UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

RELATÓRIO PRÁTICA 7. REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DE

CARBOIDRATOS; MÉTODOS DE DOSAGEM DE MONOSSACARÍDEOS.

Alunos: Denise Junqueira Viana 11320172

Luís Henrique Biachi 11848271
Maria Vitória Fonseca 11856277

Ribeirão Preto 2023

1. OBJETIVO
O experimento visa realizar as reações típicas qualitativas de carboidratos utilizando os
reagentes de Benedict e Tollens. Ademais, busca-se determinar a concentração de
glicose em uma amostra desconhecida através de uma curva padrão. Por último,
pretende-se avaliar a presença de lactose nos tipos de leite mantidos dentro e fora da
geladeira, utilizando também uma curva padrão para identificar qual é o leite X e qual é o
leite Y.

2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

2.1. Reações características dos carboidratos

Colocamos em diferentes tubos de ensaio 40 gotas de cada solução de açúcar disponível e

adicionamos uma quantidade equivalente do reagente de Benedict. Fizemos um tubo apenas
com reagente e substituímos o açúcar por água (branco). Homogeneizamos e colocamos os tubos
em banho-maria a aproximadamente 100°C, durante 2 min. Deixar esfriar e anotamos os
resultados. Repetimos o mesmo procedimento, empregando agora o reagente de Tollens.

2.2 Perguntas e discussões: Carboidratos

Na reação utilizando o reagente de Benedict aquecimento do açúcar redutor em presença de

íons Cu(II) e OH-reduz o cobre a Cu(I) e o açúcar é oxidado, havendo a formação de precipitado
de Cu2O que varia de cor de acordo com a concentração do açúcar redutor (OLIVEIRA et al,
2006;FIGUEIRA,ROCHA, 2012). Para os dissacarídeos promoverem a formação do precipitado
precisam da presença de uma extremidade redutora,o que não ocorre com a sacarose.

Em resumo, reação de Benedict baseia-se na redução do íon cobre quando na

presença de carboidrato com potencial redutor, sendo o cobre II reduzido a cobre I
e consequentemente formando óxido cuproso (coloração alaranjada), a reação de
redução foi expressa abaixo:

Na observação deste teste qualitativo, podemos inferir que;

A sacarose por não possuir carbono anomérico livre, não é considerada um açúcar redutor e
portanto, não reage com o reagente de Benedict.
A glicose, galactose, maltose e lactose reagiram e a reação ficou com a coloração laranja.
Utilizamos como controle o reagente e água no lugar do açúcar.
 Figura 1 - Reação de caracterização de carboidratos pelo métodos de Benedict

A reação de Tollens baseia-se na redução da prata quando presente no complexo com

amônia, na presença de carboidrato com potencial redutor, passando a solução de
incolor para prateada, devido à presença de prata no estado fundamental na forma sólida.
A reação está expressa abaixo:

No caso de monossacarídeos houve a formação do

espelho de prata, reação esta que ocorreu nos tubos contendo glicose e galactose.
 Já nos tubos contendo dissacarídeos (maltose e
lactose) houve a coloração acinzentada.

Figuras 2 e 3 - Reação de caracterização de carboidratos pelo métodos de Tollens

Ambos os testes empregados são utilizados para a identificação de açúcares que

apresentam potencial redutor, os açúcares que possuem esta característica (com carbono
anomérico não participando de ligação química (O-glicosídica) ) têm a capacidade
de se interconverter entre a forma linear e a forma cíclica. No caso dos açúcares
caracterizados o único que não apresenta ponta redutora é a sacarose. Concluindo assim
que foi observado que os açúcares do experimento, com exceção da sacarose, são
redutores, pois apresentaram resultado positivo em ambos os testes.

2.3 Determinação quantitativa de glicose

Determinamos a concentração de uma amostra de glicose desconhecida, para

isso produzimos uma curva padrão empregando o método do Ácido 3,5-dinitrosalicílico
(ANS) e partindo de uma solução padrão de glicose de concentração 0,01 M preparamos
as soluções de acordo com a tabela retirada do protocolo experimental, deixando um
volume final de 1,5 mL. Adicionamos a cada tubo 1,0 mL do reagente ANS, incluindo o
tubo da amostra desconhecida, colocamos em banho-maria a 100oC por 5 min, esfriamos
os tubos em água corrente, completamos o volume para 10 mL e lêmos a absorbância em
540 nm.

Figura 3 - Reação com reagente ANS para quantificação da glicose e amostra 11

desconhecida
Partindo da solução padrão (0,01 M), calculamos o volume de glicose que
adicionamos a cada ponto da curva

1mol glicose – 180,16 g

x – 0,00036g
x = 0,0000019982 mol glicose

então,
0,01 mol – 1000mL
1,9e-6mol — x
x = 0,199 mL (200uL) para o primeiro ponto

Repetimos o procedimento para os demais pontos da curva.

Tubo Glicose Água Glicose A540

(ml) (ml) (mg)

0 0 1,5 0 Branco

1 0,2 1,3 0,36 0,214

2 0,4 1,1 0,72 0,485

3 0,6 0,9 1,08 0,855

4 0,8 0,7 1,44 1,018

Amostra 11 A X1 0,760

Amostra 11 B X2 0,745

Tabela 1- Quantificação de Amostra desconhecida usando padrão de glicose

Gráfico 1: Curva padrão da glicose, Abs 540 nm.

 Recebemos a amostra de número 11 em duplicata e com isso identificamos
como A e B, para diferenciá-las.
A partir da curva padrão encontramos a massa de glicose das amostras
desconhecidas

0,760 = 0,7728x - 0,0525

x = 1,05 mg
então dividindo pelo volume final 1,5mL , temos
1,05/1,5 = 0,7 mg/mL na amostra 11A

0,745 = 0,7728x - 0,0525

x = 1,03 mg
1,03/1,5 = 0,69 mg/mL na amostra 11B

2.4.1 Determinação de lactose e preparo das amostras de leite (método de Somogy

e Nelson)

Determinamos a concentração de lactose em 2 amostras de leite: uma armazenada em

geladeira e outra previamente mantida à temperatura ambiente por 48 horas. Será
empregado o método de Somogy e Nelson (Journal of Biological Chemistry, 195:19-23).

Transferimos 2 ml de uma das amostras de leite para um balão volumétrico de 100 ml e

completamos com água, depois, transferimos 1mL desta solução diluída para tubos
cônicos de 15 ml. Adicionamos 1,0 ml de ZnSO4 a 5% e agitamos, acrescentamos 1,0 ml
de hidróxido de bário 0,3M (agitamos a solução antes de usar) e agitamos novamente.
Acrescentamos 7 ml de água e homogeneizamos.

Repetimos o procedimento com a outra amostra de leite e centrifugamos os 2 tubos por 5

minutos a 3.000 rpm.

2.4.2 Determinação da curva padrão de lactose e do teor de lactose no leite

Construímos a curva padrão de lactose, a partir de uma solução padrão (360,30 g/mol)
de concentração 100 µg/ml, preparamos 5 soluções entre 20 e 100 µg de lactose, com
volume final de 1,0 ml, fazendo também um tubo branco, no qual colocamos 1mL de
água no lugar da lactose padrão.

Para a dosagem de lactose no leite, preparamos dois tubos com 1 ml do sobrenadante

obtido na centrifugação anterior. Adicionamos a todos os tubos (branco, soluções da
curva padrão e amostras de leite) 1,0 ml do reagente de Somogy e agitamos, levamos
para o banho-maria a temperatura de ebulição por 10 min. Esfriamos em água corrente,
adicionamos 1,0 ml do reagente de Nelson a cada tubo e agitamos. Completamos o
volume para 10 ml com água. Determinamos a absorbância em 540 nm.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1 Determinação de lactose no leite (método de Somogy e Nelson)

Tubo Água (mL) Lactose [Lactose] A540nm

(mL) (µg/mL)

BRANCO 1 - 0 --

1 0,8 0,2 20 0,039

2 0,6 0,4 40 0,080

3 0,4 0,6 60 0,085

4 0,2 0,8 80 0,107

5 - 1,0 100 0,138

Leite X - - - 0,152

Leite Y - - - 0,222

Cálculo a partir da solução estoque de lactose

Solução padrão-> concentração 100 µg/mL

Então;
100 µg —1mL
20 µg — XmL
X= 0,2 mL

Fizemos este cálculo para os demais pontos da curva, pré definidos.

Como podemos observar nos valores de absorbância encontrados para as

amostras de leite (X e Y) estão fora da curva, para tanto, o ideal seria diluir para
que os pontos destas amostras encaixassem na curva (poderíamos acrescentar
mais 7 mL de água, por exemplo). No entanto, no dia da experimentação ficamos
sem tempo hábil para realizar esta ação.
Neste caso, apenas para demonstrar como seriam os cálculos para
encontrar a concentração de lactose no leite armazenado na geladeira e aquele
mantido a temperatura ambiente por 48h, temos:
Gráfico 2: Curva padrão da lactose, Abs 540 nm.

Leite X

0,152 = 0,0011x + 0,0223

x = 117,9 ug/mL (0,0001179 g/mL)

Considerando a diluição 57x temos, 2e-6 g/mL

Assim, em 100 mL de leite temos 0,0002068 g de lactose.

Leite Y

0,222 = 0,0011x + 0,0223

x = 181,5 ug/mL (0,0001815 g/mL)

Da mesma forma, com a diluição de 57x temos, 3e-6 g/mL

Assim, em 100 mL de leite temos 0,0003184 g de lactose.

4. Perguntas e Discussão: Lactose

1. Quais os princípios do método de dosagem de lactose desenvolvido por

Somogyi e Nelson? Apresente as reações químicas pertinentes.

Carboidratos que apresentam em sua estrutura molecular os grupos aldeído ou cetona

livres (no carbono 1), possuem poder redutor e são por isso denominados açúcares
redutores. Geralmente, estes açúcares são monossacarídeos ou dissacarídeos que
podem ser oxidados por agentes oxidantes, tais como os íons férricos (Fe3+) e cúprico
(Cu2+). Estes íons, por sua vez, são reduzidos pela ação dos açúcares redutores
(agentes redutores).
No açúcar, o carbono do grupo carbonila é oxidado a carboxila. A lactose é um
dissacarídeo redutor, que reduz o íon cúprico do Reativo de Somogyi a óxido
cuproso, em meio alcalino e quente. Em seguida, o óxido cuproso reage com o
ânion arseno-molibdato do Reativo de Nelson produzindo um composto de
coloração azul - óxido de molibdênio, Mo2O3, com λ máx.= 540 nm.
Dentro de certos limites, a intensidade da coloração azul é diretamente proporcional à
quantidade de lactose no leite. Essa intensidade de coloração pode ser medida
utilizando-se um espectrofotômetro, que detecta a absorção de luz pelo óxido de
molibdênio

Obs: Antes da reação quantitativa, a amostra de leite deve ser desproteinizada e

clarificada, mediante precipitação de interferentes com Ba(OH)2 e ZnSO4.

2. Discuta os resultados obtidos em função da diferença de temperatura de

armazenagem do leite. Os resultados obtidos foram os esperados? Por
quê?

Apesar de não conseguirmos finalizar o experimento da dosagem de

lactose, concluiremos com esses dados que há maior teor de lactose em Y,
portanto é a amostra que ficou armazenada em geladeira e X armazenada a
temperatura ambiente. Quando o leite fica exposto à temperatura ambiente há
uma grande atividade microbiológica das bactérias presentes no ambiente ou
naturalmente presentes no leite podem começar a fermentar a lactose,
convertendo-a em ácido lático e outros subprodutos. Por outro lado, o
armazenamento na geladeira retarda a atividade das bactérias e reduz a taxa de
fermentação.

5. Conclusão

A análise qualitativa revelou que dissacarídeos como lactose, maltose e outros

apresentam extremidades redutoras, reagindo nos testes de Benedict e Tollens. A
sacarose, por não possuir extremidade redutora, não reagiu nos testes.

O método de dosagem de lactose de Somogyi e Nelson se baseia na capacidade

de açúcares redutores, como lactose, de reduzir o íon cúprico e formar um
composto azul detectável em espectrofotometria.

A temperatura de armazenamento do leite influencia o teor de lactose. O

armazenamento em geladeira preserva mais lactose, enquanto o armazenamento
à temperatura ambiente favorece a fermentação bacteriana, diminuindo o teor de
lactose.

Apesar da incompletude do experimento de dosagem de lactose, os resultados

indicam que a temperatura de armazenamento afeta a quantidade de lactose por
sofrer degradação mais rápida quando fora da geladeira, destacando a
importância do controle de temperatura na preservação do leite.
 Referências:

● LEHNINGER, T. M., NELSON, D. L. & COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 6ª

Edição, 2014. Ed. Artmed.
● SKOOG; WEST; HOLLER; CROUCH. Fundamentos de Química Analítica. Trad.
8ª Edição Norte-Americana. Editora Thomson.
● VOET, D. Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 2013. 4a ed
● OLIVEIRA et al, 2006;FIGUEIRA,ROCHA, 2012
● Journal of Biological Chemistry, 195:19-23
● Apostila%20Bioquimica%202014_LCB%20208.pdf