UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

LABORATÓRIO DE ENGENHARIA QUÍMICA 3

MÓDULO 1 – BIOQUÍMICA

Prática I: Determinação de Parâmetros Cinéticos de Reação Enzimática

Prática II: Influência do pH na Atividade Enzimática

Prática III: Influência da Temperatura na Atividade Enzimática

TURMA C - GRUPO 1

Autores: Jayc Castro Leal 11721EQU027

Marcos Vinícios Silvestre, 11721EQU019
Natália dos Reis Filipin 11621EQU040
Vinícius Francisco da Silva, 11721EQU036

UBERLÂNDIA
2022
 2

SUMÁRIO
1 Prática I: Determinação de Parâmetros Cinéticos de Reação Enzimática............. 3

1.1 Objetivos ....................................................................................................................... 3

1.2 Procedimento Experimental ....................................................................................... 3

1.3 Tratamento dos dados e discussão dos resultados .................................................... 4

1.4 Conclusão.................................................................................................................... 13

2 Prática II: Influência do pH na Atividade Enzimática .......................................... 14

2.1 Objetivos ..................................................................................................................... 14

2.2 Procedimento Experimental ..................................................................................... 14

2.3 Tratamento dos dados e discussão dos resultados .................................................. 14

2.4 Conclusão.................................................................................................................... 21

3 Prática III: Influência da Temperatura na Atividade Enzimática ....................... 22

3.1 Objetivos ..................................................................................................................... 22

3.2 Procedimento Experimental ..................................................................................... 22

3.3 Tratamento dos dados e discussão dos resultados .................................................. 22

3.4 Conclusão.................................................................................................................... 30

Simbologia ......................................................................................................................... 30

Referências Bibliográficas ................................................................................................ 32

 3

1 Prática I: Determinação de Parâmetros Cinéticos de Reação Enzimática

1.1 Objetivos

Determinar os parâmetros cinéticos da hidrólise da sacarose pela enzima invertase,

utilizando o método de linearização de Lineweaver-Burk e pela regressão não-linear (software
Statistica), à temperatura e pH constantes.

1.2 Procedimento Experimental

Construção da curva de calibração:

Foram preparadas a partir de uma solução mãe de 20 g/L em soluções de concentrações

conhecidas. Foram selecionadas seis concentrações do açúcar redutor, ou seja, a açúcar redutor,
dentro da faixa de concentração de 0mL a 3,6mL em balões volumétricos. Após, foi retirado
0,5 ml de cada um dos balões anteriores e adicionado em tubo de Follin-Wu juntamente com 1
ml de DNS (inativador de enzima).
Em um dos tubos foi utilizado água destilada como amostra (branco); 0,1g/L de açúcar
redutor no segundo tubo; 0,8g/L; 1,5g/L; 2,2g/L; 2,9g/L e 3,5 g/L; respectivamente. Todos
foram levados a um banho em ebulição por cinco minutos, resfriados, foram completados os
volumes com água destilada até 12,5mL, logo após foi lida a absorbância em um
espectrofotômetro de 540nm, obtendo assim os dados necessários para definir a curva de
calibração.

Determinação de parâmetros cinéticos:

Foram preparadas diferentes soluções de sacarose (10, 20, 30, 50, 70 e 90 g/L) com
solução tampão de ácido acético de pH igual a 4,5.
Foram colocados 40 ml de amostra (solução de sacarose) e 1 ml de água destilada ao reator
quando a temperatura atingiu 30 °C. Após, foi retirado 0,5 ml de amostra do reator e colocado
em um tubo de Follin-Wu, no qual já havia 1 ml de DNS (BRANCO). Foi realizado o descarte
da solução e limpeza do reator.
Foram adicionados 40 ml de amostra (solução de sacarose) e 1 ml da solução de enzima
INVERTASE ao reator quando a temperatura atingiu 30 °C. Após, foi retirado 0,5 ml de solução
do reator e transferido ao tubo de Follin-Wu, no qual já existiam 1 ml de DNS, o mesmo
 4

procedimento foi realizado nos intervalos de tempos de 3,6,9 e 12 minutos, de forma contínua.
Todas as amostras foram colocadas para ebulição por 5 min e depois resfriadas em água fria.
Os tubos foram completados em até 12,5 ml e homogeneizados. Em seguida, fez-se a leitura de
cada amostra no espectrofotômetro, obtendo assim os valores de absorbância para as amostras
de cinética de reação enzimática para a concentração de 10 g/L de sacarose. Esse mesmo
procedimento foi realizado para diferentes concentrações de solução de sacarose: 10, 20, 30,
50, 70 e 90 g/L.

1.3 Tratamento dos dados e discussão dos resultados

São apresentados na Tabela 1 os dados experimentais referente à calibração.

Tabela 1- Curva de calibração

Concentração (g/L) Absorbância
0 0
0,1 0,017
0,8 0,248
1,5 0,427
2,2 0,687
2,9 0,846
3,5 1,068

A partir dos resultados da Tabela 1 foi obtida a Equação 1, através da regressão linear,
que representa a variação da concentração de açúcar redutor em função da absorbância:

Equação 1
y = 3,292x + 0,0228 (1)

I – Determinação dos Parâmetros Cinéticos da Reação Enzimática

Os parâmetros cinéticos (Vmax e Km) foram obtidos através da leitura da absorbância

para variadas concentrações de sacarose em função do tempo, mantendo-se o pH da solução
igual a 4,5 e temperatura de 30 °C. Por meio da Equação 1 foi possível determinar a
concentração de açúcar redutor para cada concentração de substrato.
 5

As figuras e tabelas abaixo representam a variação da concentração de açúcar redutor

com o tempo.

Tabela 2 - Dados experimentais referente à concentração de 10g/L de sacarose.

Tempo (min) Absorbância Concentração de
açúcar redutor (g/L)
0 0 0,000
3 0,097 0,301
6 0,179 0,556
9 0,275 0,854
12 0,355 1,102

Figura 1 - Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para concentração

de 10g/L de sacarose.

Concentração de 10 g/L sacarose y = 0,0924x + 0,007

R² = 0,9992
1,2
Concentração de AR (g/L)

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min)

Tabela 3 - Dados experimentais referente à concentração de 20g/L de sacarose.

Tempo (min) Absorbância Concentração de açúcar
redutor (g/L)
0 0 0,023
3 0,2 0,681
6 0,398 1,333
9 0,584 1,945
12 0,669 2,225
 6

Figura 2 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para concentração de

20g/L de sacarose.

Concentração de 20 g/L sacarose y = 0,1934x + 0,0673

R² = 0,9859
3

2,5
Concentração de AR (g/L)

1,5

0,5

0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min)

Tabela 4 – Dados experimentais referente à concentração de 30g/L de sacarose.

Tempo (min) Absorbância Concentração de açúcar
redutor (g/L)
0 0 0,023
3 0,147 0,507
6 0,199 0,678
9 0,343 1,152
12 0,377 1,264

Figura 3 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para concentração de

30g/L de sacarose.

Concentração de 30 g/L sacarose

y = 0,1042x + 0,0992
R² = 0,963
1,6
Concentração de AR (g/L)

1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min)
 7

Tabela 5 – Dados experimentais referente à concentração de 50g/L de sacarose.

Tempo (min) Absorbância Concentração de açúcar
redutor (g/L)
0 0 0,023
3 0,146 0,503
6 0,297 1,001
9 0,447 1,494
12 0,546 1,820

Figura 4 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para concentração de

50g/L de sacarose.

y = 0,1529x + 0,0511
Concentração de 50 g/L sacarose R² = 0,9949
2
1,8
Concentração de AR (g/L)

1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min)

Tabela 6 – Dados experimentais referente à concentração de 70g/L de sacarose.

Tempo (min) Absorbância Concentração de açúcar

redutor (g/L)
0 0 0,023
3 0,161 0,553
6 0,248 0,839
9 0,405 1,356
12 0,519 1,731
 8

Figura 5 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para concentração de

70g/L de sacarose.

Concentração de 70 g/L sacarose y = 0,1407x + 0,0564

R² = 0,9935
2
1,8
Concentração de AR (g/L)

1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min)

Tabela 7 – Dados experimentais referente à concentração de 90g/l de sacarose.

Tempo (min) Absorbância Concentração de açúcar
redutor (g/L)
0 0 0,023
3 0,113 0,395
6 0,257 0,869
9 0,401 1,343
12 0,469 1,567

Figura 6 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para concentração de

90g/L de sacarose.

Concentração de 90 g/L sacarose y = 0,1345x + 0,032

R² = 0,9885
2
Concentração de AR (g/L)

1,5

0,5

0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min)
 9

A partir dos gráficos obtidos para as diferentes concentrações analisadas, foi possível
seguir a análise para determinação da influência da concentração em relação ao tempo.
Primeiramente, obteve-se a derivada de cada curva no tempo inicial, que corresponde à
velocidade e foi construído o gráfico de velocidade da reação que foram transformados de g/L
para g/mol (derivadas iniciais pela concentração inicial de sacarose), estes dados estão
representados abaixo na Tabela 8.

Tabela 8 - Dados de velocidade para cada concentração de Sacarose nos tempos iniciais.
S (g/L) v (g/L.min)
0,00000 0
10,00000 0,0933
30,00000 0,1042
50,00000 0,1529
70,00000 0,1407
90,00000 0,1345

Figura 7 – Representação gráfica da velocidade de reação em função da concentração de substrato.

0,18
Velocidade da reação (g/L.min)

0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0,00000 20,00000 40,00000 60,00000 80,00000 100,00000
Concentração de substrato (g/L)

A figura 8 representa o comportamento ao longo do tempo da concentração de açúcar redutor

para diferentes concentrações de sacarose.
 10

Figura 8 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para diferentes

concentrações de sacarose.

Os parâmetros da Equação de Michaelis-Menten, foram obtidos utilizando a Equação

2, para isso foi realizado o ajuste variando-se a velocidade da reação em função da concentração
de substrato, sendo que a velocidade da reação corresponde ao coeficiente angular das retas da
figura acima.
𝑉𝑚á𝑥 .𝑆
𝑣 = (2)
𝐾𝑚 + 𝑆

Os termos da equação representam informações importantes a respeito do sistema

reacional. O Km representa a concentração de substrato na qual metade dos sítios ativos da
enzima encontra-se saturado por moléculas de substrato no estado estacionário. Dessa forma,
ele está diretamente relacionado com a afinidade da enzima pelo substrato. Quanto menor o
valor de Km, maior será a afinidade da enzima pelo substrato. A partir desse entendimento, é
possível verificar nas condições experimentais qual é o comportamento da reação ao longo da
atividade enzimática.
Foi possível traçar uma linha de tendência que evidencia o comportamento da reação,
possibilitando sua classificação em 2 ordens.
Para concentrações baixas de substrato: [𝑺] < 0.01km, verificamos que a curva foi
 11

praticamente linear, como esperado. Dessa forma, nomeamos a primeira região de cinética de
primeira ordem.
Com o aumento da concentração do substrato, [𝑺] > 100 km, a velocidade é praticamente
independente da concentração do substrato, nomeando a região de cinética de Ordem Zero.
Dessa forma, foi possível realizar o ajuste no software Statistica onde foram
determinados os parâmetros cinéticos (Vmax e Km) de acordo com o modelo de Michaelis &
Menten:
Tabela 9 - Resultados obtidos por modelo não-linear utilizando o Statistica.
Vmáx(g/min) Km (g) R²
0,1527 7,2 0,9481

Figura 9- Gráfico obtido pelo Software Statistica utilizando modelo não-linear.

A Equação 3 abaixo de Lineweaver-Burk possibilitou a linearização desses dados e

posteriormente a obtenção dos parâmetros Km e Vmáx:

1 𝐾𝑚 1 1
= . + (3)
𝑣 𝑉𝑚á𝑥 𝑆 𝑉𝑚á𝑥

Utilizando o modelo linear apresentado acima foi necessário calcular os seguintes

parâmetros, com dados já obtidos como a velocidade e a concentração em base molar, e os
seguintes resultados foram encontrados, representados pela Tabela 10.
 12

Tabela 10 - Parâmetros do modelo de Lineweaver-Burk.

1/v 1/S
10,7181 0,1000
9,5969 0,0333
6,5402 0,0200
7,1073 0,0143
7,4349 0,0111

Plotando os valores encontrados e traçando uma linha de tendência foi possível plotar o
Gráfico 10.

Figura 10 – Velocidade da reação em função da concentração de substrato.

11,0000
10,5000
10,0000
9,5000
1/v (L.min/g)

9,0000
8,5000
8,0000
7,5000
7,0000
y = 41,627x + 6,7915
6,5000
R² = 0,7381
6,0000
0,0100 0,0200 0,0300 0,0400 0,0500 0,0600 0,0700 0,0800 0,0900 0,1000
S (g-1)

Para entendimento completo do sistema reacional, utilizamos o método tradicional

como finalidade comparativa. Ele baseado na linearização da equação de Michaelis Menten,
por meio da obtenção de uma reta do tipo y = ax + b.
A linearização pelo método classifica o coeficiente angular da reta (a) como Km/Vm,
enquanto o coeficiente linear pode ser entendido como 1/Vm.

Tabela 11 - Resultados obtidos por modelo linear utilizando o Statistica.

Vmáx(mol/min) Km (mol) R²
0,1473 6,1317 0,7381

Com isso, podemos comparar os dados de Km e Vmáx encontrados pelos métodos linear
 13

e não linear. Percebe-se que ambos tiveram resultados bem próximos, embora o método não
linear tenha um R² melhor, indicando maior confiabilidade, ambos os resultados foram
satisfatórios.
A relação entre os métodos linear e não linear apresentaram resultados com divergências
mínimas, sendo a diferença entre as constantes de afinidade de 14,8% . A velocidade máxima
apresentou resultados ainda mais satisfatórias para análise comparativa, tendo um
distanciamento de resultados de 3,5%.

1.4 Conclusão

Com este experimento, verificou-se a dinâmica de reação da enzima invertase na

hidrólise da sacarose, sem que houvesse a interferência de temperatura e pH no sistema. Conclui-
se que o baixo valor de Km indica boa afinidade da enzima invertase com o substrato.
Pode-se perceber que os resultados representam sentido físico, afinal, Vmax assume valor
próximo ao maior valor de velocidade pelos dados experimentais, e pelo gráfico, Km
corresponde à abscissa referente à metade do valor representado por Vmáx.
 14

2 Prática II: Influência do pH na Atividade Enzimática

2.1 Objetivos

Verificar a influência do pH sobre o desempenho da enzima invertase na catálise da

reação de hidrólise da sacarose, assim como estimar o melhor pH para que a reação
enzimática seja favorecida à temperatura e concentração constante.
2.2 Procedimento Experimental

Preparou-se uma solução de sacarose com uma concentração de 50 g/L, com solução
tampão de citrato-fostato de pH igual a 3. Foram colocados 40 ml de amostra (solução de
sacarose) e 1 ml de água destilada ao reator quando a temperatura atingiu 30 °C. Após, foi
retirado 0,5 ml de amostra do reator e colocado em um tubo de Follin-Wu, no qual já havia 1
ml de DNS (BRANCO). Foi realizado o devido descarte da solução e limpeza do reator.

Após a limpeza, foram adicionados 40 ml de amostra (solução de sacarose) e 1 ml da

solução de enzima INVERTASE ao reator quando a temperatura atingiu 30 °C. Após, foi
retirado 0,5 ml de solução do reator e transferido ao tubo de Follin-Wu, no qual já existiam 1
ml de DNS, o mesmo procedimento foi realizado nos intervalos de tempos de 3, 6, 9, 12 e 15
minutos, de forma contínua. Todas as amostras foram colocadas para ebulição por 5 min e
depois resfriadas em água fria. Os tubos foram completados em até 12,5 ml e homogeneizados.
Em seguida, fez-se a leitura de cada amostra no espectrofotômetro, obtendo assim os valores
de absorbância para as amostras de cinética de reação enzimática para o pH igual a 3. Esse
mesmo procedimento foi realizado para diferentes valores de pH: 3, 4, 4,5, 5, 6 e 7.

2.3 Tratamento dos dados e discussão dos resultados

Com a finalização do procedimento experimental, deu-se início à análise e tratamento

dos dados obtidos em laboratório. Seguindo a teoria bioquímica, tem-se que: a derivada de P
com relação a t fornece a velocidade da reação. Sendo P a concentração de açúcar redutor e t o
tempo de reação. Por meio dessa relação, e usando a equação de tendência obtida em cada uma
das 6 curvas traçadas nos gráficos, foi possível estipular o valor de velocidade de reação em
cada um dos 6 casos (3; 4; 4,5; 5;6 e 7) para cada pH analisado.
 15

Tabela 12 – Dados para pH 3.

Concentração de açúcar
Tempo (min) Absorbância
redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,126 0,4376
6 0,278 0,9380
9 0,392 1,3133
12 0,524 1,7478
15 0,646 2,1494

Figura 11 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para pH de 3.

ph 3
2,5
Concentração de AR (g/L)

1,5

0,5

0
0 5 10 15 20
tempo(min)

Tabela 13 – Dados para pH 4.

Concentração de
Tempo (min) Absorbância
açúcar redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,13 0,4508
6 0,308 1,0367
9 0,475 1,5865
12 0,636 2,1165
15 0,765 2,5412
 16

Figura 12 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para pH de 4.

ph 4
3

Concentração de AR (g/L)
2,5

1,5

0,5

0
0 2 4 6 8 10 12 14
-0,5
tempo (min)

Tabela 14 – Dados para pH 4,5.

Concentração de açúcar
Tempo (min) Absorbância
redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,155 0,5330
6 0,305 1,0269
9 0,4 1,3396
12 0,619 2,0605
15 0,777 2,5807

Figura 13 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para pH de 4,5.

ph 4,5
3

2,5
Concentração de AR (g/L)

1,5

0,5

0
0 2 4 6 8 10 12 14
-0,5
tempo(min)
 17

Tabela 15 – Dados para pH 5.

Concentração de açúcar
Tempo (min) Absorbância
redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,134 0,4639
6 0,26 0,8787
9 0,375 1,2573
12 0,544 1,8136
15 0,653 2,1725

Figura 14 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para pH de 5.

ph 5
2,5
Concentração de AR (g/L)

1,5

0,5

0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo(min)

Tabela 16 – Dados para pH 6.

Concentração de
Tempo (min) Absorbância
açúcar redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,086 0,3059
6 0,187 0,6384
9 0,286 0,9643
12 0,388 1,3001
15 0,479 1,5997
 18

Figura 15 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para pH de 6.

ph 6
1,8

Concentração de AR (g/L)
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo(min)

Tabela 17 – Dados para pH 7.

Concentração de
Tempo (min) Absorbância
açúcar redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,025 0,1051
6 0,057 0,2104
9 0,09 0,3191
12 0,128 0,4442
15 0,15 0,5166

Figura 16 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para pH de 7.

ph 7
0,6
Concentração de AR (g/L)

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo(min)
 19

Com isso, construiu-se uma nova tabela, relacionando os pH’s com as respectivas
velocidades de reação. Porém, os valores de velocidade foram convertidos para a base molar,
utilizando-se da massa molar da açúcar redutor, igual a 180,156 g/mol. O que permitiu traçar o
gráfico de velocidade de reação vs pH, como explicitado a seguir.

Tabela 18 – Dados de velocidade para cada pH.

ph v (g/L.min)
3 0,1423

4 0,1728

4,5 0,1684

5 0,1445

6 0,1066

7 0,0342

Figura 17 – Velocidade x pH.

Velocidade x pH
0,2
Velocidade da reação (mol/L.min)

0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
y = -0,016x2 + 0,1317x - 0,1048
0,02
R² = 0,987
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
pH

Assim, observando o gráfico gerado, percebe-se o caráter de curva de segundo grau,

sendo que, pela teoria, o ponto de máximo da curva equivaleria ao pH ótimo de atividade
enzimática, já que a velocidade de reação máxima corresponde à máxima atividade enzimática,
para a equação o valor encontrado foi de 4,1. Baseando-se nisso, e realizando uma análise visual
do gráfico, aponta-se como o pH ótimo experimental: 4. Além desta forma experimental
 20

apresentada de se estimar o pH ótimo, é possível também utilizar um modelo não linear teórico.
Para tal, utiliza-se formulações baseadas em conceitos bioquímicos e o Software Statistica.
Quanto as fórmulas utilizadas, temos:
𝑘[𝐸0 ]
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘[𝐸0 ]𝑦 − =
[𝐻 + ] 𝑘
1+ + 2+ (4)
𝑘1 [𝐻 ]

[𝐻 + ]ó𝑡𝑖𝑚𝑜 = √𝑘1 . 𝑘2 (5)

Assim, para se obter o valor de pH ótimo, foi preciso inserir no Statistica uma coluna
de variável Velocidade e de [H+], esta última obtida por pH=-log[H+], e além disso informar a
equação que os valores informados seguem, no caso, a equação 3. Com isso, o software foi
capaz de fornecer uma estimativa para as constantes K1, K2 e K3, bem como informar o R2 da
operação. Como resultado, foram recebidos os dados da tabela abaixo:Tabela 19 – Resultados
obtidos utilizando o Software Statistica
Parâmetros Calculados

R² K1 K2 K3 [H+] ótimo PH ótimo

0,9563 0,005425 0,687E-6 0,152527 6,1049E-5 4,2143

O que fornece um valor de pH ótimo igual a 4,2143. Com base nos dois valores obtidos
para pH ótimo da enzima invertase utilizada no experimento, primeiramente analisa-se se estão
coerentes entre si, ou se para os dois métodos os valores obtidos foram muito discrepantes,
indicando talvez um possível erro de execução. Nesse caso, os dois valores (4,2143 e 4,1)
pertencem a uma faixa estreita de pH, portanto podendo validar as duas formas de estimativa
de pH ótimo.
 21

Gráfico obtido pelo Software Statistica utilizando modelo não-linear.

2.4 Conclusão

Como conclusão do estudo realizado, percebeu-se que as reações produzidas em

laboratório conseguiram expressar um caráter já esperado, diminuindo suas velocidades à
medida que se distanciava do pH considerado ótimo. Sendo que a máxima atividade enzimática
indicou um pH ótimo de 4 por método experimental e 3,48 pela regressão, valores estes que
não condizem entre si. Apesar disso, conseguimos analisar a metodologia e o embasamento
teórico por trás do experimento.
 22

3 Prática III: Influência da Temperatura na Atividade Enzimática

3.1 Objetivos

Verificar a influência da temperatura sobre o desempenho da enzima invertase na

reação de hidrólise da sacarose, e também estimar a melhor temperatura para que a reação
enzimática seja favorecida, mantendo pH e concentração constante
3.2 Procedimento Experimental

Preparou-se uma solução de sacarose com uma concentração de 50 g/L, com solução
tampão de pH igual a 4,5. Foram colocados 40 ml de amostra (solução de sacarose) e 1 ml de
água destilada ao reator quando a temperatura atingiu 20 °C. Após, foi retirado 0,5 ml de
amostra do reator e colocado em um tubo de Follin-Wu, no qual já havia 1 ml de DNS
(BRANCO). Foi realizado o devido descarte da solução e limpeza do reator.
Após a limpeza, foram adicionados 40 ml de amostra (solução de sacarose) e 1 ml da
solução de enzima INVERTASE ao reator quando a temperatura atingiu 20 °C. Após, foi
retirado 0,5 ml de solução do reator e transferido ao tubo de Follin-Wu, no qual já existiam 1
ml de DNS, o mesmo procedimento foi realizado nos intervalos de tempos de 3, 6, 9 e 12
minutos, de forma contínua. Todas as amostras foram colocadas para ebulição por 5 min e
depois resfriadas em água fria. Os tubos foram completados em até 12,5 ml e homogeneizados.
Em seguida, fez-se a leitura de cada amostra no espectrofotômetro, obtendo assim os valores
de absorbância para as amostras de cinética de reação enzimática para a temperatura de 20 °C.
Esse mesmo procedimento foi realizado para diferentes valores de temperatura: 20, 30, 40, 50,
60, 63, 66 °C.
Para a temperatura de 70 °C o procedimento é similar, exceto que 0,5 ml da amostra foi
retirada do reator nos intervalos de tempos de 1, 2, 3, 4 e 5 minutos, de forma contínua.

3.3 Tratamento dos dados e discussão dos resultados

Mantendo o padrão adotado nas experimentações anteriores, a medida de absorbância

considera os açúcares redutores, frutose e açúcar redutor, então foi necessário dividir os valores
da concentração encontrada por dois, assim obtendo a concentração de açúcar redutor nos
diferentes tempos e temperaturas. Os resultados obtidos em relação à concentração de açúcar
redutor no tempo foram analisados e retirou-se os valores de coeficiente angular para cada uma
 23

e assim obteve-se a curva que representa a velocidade de formação de açúcar redutor para cada
temperatura representadas pelos gráficos abaixo.
Tabela 20 – Dados para Temperatura 20°C.
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
açúcar redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,085 0,3026
6 0,157 0,5396
9 0,309 1,0400
12 0,357 1,1980

Figura 18 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para temperatura de

20°C.

1,4
Concentração de açúcar redutor (g/L)

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min) y = 0,1029x + 0,003
R² = 0,9786

Tabela 21 – Dados para Temperatura 40°C.

Concentração de
Tempo (min) Absorbância
açúcar redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,226 0,7668
6 0,42 1,4054
9 0,627 2,0869
12 0,878 2,9132
 24

Figura 19 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para temperatura de

40°C.

3,5

Concentração de açúcar redutor

3

2,5

2
(g/L)
1,5

0,5

0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min) y = 0,2367x + 0,0188
R² = 0,9981

Tabela 22 – Dados para Temperatura 50°C.

Concentração de açúcar
Tempo (min) Absorbância
redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,453 1,5141
6 0,653 2,1725
9 0,967 3,2062
12 1,301 4,3057

Figura 20– Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para temperatura de
50°C.

5
Concentração de açúcar redutor (g/L)

4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min) y = 0,3419x + 0,1927
R² = 0,9882
 25

Tabela 23 – Dados para Temperatura 60°C.

Concentração de açúcar
Tempo (min) Absorbância
redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,326 1,0960
6 0,62 2,0638
9 0,943 3,1272
12 1,16 3,8415

Figura 21 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para temperatura de

60°C.

4,5
Concentração de açúcar redutor

4
3,5
3
2,5
(g/L)

2
1,5
1
0,5
0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min) y = 0,3223x + 0,0965
R² = 0,9958

Tabela 24 – Dados para Temperatura 63°C.

Concentração de açúcar
Tempo (min) Absorbância
redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,315 1,0598
6 0,512 1,7083
9 0,698 2,3206
12 0,814 2,7025
 26

Figura 22 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para temperatura de

63°C.

3,5

Concentração de açúcar redutor

3

2,5

2
(g/L)
1,5

0,5

0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min) y = 0,2207x + 0,2388
R² = 0,9698

Tabela 25 – Dados para Temperatura 66°C.

Concentração de açúcar
Tempo (min) Absorbância
redutor (g/L)
0 0 0,0228
3 0,182 0,6219
6 0,282 0,9511
9 0,385 1,2902
12 0,466 1,5569
Figura 23 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para temperatura de
66°C.

1,8
Concentração de açúcar redutor

1,6
1,4
1,2
1
(g/L)

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14
tempo (min) y = 0,1245x + 0,1413
R² = 0,9746
 27

Tabela 26 – Dados para Temperatura 70°C.

Concentração de açúcar
Tempo (min) Absorbância
redutor (g/L)
0 0 0,0228
1 0,045 0,1709
2 0,054 0,2006
3 0,063 0,2302
4 0,063 0,2302
5 0,082 0,2927
Figura 24 – Variação da concentração de açúcar redutor em função do tempo para temperatura de
70°C.

0,35
Concentração de açúcar redutor

0,3

0,25

0,2
(g/L)

0,15

0,1

0,05

0
0 1 2 3 4 5 6
tempo (min) y = 0,0445x + 0,08
R² = 0,8206

Tabela 27 – Dados de velocidade para cada temperatura.

Temperatura (K) v (g/L.min)
293,15 0,1029
313,15 0,2367
323,15 0,3419
333,15 0,3223
336,15 0,2207
339,15 0,1245
343,15 0,0445

Observa-se que a curva possue as áreas de ativação e inativação da enzima. Os valores

de temperatura foram convertidos de °C para Kelvin.
 28

Figura 25 - Curvas de ativação (azul) e inativação (vermelha) da enzima invertase.

0,400000

0,350000

0,300000

0,250000

0,200000

0,150000

0,100000

0,050000

0,000000
290 300 310 320 330 340 350

Como é de interesse compreender o comportamento da reação mediante a temperatura,

utiliza-se a equação de Arrhenius (Equação 6). Sendo K = v, objetiva-se determinar os dois
parâmetros desconhecidos da equação, a Energia de Ativação e a constante K0
𝐸𝑎
− (6)
𝑣 = 𝐾 = 𝐾0 ∗ ⅇ 𝑅𝑇

Ambos os valores podem ser obtidos através da linearização da equação de Arrhenius

(Equação 7) representada a seguir.
𝐸𝑎
ln 𝑘 = ln 𝑘0 − (7)
𝑅𝑇

Transformando-se a temperatura de ºC para K, os valores utilizados na regressão linear

estão representados na Tabela 15. Para encontrarmos os valores de inativação e ativação,
realizou-se separadamente duas regressões lineares, uma para determinar o valor de Ea e a
constante referente a etapa de ativação, e a outra para determinar a constante da etapa de
inativação. A curva obtida pode ser observada no gráfico.
 29

Tabela 28 – Valores utilizados na linearização da equação de Arrhenius.

ln v 1/T (K-1)
-2,27400 0,00341

-1,44096 0,00319

-1,07324 0,00309

-1,13227 0,00300

-1,51095 0,00297

-2,08345 0,00295

-3,11227 0,00291

Figura 26 - Curvas obtidas pela linearização da equação de Arrhenius.

0,00000
0,00280 0,00290 0,00300 0,00310 0,00320 0,00330 0,00340 0,00350
-0,50000

-1,00000

-1,50000

-2,00000 Ativação
Inativação
-2,50000

-3,00000

-3,50000 y = -3796,9x + 10,68

y = 22779x - 69,382 R² = 1
-4,00000 R² = 0,9742
1/T (K-1)

Pelo Gráfico 26, percebe-se que a inclinação negativa representa a ativação da enzima
e a reta de inclinação positiva representa a desativação da enzima. A ativação e desativação da
enzima obtidas através da linearização dadas pela Equação 7 e Equação 8, respectivamente:

𝑌 = 22779 *X – 69,382 (𝑖𝑛𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎çã𝑜) (7)

𝑌 = −3796,9 * X + 10,68 (𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎çã𝑜) (8)
 30

Dos ajustes dos dados da Tabela 28 e pela equação linearizada de Arrhenius, obteve-se
os parâmetros K0 e Ea, K0i e Ei, apresentados na Tabela 30 a seguir:

Tabela 30 – Resultados obtidos pela linearização da Equação de Arrhenius.

Parâmetros Calculados
Ei [KJ/g] K0i [g/L.min] Ea [KJ/g] K0 [g/L.min]

189,384 37,3753E-33 31,5674 43477,55

3.4 Conclusão

Após a prática, pode-se perceber a influência da temperatura na ação da enzima

invertase, esta atividade aumentou até a temperatura de aproximadamente 55°C na qual a
enzima teve sua maior atividade. Também é possível perceber que, a partir da temperatura de
60°C, há a diminuição da atividade enzimática até sua desativação. Conclui-se que temperatura
é um fator extremamente importante na determinação, pois a dependência da velocidade da
reação é diretamente proporcional à variável.

Simbologia

[S] – concentração de substrato [M.L-3]

Vmax– velocidade máxima - parâmetro do modelo de Michaelis &Menten [M.L-3.T-1]

Km – constante de afinidade da enzima pelo substrato - parâmetro do modelo de Michaelis &Menten

v – taxa ou velocidade da reação [M.L-3.T-1] [H+] – concentração de íons hidrogênio [mol.L-3] [Eo] –
fração total de enzima presente.
y - - fração ativa

K1,K2 e K3 – constantes cinéticas da reação pHótimo - valor de pH ótimo

pHexp- valor de pH calculado experimentalmente ko- fator de frequência da equação de Arrhenius Ea -
energia de ativação [M.L2.T-2.mol-1]
 31

Ei - energia de inativação ou desativação [M.L2.T-2.mol-1]

T - temperatura [T]

R - constante universal dos gases [M.L2.T-2.θ-1.mol-1

 32

Referências Bibliográficas

NOVAKI, Lexandra et al. Produção de invertase por fermentação em estado sólido a partir de
farelo de soja. Engevista, v. 12, n. 2, 2010

Repositorio.Ufu.Br, 2021, https://repositorio.ufu.br/bitstream/123456789/15184/1/d.pdf.

Acesso em: 15 Agosto 2021.

KATOH, Shigeo and YOSHIDA, Fumitake. Biochemical Engineering. WILEY. 2009.