Universidade Federal de Viçosa

Departamento de Tecnologia de Alimentos

TAL615 - Engenharia Bioquímica (2023/1)

Luíza Brito Campos

Questão 01
Para quantificação da atividade proteolítica, as soluções contendo a enzima a ser quantificada
devem ser previamente incubadas a 37 ºC. Em seguida, é adicionada uma solução de
azocaseína 0,5% (m/v) (substrato semelhante à caseína, que quando hidrolisado libera um
composto alaranjado), e a mistura é incubada por 40 min nessa temperatura para ocorrência
da reação. Após este período, adiciona-se 500 µL de uma solução de ácido tricloroacético (TCA)
10% (m/v) em cada tubo. Todos os tubos são então centrifugados a 3000 x g, a 4 ºC, por 10 min
e o sobrenadante é transferido para um novo tubo contendo solução de KOH 0,5 M. Por fim,
faz-se a leitura do conteúdo de cada amostra em espectrofotômetro a 430 nm. Uma solução
branco deve ser preparada contendo a solução tampão, solução de azocaseína e solução de
TCA.
Neste ensaio a azocaseína possui a função de substrato, e o ácido tricloroacético (TCA)
é utilizado com a finalidade de interromper a reação enzimática, por meio da precipitação de
azocaseína resultante que não reagiu, além da enzima. O KOH tem a função de solução
reveladora para realçar a coloração alaranjada resultante da reação enzimática com
azocaseína.”
Fonte: Charney, J.; Tomarelli, R.M. A colorimetric
method for the determination of the proteolytic
activity of duodenal juice. J biol chem., v. 171,
501-505, 1947. Retirado e adaptado do trabalho
acadêmico de João Carlos Lemos Pereira, “AVALIAÇÃO
DA PRODUÇÃO DE PROTEASES POR TRÊS FUNGOS
ISOLADOS DO CERRADO BRASILEIRO” Universidade de
Brasília.

a) Cite uma definição apropriada de unidade de atividade enzimática que poderia ser
usada como unidade para uma enzima cuja atividade foi quantificada por esse
processo.

Resposta: Dada definição pela International Union of Biochemistry (IUPAC), uma unidade de
atividade enzimática 1 U é "a quantidade de enzima que catalisa a conversão de um µmol do
substrato por minuto, nas condições do ensaio" (EMBRAPA,2021).

b) A preparação enzimática que você obteve a partir da bactéria B. subtilis alcançou uma
atividade específica de 50 U/g. Portanto, considerando a unidade de atividade
enzimática que você escolheu na questão anterior, qual seria a massa dessa
preparação necessária para hidrolisar 100 kg de caseína em 2 h de reação? Faça as
considerações que julgar necessárias.

Resposta:

50 para 1g = 50 U/min

2 horas= 120 min

120 min= 8,3.10^8
Logo:
1 g de enzima ______ 50 ug
X g de enzima ______ 8,33. 10^8ug

x = 1,67.10^4Kg de enzima.

c) Ao adicionar a massa da preparação calculada à matriz láctea, após 2 h de reação

apenas 75% da caseína havia sido hidrolisada. Levante ao menos 3 hipóteses para
justificar o que pode ter levado ao erro observado.

Resposta: Fatores que afetam a atividade enzimática

A atividade enzimática pode ser afetada por uma variedade de fatores, como temperatura, pH
e concentração. As enzimas funcionam melhor dentro de faixas específicas de temperatura e
pH, e condições que não estejam como ótimas podem fazer com que uma enzima não consiga
se ligar a um substrato. Por exemplo, ao aumentar a temperatura do meio em que foi
adicionado a enzima há a aceleração uma reação, e diminuir a temperatura desacelera a
reação. No entanto, temperaturas extremamente altas podem fazer com que uma enzima
perca sua forma, ou seja, ocorra um desnovelamento da estrutura terciária da enzima,
deixando-a sem atividade enzimática. Quanto ao pH cada enzima tem uma faixa ótima de pH.
Mudar o pH para um valor fora dessa faixa fará com que a atividade enzimática diminua. Uma
vez que modificaria as cargas relacionadas a enzima, assim deixando-as protonadas ou
desprotonadas em situações que impeça a enzima de aprender atividade. Também podemos
citar a concentração de enzimas e a concentração de substrato da amostra. Uma vez que
quanto maior a concentração enzimática e o aumento da concentração de substrato, pode
aumentar a taxa da reação de biocatalização até certo ponto.

Questão 02
Considerando os valores de atividade x tempo encontrados:

Concentraçãodo produto t
(mg/L) (min)
0,1 1
0,15 2
0,42 3
0,59 4
0,84 5
1,24 6
1,64 7
1,81 8
1,92 9
2,01 10
2,13 12
2,05 15

a) Qual tempo você escolheria para realizar o teste de atividade enzimática pelo método
de parada? Justifique.
Resposta:
Acredito que a utilização do tempo de 12 minutos seria o mais adequado. Já que há maior
concentração de produto nesse tempo e portanto sua atividade biocatalítica chega ao seu
máximo nesse ponto.

Considerando os valores de atividade x concentração de substrato (substrato A) obtidos após

definição do tempo:
Atividade
[S] (mg/mL)
(U)
3,73 2,0
5,26 4,1
6,34 6,1
6,89 8,0
7,45 10,0
7,78 12,0
7,95 14,0
8,10 16,0
8,24 18,0
8,37 20,0
8,94 40,0
9,22 60,0

b) Quais os valores de Km e Vmax para essa enzima, nesse sistema?

Vmax = 9,234 U Km = 2,98 mg/mL

Para um segundo substrato testado (substrato B) foi encontrado um Km mais baixo que para o
substrato A, embora a atividade máxima da enzima tenha sido semelhante para ambos.
c) Considerando que ambos os substratos geram o produto de interesse, qual substrato
seria escolhido por você para o processo? Justifique.

Resposta: Km é tido como uma constante que indica a afinidade entre a enzima e o substrato.
Quanto menor o Km, mais rápido a enzima atinge sua velocidade máxima e, portanto, maior
sua afinidade pelo composto. Dado esses fatores, o composto B acaba sendo mais adequado
para o processo do que o composto A.