e analisar
resultados obtidos durante um processo de purificação de proteínas. Para esta
finalidade existem programas de simulação que ajudam a visualizar as diferentes
etapas envolvidas durante esse processo.
Acesse o programa gratuito: Protein lab by Andrew G Booth is available from:
http://www.agbooth.com/pp_java/.
Siga o tutorial: http://www.agbooth.com/pp_tut_online/Protein1.html
Execute o exercício de 1 até 6.
A familiarização com o software ajudará a compreender os fundamentos envolvidos
nas etapas de purificação de proteínas utilizando diferentes tipos de cromatografias.

11. Um bioquímico recebeu uma amostra para análise. Nela, havia diversas proteínas
que precisavam ser separadas umas das outras. Numa primeira etapa, o bioquímico
utilizou uma coluna de gel filtração recomendada para proteínas de alto peso
molecular (>60 kDa) e obteve o seguinte perfil de eluição:

Figura - Perfil da cromatografia de gel filtração em Superdex-200. As proteínas

separadas foram coletadas nos tubos 1, 2, 3 e 4, conforme indicado na figura. Os
volumes aproximados de eluição para cada tubo foram:
Tubo 1 = 10 ml; Tubo 2 = 11 ml; Tubo 3 = 13 ml; Tubo 4 = entre 14,5 e 15 ml
Volumes aproximados (+/- 0,5 ml)

Usando essa mesma coluna de gel filtração, nas mesmas condições da corrida
anterior, o bioquímico analisou os padrões de peso molecular, obtendo os seguintes
resultados:

10
 Padrão Vol. Eluição (ml)
Proteína padrão de 2.000 kDa 7.53
Proteína padrão de 250 kDa 9.38
Proteína padrão de 170 kDa 10.46
Proteína padrão de 65 kDa 13.70
Proteína padrão de 24 kDa 16.22
Volume total da coluna = 25 ml

Os tubos marcados de 1 a 4 foram então analisados por SDS-PAGE em condições

redutoras e não redutoras, sendo obtido o seguinte perfil:

Figura - Eletroforese de SDS-PAGE em condições redutoras (c/β-mercaptoetanol) e

não redutoras das proteínas contidas nos tubos 1, 2, 3 e 4. No último poço,
encontram-se os padrões de pesos moleculares.

Após analisar os dados, o bioquímico então decidiu submeter a amostra do tubo 4 a

uma cromatografia de troca de ânions (-) em pH 7, seguida de eletroforese SDS-PAGE
das frações obtidas. Os resultados da cromatografia e da eletroforese estão na figura
abaixo:

Figura - Cromatografia de troca de ânions das proteínas no tubo 4 e eletroforese das

proteínas presentes nos tubos 4A e 4B.

11
O bioquímico deu-se então por satisfeito e escreveu o seu relatório final.

a) Quantas proteínas estavam presentes na amostra?

b) Qual o peso molecular de cada uma delas? Quais continham mais de uma sub-
unidade e qual o peso molecular de cada cadeia proteica?

c) Qual o pI aproximado de cada proteína do tubo 4 (maior, menor ou próximo de 7)?

12. Um nonapeptideo foi submetido a uma série de experimentos a fim de determinar

sua estrutura primária. Inicialmente o peptídeo foi incubado com dinitrofluorobenzeno
(DNF) e a seguir submetido a uma hidrólise ácida (HCl 6N – 110ºC – 3h). Os produtos
deste procedimento foram analisados em cromatografia de camada delgada revelando
o resultado abaixo:

Posteriormente o nonapeptídeo foi hidrolisado na presença de quimotripsina. Os

produtos desta reação foram separados e submetidos à degradação de Edman,
obtendo-se o resultado abaixo:

Produto 1: Ala – Arg – Pro – Glu

Produto 2: Ala – Gly – Phe
Produto 3: Ala – Phe

Por fim, o oligopeptideo foi hidrolisado na presença de tripsina, os produtos foram

separados e submetidos à degradação de Edman. O resultado obtido foi:

Produto 1: Ala – Phe – Ala – Gly – Phe – Ala – Arg

Produto 2: Pro – Glu

Qual a estrutura primária deste oligopeptideo?

Dados: Quimotripsina catalisa a hidrólise de ligações peptídicas após Phe. Tripsina

catalisa a hidrólise de ligações peptídicas após Arg.

13. Uma mistura dos seguintes peptídeos: lisil-lisina e leucil-leucil-leucina foi

submetida a uma corrida cromatográfica em papel no sistema de solvente composto
por: butanol: ácido acético; água (4:1:1). Qual o peptídeo que apresenta maior Rf e por
que?

14. Um estudante executou o seguinte protocolo:

12
1. Pesar 10 mg de um dipeptídeo, 1mg de fenilalanina, 1 mg de ácido aspártico e 1 mg
de glicina
2. Colocá-los em tubos separados com tampa de rosca e seguir os passos abaixo para
cada um destes tubos.
3. Adicionar ao tubo 0,75 mL de bicarbonato de sódio.
4. Adicionar ao tubo 0,5 mL de DNF (dinitrofluorobenzeno) preparado em etanol.
5. Fechar o tubo.
6. Transferir o tubo para um banho a 30oC.
7. Incubar o tubo por 3h.
8. Retirar o tubo após esse período.
9. Resfriar o tubo.
10. Acidificar o meio com duas gotas de ácido clorídrico 6M.
11. Transferir o tubo para um concentrador a vácuo
12. Incubar o tubo por 15 min para secar o etanol.
13. Retirar o tubo após esse período.
14. Adicionar ao tubo 1 mL de ácido clorídrico 6M.
15. Transferir o tubo para um bloco térmico (115° C).
16. Incubar o tubo por 3h.
17. Retirar o tubo após esse período.
18. Resfriar o tubo em temperatura ambiente.
19. Retirar 20 μL e transferir para um tubo de ensaio.
20. Transferir o tubo de ensaio para um concentrador a vácuo.
21. Aguardar a amostra secar completamente.
22. Retirar o tubo após esse período.
23. Resfriar o tubo.
24. Adicionar 20 μL de etanol ao tubo.

Em seguida 2 μl do material correspondente ao passo 24 para cada uma das amostras

iniciais (dipeptídeo, fenilalanina, glicina e ácido aspártico) foram submetidos à
separação em cromatografia de camada delgada utilizando a fase móvel Clorofórmio-
Metanol-Ácido acético 95-4-1. Foi obtido o resultado abaixo.

Responda:
a) O protocolo acima foi realizado com o objetivo de obter qual informação a respeito
do dipeptídeo?

Considerando que estudante deixou de anotar a identificação das amostras 2, 3 e 4 e

sabe apenas que a amostra 1 corresponde ao dipeptídeo.

13
b) identifique o material (tipo de aminoácido) presente nas amostras 2, 3 e 4. Justifique
sua resposta.
c) identifique as “manchas” indicadas com as setas no material 1. Justifique sua
resposta.
d) Caso os passos 14 a 22 fossem omitidos do protocolo acima, qual das bandas
(manchas) do material 1 teria uma migração diferente? Justifique a resposta.

e) Caso os aminoácidos fenilanalina, ácido aspártico e glicina fossem dissolvidos em

etanol e diretamente submetidos à separação em cromatografia de camada delgada
em placa de sílica sem passarem pelas etapas do protocolo acima, qual das fases
móveis sugeridas abaixo seria a mais indicada. Justifique sua resposta. Clorofórmio-
Metanol-Ácido acético (95-4-1) Clorofórmio-Metanol-Acido acético (60-30-10)
Clorofórmio-Metanol (97-3)

15. Para uma alfa-glicosidase foram determinadas as velocidades de hidrólise de

diferentes concentrações de substrato (NpaGlc) na presença de diferentes
concentrações de um inibidor. Estes dados estão apresentados na tabela abaixo.
Baseando-se nesta tabela determine o Vmax e o Km para a hidrólise do substrato e o
Ki para este inibidor.

[S] (mM) V (nmol/min)

[I] (mM) 0 2 4 6 8
0.1 0.91 0.48 0.32 0.24 0.20
0.2 1.67 0.91 0.63 0.48 0.38
0.3 2.31 1.30 0.91 0.70 0.57
0.4 2.86 1.67 1.18 0.91 0.74
0.5 3.33 2.00 1.43 1.11 0.91
0.75 4.29 2.73 2.00 1.58 1.30
1 5.00 3.33 2.50 2.00 1.67
1.5 6.00 4.29 3.33 2.73 2.31
2 6.67 5.00 4.00 3.33 2.86
2.5 7.14 5.56 4.55 3.85 3.33
4 8.00 6.67 5.71 5.00 4.44
6 8.57 7.50 6.67 6.00 5.45
8 8.89 8.00 7.27 6.67 6.15
10 9.09 8.33 7.69 7.14 6.67

16. Tecido embrionário de fígado contém uma enzima que catalisa a reação
S P. Tecido de fígado adulto também apresenta a atividade S P. Alguns
dados cinéticos obtidos com extratos dos dois tecidos são apresentados abaixo. Que
conclusões você pode tirar com relação à identidade das duas enzimas?

Velocidade Inicial Observada

[S] (-moles x mg de proteína-1 x min-1)
Extrato de Fígado Extrato de Fígado
(M) Adulto (E1) Embrionário (E2)
1,67 x 10-5 1,05 5,00
2,5 x 10-5 1,54 6,66
3,33 x 10-5 1,98 8,00
5,0 x 10-5 2,86 10,00
7,0 x 10-5 3,78 11,67
1,0 x 10-4 5,00 13,33
1,5 x 10-4 6,67 15,0

14
 1,67 x 10-4 7,15 15,4
2,0 x 10-4 8,00 16,0
3,0 x 10-4 10,00 17,1

17. Durante danos consideráveis do fígado, uma enzima (E1 do Problema 18) é
liberada na corrente sanguínea. Após exercícios intensos, uma enzima de músculo,
E3, que catalisa a mesma reação, é liberada na corrente sanguínea. E1 e E3 podem
ser diferenciadas facilmente porque apresentam diferentes valores de Km (A Km da
enzima de músculo é 2 x 10-5 M) Uma determinação com uma amostra de sangue de
um paciente apresentou os resultados dados na tabela abaixo. O paciente sofre de
uma doença do fígado, ou simplesmente tem se exercitado violentamente? (O
paciente chegou inconsciente no hospital, de modo que você não pode fazer a ele
nenhuma pergunta).

[S] (M) v (moles x ml de soro-1 x min-1)

5 x 10-5 43
7 x 10-5 57
1 x 10-4 75
1,5 x 10-4 100
2 x 10-4 120
3 x 10-4 150
6 x 10-4 200

18. Os dados cinéticos abaixo foram obtidos para diferentes inibidores de uma enzima.
Determine a natureza de cada inibidor e calcule o Ki.

Velocidade Inicial (nmoles/min)

[S] (mM) (Controle) +I a 6M +X a 30M +Y a 4mM +Z a 0,2mM
0,200 16,67 6,25 5,56 10,00 8,89
0,250 20,00 7,69 6,67 11,11 10,81
0,333 24,98 10,00 8,33 12,50 13,78
0,500 33,33 14,29 11,11 14,29 19,05
1,00 50,00 25,00 16,67 16,67 30,77
2,00 66,67 40,00 22,22 18,18 44,44
2,50 71,40 45,45 23,81 18,52 48,78
3,33 76,92 52,63 25,64 18,87 54,04
4,00 80,00 57,14 26,67 19,00 57,14
5,00 83,33 62,50 27,77 19,23 60,60

19. Problemas para o laboratório de informática. Espera-se que você já tenha alguma
familiaridade com o programa Protein lab by Andrew G Booth. Se ainda não tiver,
familiarize-se.

a) Purificar as 3 proteínas indicadas para o seu grupo e apresentar os resultados

obtidos.

b) Três proteínas, P1, P2 e P3, foram submetidas independentemente a hidrólise com

tripsina e analisadas por MALDI-TOF. Conhecendo-se o m/z dos peptideos obtidos a
partir de cada proteína (abaixo), identifique cada uma delas usando o programa
Mascot Peptide Mass Fingerprint.

15
P1: P2: P3:
1086.555 979.473 768.398
1271.656 1018.485 948.578
1378.833 1180.651 1140.641
1502.662 1424.768 1253.619
1606.651 1581.810 1381.717
1853.952 1709.902 1762.906
1885.009 2112.902 1940.027
1937.005 2198.207 2038.923
1982.042 2253.143 2068.119
2110.130 2443.250
2191.131 2584.143
2852.445

16