Apostila 2017 Versão Final Laboratório de Enzimologia

Universidade Estadual de Maring
Departamento de Bioqumica
Curso de Bioqumica
Laboratrio
de
Enzimologia
2017
APRESENTAO
Este o seu guia de aulas prticas. Nele voc encontrar as atividades que sero
realizadas na disciplina Laboratrio de Enzimologia, compreendendo experimentos
clssicos de atividade enzimtica e anlise cintica.
Com ele, voc executar experimentos que visem avaliar as
caractersticas de uma enzima com o auxlio da espectrofotometria
e da cromatografia lquida de alta eficincia.
Todo o material est dividido em tpicos, representados pelos diferentes
experimentos. Cada tpico composto por Bases tericas, Proposio, Objetivos,

1
Protocolo e Procedimento experimental. Um Exerccio de fixao encerra o
experimento. No final deste guia, voc encontrar um Apndice com o formato do
Relatrio de Atividades a ser confeccionado pela equipe de trabalho.
Lidar com enzimas um empolgante
desafio! Na prtica significa: pipetar,
pipetar e pipetar... Se voc errar, no
desanime. H sempre uma chance para
recomear.
Aceite este desafio, concentre-se
e bom trabalho!
Osvaldo Ferrarese-Filho
Rogrio Marchiosi
SUMRIO
Apresentao ............................................................................................................................................ 1
Invertase: atividade cataltica ........................................................................................................... 3

1. Como obter o extrato de invertase? ................................................................................... 6
2. Quais os fatores que influenciam a atividade da invertase? ....................................... 6
3. Como quantificar os produtos da reao da invertase? ................................................ 7
4. Como calculada a atividade da invertase? ...................................................................... 9
5. Qual o tempo adequado para a reao da invertase? ................................................... 12
6. Como estabelecer o pH timo da invertase? ................................................................... 14
7. Qual a temperatura ideal para a atividade da invertase? ........................................... 16
8. A concentrao de invertase no meio de reao influencia a sua atividade? ........ 18
9. Invertase hidrolisa outros carboidratos? ........................................................................ 21
Invertase: modelo clssico de cintica enzimtica .................................................................... 23
2
1. Como so determinados os parmetros cinticos Vmax e Km da invertase? ............. 26
2. Como a invertase pode ser inibida? ................................................................................... 31
2.1. Inibio da invertase pelo sulfato de cobre .......................................................... 31
2.2. Inibio da invertase pela glicose ............................................................................ 35
Invertase: uma tcnica avanada para determinar a atividade cataltica .......................... 37
A cromatografia lquida de alta eficincia ........................................................................... 37
Procedimento experimental ...................................................................................................... 39
Apndice .................................................................................................................................................. 42
Esboando o Relatrio de Atividades .................................................................................... 43
Referncias ............................................................................................................................................ 44
Invertase: atividade cataltica
Bases tericas
Sacarose um dissacardeo composto de uma

molcula de -D-glicose e de uma molcula de -D-
frutose, unidas por uma ligao glicosdica do tipo
(12). Como possui este tipo de ligao, a sacarose
um carboidrato no redutor.
Invertase (ou -D-frutofuranosidase; EC 3.2.1.26) uma enzima que catalisa a

hidrlise da ligao glicosdica da sacarose produzindo uma mistura equimolar de -D-
glicose e -D-frutose.
O nome comum, invertase, se deve basicamente ao fato de que a hidrlise da

3
sacarose leva inverso da rotao ptica do meio reacional, quando observado em
polarmetro. Assim, o produto de hidrlise da sacarose gera uma mistura de glicose-
frutose, conhecida como acar invertido. Mais especificamente, este termo se refere a
uma caracterstica fsica da sacarose que se altera durante a hidrlise. De fato, a soluo
aquosa de sacarose gira o plano da luz polarizada para a direita (dextrorrotatria, +66,5)
enquanto os produtos da hidrlise giram o plano da luz polarizada para a esquerda
(levorrotatria, -20). O acar invertido possui caractersticas interessantes em relao
a uma soluo contendo somente sacarose como: maior poder edulcorante (devido
presena da frutose), maior possibilidade de concentrao (os monossacardeos formados
so mais solveis que a sacarose), ponto de ebulio mais alto e ponto de congelamento mais
baixo (em virtude da maior presso osmtica do produto).
A figura ao lado mostra a estrutura tridimensional da invertase de

Saccharomyces cerevisiae, uma levedura que utiliza sacarose como
nutriente. A invertase existe em mais de uma forma. Por exemplo,
a isoforma intracelular possui massa molar de 135.000 g mol-1,
enquanto a isoforma extracelular possui massa molar de 270.000 g
mol-1. Ao contrrio de muitas outras enzimas, a invertase exibe alta
atividade numa ampla faixa de pH (3,5 a 5,5), com um pH timo
prximo de 4,5. Ela atinge um mximo de atividade com 55C. O valor de Km para a enzima
livre aproximadamente 30 mmol L-1.
Embora estudos sobre invertase tenham
sido realizados h muito tempo, o seu
mecanismo da reao ainda no est claro. Um
possvel mecanismo para a formao do
complexo ativo invertase-sacarose est
mostrado ao lado. Neste modelo supe-se que
um nion carboxilato e uma histidina residual
estejam envolvidas na atividade cataltica.
Pode-se notar, tambm, a influncia do pH no
mecanismo de ligao do stio ativo da
invertase com grupos cidos e bsicos.
Nas prximas aulas voc conduzir

experimentos que esto agrupados
considerando dois importantes aspectos
relacionados atividade da invertase. No
primeiro grupo (A) voc avaliar os fatores que
podem influenciar a atividade enzimtica. No
segundo grupo (B) voc avaliar a ao de
inibidores e a cintica enzimtica.
A. FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE DA INVERTASE 4

Nos estudos com enzimas imprescindvel verificar como se comporta a velocidade
da reao (o que caracteriza a atividade cataltica) e avaliar como ela afetada em
resposta s mudanas dos parmetros experimentais. Isso se torna importante na medida
que alteraes na velocidade da reao (V) podem fornecer valiosas informaes sobre
como a enzima funciona numa clula viva.
Nestes experimentos voc extrair a invertase de leveduras e realizar ensaios que

visem determinar a ao desta enzima sobre a sacarose. Voc determinar a atividade
cataltica em funo do tempo de reao, pH timo, temperatura ideal, concentrao da
enzima no meio de reao e, por fim, a sua especificidade em relao ao substrato.
Objetivos
Extrair invertase de leveduras (fermento biolgico) e avaliar os

fatores que afetam sua atividade.
Expressar a atividade enzimtica em: a) velocidade da reao (V),

b) unidades de enzima (U) e c) atividade especfica.
Protocolo
O fluxograma abaixo indica os procedimentos a serem adotados.
Extrato enzimtico
(fermento biolgico)
Atividade da invertase
Tempo de reao
pH timo
Temperatura ideal
Concentrao da enzima
Especificidade
5
Procedimento experimental
Material
Amido 1%.
Bicarbonato de sdio 0,15 mol L-1.
Extrato de invertase.
Frutose 12 mmol L-1.
Glicose 12 mmol L-1 e 25 mmol L-1.
Lactose 10 mmol L-1.
Maltose 10 mmol L-1.
Tampo citrato 0,05 mol L-1 (pH 2; pH 3).
Tampo acetato 0,05 mol L-1 (pH 4; pH 4,7; pH 5).
Tampo fosfato 0,05 mol L-1 (pH 6; pH 7; pH 8).
Sacarose 250 mmol L-1.
Sulfato de cobre 20 mmol L-1.
cido 3,5-dinitrossaliclico (DNS) a 1%: Em um recipiente, dissolva 1 g de DNS
em 30 mL de gua destilada. Em outro recipiente, dissolva 30 g de tartarato de sdio e
potssio em 20 mL de hidrxido de sdio 2 mol L-1. Acondicione os dois recipientes em
banho-maria a 56C, at completa dissoluo. Misture as duas solues e complete o
volume para 100 mL com gua destilada.
1. Como obter o extrato de invertase?
Pese 50 g de fermento seco e dissolva em 250 mL de

bicarbonato de sdio 0,15 mol L-1. Incube (37C, 6 horas)
agitando ocasionalmente para a necessria autlise.
Centrifugue (3.500 rpm, 20 minutos). Colete o
sobrenadante, o qual contm a invertase. Conserve o extrato
em geladeira, pois nesta condio a estabilidade da enzima
mantida por vrios meses. Determine o teor de protenas.
No momento do uso, dilua o extrato enzimtico para obter a
concentrao de protenas na faixa de 0,05 a 0,1 mg mL-1.
2. Quais os fatores que influenciam a atividade da invertase?
Como voc j sabe, invertase hidrolisa sacarose (um dissacardeo no redutor)

formando dois monossacardeos (glicose e frutose), os quais possuem propriedades
redutoras. Assim, quantificar a formao destes acares redutores aps a hidrolise da
sacarose uma boa maneira de verificar se a invertase est ativa. O modo escolhido
para quantificar os dois monossacardeos utiliza o reagente de cido 3,5-
dinitrossaliclico (DNS). Esta escolha se deve ao fato que em um meio fortemente
alcalino, e a quente, os acares redutores formam enediis que cedem eltrons para
reduzir o 3,5-dinitrossalicilato a 3-amino-5-nitrossalicilato, produzindo uma colorao
alaranjada. Esta cor ser tanto mais intensa quanto maior a concentrao de acar
redutor presente no meio de reao. 6
Para determinar a ao cataltica da invertase siga o protocolo delineado abaixo.
Tcnica
Tubo A: pipete 1,0 mL de tampo acetato 0,05 mol

L (pH 4,7) e 0,2 mL de sacarose 250 mmol L-1.
-1
Tubo B: pipete 0,6 mL de tampo acetato 0,05

mol L (pH 4,7) e 0,2 mL de sacarose 250 mmol L-1.
-1
Deixe os tubos temperatura ambiente. Adicione

0,4 mL de invertase 0,05 mg mL-1 no tubo B e marque 5
minutos. Aps completar este tempo, adicione 0,5 mL de
reagente de cido 3,5-dinitrossaliclico (DNS) a 1% nos
dois tubos.
Aquea os tubos, a 1000C, por 5 minutos. Resfrie em banho de gua.
Compare os dois tubos. O que voc notou?
Observe o tubo B. A seguir, leia com ateno o protocolo e verifique quais os

componentes e as condies experimentais estabelecidas neste tubo. Note que nele
esto presentes sacarose (S), invertase (E) e, certamente, os produtos (P) formados
(glicose e frutose), os quais reagiram com DNS resultando em uma cor alaranjada,
diferente do tubo A (controle). Alm disso, note que as condies necessrias para que
a reao ocorresse foram: tempo (5 minutos), pH do meio (4,7) e temperatura (nesse
caso, ambiente).
[invertase] pH
[sacarose] temperatura
[glicose + frutose] tempo de reao
Diante do que voc observou neste procedimento algumas medidas sero

tomadas, a partir de agora, para melhor compreenso do que ocorre durante uma reao
enzimtica. O primeiro passo estabelecer um protocolo para quantificar os produtos
formados na reao. Com voc j deve saber, existem vrios procedimentos para
quantificar compostos qumicos e um dos mais usuais num laboratrio de Bioqumica a
espectrofotometria.
3. Como quantificar os produtos da reao da invertase? 7

Como notado anteriormente (tubo B), o mtodo empregado para a quantificao
de glicose e frutose foi o do reagente de cido 3,5-dinitrossaliclico (DNS).
Como voc sabe, a hidrlise enzimtica de uma molcula de sacarose gera -D-
glicose e -D-frutose. Essas unidades de hexoses, com caractersticas redutoras,
quando submetidas ao aquecimento num meio fortemente alcalino, formam enediis,
como mostra a figura abaixo. Estes, por sua vez, podem ceder eltrons para reduzirem
o reagente 3,5-dinitrossalicilato (DNS), de cor amarela, a 3-amino-5-nitrossalicilato, de
cor laranja. Cada mol de acar redutor presente na soluo formar 1 mol de 3-amino-
5-nitrossalicilato. Este produto da reao absorve luz em 540 nm, o comprimento de
onda adequado para determinar a concentrao de acares redutores presentes na
soluo.
Curva padro
Levando em conta que a reao enzimtica da hidrlise de sacarose produz

glicose e frutose, e que ambos reagem com o DNS, voc deve preparar a curva padro
com uma mistura equimolar destes monossacardeos. Para isso, siga a sequncia abaixo.
Reagente (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6
Tampo acetato
1,20 1,10 1,00 0,80 0,60 0,40
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Glicose 12 mmol L-1 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40
Frutose 12 mmol L-1 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40
Adicione DNS em todos os tubos.
DNS 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
Aquea a 100C por 5 minutos.

Resfrie os tubos e adicione gua destilada.
gua destilada 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30

8
Efetue as leituras em 540 nm, contra o branco (tubo 1).
Anote os resultados na tabela adiante.
Clculos
Etapa 1: Determinao da concentrao de glicose + frutose no meio de reao
Uma vez que a curva padro foi executada com concentraes equimolares de
glicose e frutose, calcule a concentrao desta mistura no meio de reao, para o Tubo
2, como segue.
Informaes do Tubo 2
Concentrao inicial da mistura equimolar [glicose + frutose] = 12 mmol L-1.

Volume inicial da mistura equimolar = 0,10 mL (0,05 mL de cada monossacardeo).
Volume final da mistura equimolar no meio de reao = 1,20 mL (contendo 0,05
mL de glicose + 0,05 mL de frutose + 1,10 mL de tampo acetato).
Portanto, a [glicose + frutose] no meio dada pela regra:
Ci Vi = Cf Vf
onde: Ci = [glicose + frutose] inicial; Vi = volume inicial da mistura equimolar; Cf =

[glicose + frutose] final e Vf = volume final da mistura equimolar.
Ento:
12 mmol L-1 0,10 mL = [glicose + frutose] 1,20 mL
[glicose + frutose] = (12 mmol L-1 0,10 mL) 1,20 mL
[glicose + frutose] = 1,0 mmol L-1
Aplique o mesmo raciocnio para os demais tubos. Anote os resultados.
Tubos
1 2 3 4 5 6
Absorbncia 0,00
[glicose + frutose] (mmol L-1) 0,00
Etapa 2: Obteno do fator de calibrao (FC)
Plote um grfico de Absorbncia versus [glicose +

frutose].
Calcule o fator de calibrao (FC), expresso em

mmol L-1.
FC FC 9
Observaes
a) Voc poder obter o fator de calibrao (FC) recorrendo a qualquer
programa grfico. Para isso, faa a regresso linear dos dados. Note que
FC = 1/inclinao da reta.
b) Utilize o valor obtido para o FC nos prximos experimentos.
4. Como calculada a atividade da invertase?
Agora que voc construiu a curva padro de glicose e frutose, efetue a leitura do
tubo B em espectrofotmetro a 540 nm, contra o tubo A. Anote o valor de absorbncia
obtido. Para calcular a atividade da invertase no tubo B, siga os passos descritos a seguir.
Clculos
Etapa 1: Determinao da concentrao de invertase no meio de reao.
Calcule a concentrao da enzima no meio de reao do tubo B, considerando:

Concentrao inicial de invertase = 0,05 mg mL-1
Volume inicial de invertase = 0,4 mL
Volume final do meio de reao = 1,20 mL (contendo 0,60 mL de tampo acetato +
0,20 mL de sacarose + 0,40 mL de invertase).
A concentrao final de invertase no meio de reao dada pela regra:
Ci Vi = Cf Vf
onde: Ci = concentrao inicial de invertase; Vi = volume inicial de invertase; Cf =

concentrao final de invertase e Vf = volume final do meio de reao. Ento:
0,05 mg mL-1 0,40 mL = [invertase] 1,20 mL

[invertase] = (0,05 mg mL-1 0,40 mL) 1,20 mL
[invertase] = 0,01667 mg mL-1
[invertase] = 16,67 g mL-1
Com base nesta informao calcule a atividade da invertase como segue.
Etapa 2: Atividade da invertase expressa como velocidade da reao (V)
O termo atividade enzimtica designa a prpria atividade cataltica da enzima

expressa geralmente em velocidade da reao (V). Em palavras mais simples, representa
a quantidade de massa transformada por unidade de tempo, expressa em mol min-1.
Para seu clculo, a concentrao dos produtos formados [glicose + frutose]
durante a reao enzimtica obtida com o auxlio do Fator de Calibrao (FC), obtido
da curva padro. Como exemplo, considere o FC = 6,0 mmol L-1; A540 = 0,780; o volume
final do meio de reao = 1,2 mL e o tempo de reao = 5 minutos.
Com base nestas informaes, a concentrao de frutose + glicose :
[glicose + frutose] = FC A540

10
[glicose + frutose] = 6,0 mmol L-1 0,780 = 4,68 mmol L-1
[glicose + frutose] = 4,68 mol mL-1
Se o volume final do meio de reao foi 1,2 mL, ento:
4,68 mol ____________ 1,0 mL

[glicose + frutose] ____________ 1,2 mL
[glicose + frutose] = 5,62 mol
Se o tempo de reao foi de 5 minutos, ento a velocidade da reao (V) :
V = [glicose + frutose] tempo da reao

V = 5,62 mol 5 min = 1,12 mol min-1
Etapa 3: Atividade da invertase expressa como unidade (U) de enzima
Por definio, estabelecida pela Enzyme Commission (EC), uma unidade de

enzima (U) corresponde quantidade de enzima capaz de transformar 1 mol de
substrato em produto por minuto nas condies definidas de ensaio (pH, temperatura,
fora inica) e com o substrato em concentrao saturante. Com base nisso, uma
unidade (U) de invertase corresponde quantidade de invertase capaz de catalisar a
formao de 1 mol de acares redutores (frutose + glicose) por minuto nas condies
de ensaio.
A unidade de invertase (U) pode ser obtida a partir da velocidade da reao
enzimtica (V). Como exemplo, considere o resultado da Etapa 2.
V = 1,12 mol min-1
Seguindo a definio acima a atividade da enzima (V) corresponde tambm

unidade (U) de enzima presente no meio de reao, j que:
1U _______ 1,0 mol min-1
Atividade _______ 1,12 mol min-1
Atividade = 1,12 U
A atividade da invertase pode tambm ser expressa em U mL-1. Como o volume

final da reao foi 1,2 mL, ento:
1,12 U _______ 1,2 mL
Atividade _______ 1,0 mL
Atividade = 0,93 U mL-1
Etapa 4: Atividade especfica da invertase
Por definio, atividade especfica representa o nmero de mol de um substrato

transformado por uma preparao enzimtica por minuto por miligrama de protena a 250C.
Em outras palavras, a atividade da enzima expressa em massa por unidade de tempo (isto
, mol min-1) dividida pela quantidade de protena (em geral expressa em mg). Assim, a
atividade especfica pode ser expressa em mol min-1 mg-1 de protenas ou, ainda, U mg-1
de protenas. 11
A atividade especfica considerada uma medida da pureza de uma preparao
enzimtica, ou seja, quanto maior a atividade especfica, maior ser o grau de pureza da
preparao. Portanto, ela muito til durante o procedimento de purificao de uma
enzima, o qual consiste na eliminao de outras protenas presentes no extrato.
Voc deve ter notado que durante a Obteno do extrato de invertase foi
utilizado bicarbonato de sdio para a extrao da invertase. Nenhuma etapa subsequente
foi realizada, e a suspenso obtida denominada extrato bruto. possvel determinar a
atividade, neste extrato, como uma primeira medida, seguido das subsequentes etapas de
purificao com adicionais medidas da atividade especfica.
Para fins didticos, determine a atividade especfica da invertase no tubo B.

Considere que a [invertase] no meio = 0,01667 mg mL-1 (Etapa 1) e a V = 1,12 mol min-1
(Etapa 2).
Seguindo a definio de atividade especfica (mol min-1 mg-1 protenas), ento:
1,12 mol min-1 _______ 0,01667 mg de protenas

Atividade especfica _______ 1,0 mg de protenas
Atividade especfica = 67,2 mol min-1 mg-1 de protenas
5. Qual o tempo adequado para a reao da invertase?
Estabelecer o tempo de uma reao cataltica uma

das maneiras de compreender como atua uma enzima. Isso
porque, em condies adequadas das concentraes de
enzima e substrato, a velocidade (V) da reao enzimtica
deve ser proporcional ao tempo gasto para a enzima catalisar
a reao.
Para determinar a atividade da invertase em funo

do tempo da reao siga o procedimento descrito abaixo.
Reagentes (mL) Tubos e tempos (minutos)
1 2 3 4 5 6 7 8
(1,0) (2,5) (5,0) (7,5) (10) (12,5) (15)
Tampo acetato
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
Sacarose
(250 mmol L-1)
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Mantenha os tubos a temperatura ambiente

Adicione enzima (0,2 mL) no tubo 2.
12
Quando a reao completar exatamente 1,0 minuto, adicione DNS.
Siga o mesmo procedimento para os demais tubos obedecendo os tempos estipulados
Enzima (0,05 mg mL-1) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
DNS 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Aquea todos os tubos a 100C por 5 minutos.

Resfrie os tubos em banho de gua
Adicione gua destilada (3,3 mL) em cada tubo.
gua destilada 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3
Absorbncia 0,00
Clculos
Atividade enzimtica expressa como velocidade da reao (V)
Calcule as atividades da invertase seguindo os passos descritos na Etapa 2

(Clculos) do item 4 (Calculando a atividade da invertase) e insira na tabela abaixo.
Importante: Lembre-se que cada reao tem um tempo diferente, o qual deve ser
levado em conta nos clculos da atividade enzimtica.
Anlise dos resultados
Tubo Tempo Atividade

(minutos) (mol min-1)
2 1,0
3 2,5
4 5,0
Plote, em papel milimetrado, os valores de 5 7,5

atividades enzimticas, expressos como
6 10,0
velocidade (V) versus o tempo de reao
enzimtica. 7 12,5
Interprete os resultados. 8 15,0

13
Exerccio de fixao
Os dados da tabela abaixo se referem a um experimento da reao da invertase

de leveduras com o substrato sacarose, formando os produtos glicose e frutose. O
tempo da reao foi de 5 minutos. Uma curva padro foi preparada com concentraes
equimolares (12 mmol L-1) de glicose e frutose, e dela obtido um Fator de Calibrao
(FC) de 7,6.
Reagente (mL) Tempos (minutos)

0 5 10 15 20 25
Tampo acetato
1,20 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Sacarose 250 mmol L-1 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
Enzima (0,1 mg mL-1) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Absorbncia 0,080 0,255 0,511 0,560 0,600
Com base nestas informaes:

a) Calcule as atividades da invertase, em cada tempo de reao, expressas em
mol min-1.
b) Represente graficamente as atividades enzimticas versus tempos de reao.
Interprete os resultados.
6. Como estabelecer o pH timo da invertase?
Entende-se por pH timo (ou uma faixa tima de pH)

aquele no qual a atividade cataltica mxima. Isto
pressupe que a atividade da enzima decresce em valores
de pH distantes do pH timo. De certo modo, isso no
surpresa, pois as cadeias laterais dos aminocidos,
presentes no stio ativo da enzima, podem funcionar como
cidos ou bases. Assim, a faixa de pH na qual uma enzima
sofre mudana na atividade pode fornecer uma pista para o
tipo de resduo de aminocido envolvido.
Para determinar a atividade da invertase em funo do pH do meio de reao

siga o procedimento abaixo.
Reagentes (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tampo citrato pH 2,0 1,0
Tampo acetato pH 4,0 0,8
Tampo fosfato pH 6,0 0,8
Tampo fosfato pH 7,0
Tampo fosfato pH 8,0
0,8
0,8
14
Sacarose (250 mmol L-1) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Adicione enzima (0,2 mL) no tubo 2 e marque o tempo.
Aps 30 segundos, adicione enzima no tubo 3.
Adote o mesmo intervalo de tempo para as subsequentes adies de enzima.
Enzima (0,05 mg mL-1) --- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Quando a reao do tubo 1 completar exatamente 5 minutos, adicione DNS.

Adicione DNS em cada tubo seguindo o mesmo intervalo de tempo estipulado.
DNS 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Resfrie e adicione gua destilada em todos os tubos.
gua destilada 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3
Absorbncia 0,00
Clculos

Tubo pH Atividade
(mol min-1)
2 2,0
3 3,0
4 4,0
Plote, em papel milimetrado, os valores de 5 4,7
atividades enzimticas, expressos como
6 5,0
velocidade (V) versus o pH do meio de
reao. 7 6,0
Interprete os resultados. 8 7,0
9 8,0
15
Exerccio de fixao

(FC) de 6,8.
Reagente (mL) pH
0 3,0 6,2 8,4 9,1 10,5
Tampo acetato
1,10 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Sacarose 250 mmol L-1 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Enzima (0,05 mg mL-1) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Absorbncia 0,06 0,42 0,36 0,25 0,17
a) Calcule as atividades da invertase, expressas em mol min-1.
b) Represente graficamente as atividades enzimticas versus pH do meio de

reao. Interprete os resultados.
7. Qual a temperatura ideal para a reao da invertase?
A manuteno de uma temperatura adequada de

fundamental importncia para a atividade enzimtica. Em
geral, a velocidade da reao (V) proporcional ao aumento
da temperatura, at atingir uma faixa ideal. Entretanto,
alm desta faixa a atividade da enzima diminui. O aumento
da temperatura agita intensamente as molculas causando
mais choques entre elas. Temperatura excessiva intensifica
a agitao entre as molculas, desestabiliza as ligaes que
mantm a estrutura tridimensional da enzima e causa
desnaturao.
Para determinar a atividade da invertase em funo da temperatura meio de

reao siga o procedimento abaixo.
Reagente (mL) Tubos e temperaturas (0C)

1 2 3 4 5 6 7 8
(00C) 0
(25 C) 0
(35 C) 0
(45 C) (550C) (620C) (970C)
Tampo acetato
1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Enzima (0,05 mg mL-1) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Mantenha os tubos em cada temperatura estabelecida durante 10 minutos. 16

Adicione sacarose (0,2 mL) no tubo 1 e marque o tempo.
Aps 30 segundos, adicione sacarose no tubo 2.
Adote o mesmo intervalo de tempo para as subsequentes adies de sacarose.
Sacarose 250 mmol L-1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Quando o tempo do tubo 2 completar exatamente 5 minutos, adicione DNS.

Adicione DNS em cada tubo seguindo o mesmo intervalo de tempo estipulado.
DNS 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Adicione gua destilada em todos os tubos.
gua destilada 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3
Absorbncia 0,00
Clculos

Tubo Temperatura Atividade
(0C) (mol min-1)
2 0
3 25
4 35
Plote, em papel milimetrado, os valores 5 45
de atividades enzimticas, expressos
6 55
como velocidade (V) versus a
temperatura do meio de reao. 7 62
Interprete os resultados. 8 97
17
Exerccio de fixao

(FC) de 8,64.
Reagente (mL) Temperatura (0C)

0 25 35 45 60 85
Tampo acetato
1,30 1,00 1,00 1,00 1,00 1,090
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Enzima (0,05 mg mL-1) 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
Sacarose 250 mmol L-1 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
Absorbncia 0,05 0,36 0,62 0,45 0,21
a) Calcule as atividades da invertase, expressas em mol min-1.
b) Represente graficamente as atividades enzimticas versus temperatura do

meio de reao. Interprete os resultados.
8. A concentrao de invertase no meio de reao influencia a sua atividade?
Como voc notou, a atividade da invertase

representa a medida da velocidade com que ela
transforma o substrato em produtos. Logo, a
velocidade da reao enzimtica (V) uma funo da
quantidade de enzima (E) disponvel. Assim, V
diretamente proporcional concentrao de E, desde
que haja substrato (S) suficiente no meio de reao.
Para determinar a atividade da invertase em

funo da sua concentrao no meio de reao siga o
procedimento descrito abaixo.
Reagente (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6
Tampo acetato
1,00 0,95 0,90 0,80 0,70 0,60
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Sacarose 250 mmol L-1 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Mantenha os tubos temperatura ambiente. 18

Aps 1 minuto, adicione enzima (0,10 mL) no tubo 3.
Adote o mesmo intervalo de tempo para as subsequentes adies da enzima.
Enzima (0,05 mg mL-1) 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40

Adicione DNS seguindo o mesmo intervalo de tempo estipulado acima.
DNS 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

gua destilada 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30
Absorbncia 0,00
Clculos
Etapa 1: Determinao da concentrao de invertase no meio de reao.
Calcule a concentrao da enzima no meio de reao do tubo 2, considerando:

Concentrao inicial de invertase = 0,05 mg mL-1
Volume inicial de invertase = 0,05 mL
0,20 mL de sacarose + 0,05 mL de invertase).
A concentrao final de invertase no meio de reao dada pela regra:
Ci Vi = Cf Vf
onde: Ci = concentrao inicial de invertase; Vi = volume inicial de invertase; Cf =

concentrao final de invertase e Vf = volume final do meio de reao. Ento:
0,05 mg mL-1 0,05 mL = [invertase] 1,20 mL

[invertase] = (0,05 mg mL-1 0,05 mL) 1,20 mL
[invertase] = 0,0021 mg mL-1
[invertase] = 2,1 g mL-1
Com base nesta descrio, calcule as concentraes de invertase nos demais

tubos de reaes. Anote os resultados na tabela adiante.
Etapa 2: Atividade enzimtica expressa como velocidade da reao (V)
Calcule as atividades da invertase seguindo os passos descritos na Etapa 2 19

Etapa 3: Atividade enzimtica expressa como unidade (U) de enzima

Tubo Atividade Atividade [E]
(mol min-1) (U mL-1)
1 0,00 0,00 0,00
3
Plote, em papel milimetrado, os valores de
atividades enzimticas, expressos como 4
velocidade (V) ou como unidade (U mL-1) 5
versus a concentrao de invertase [E].
6
Exerccio de fixao

(FC) de 6,9.
Reagente (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6
Tampo acetato
1,20 1,10 1,00 0,90 0,80 0,70
(0,1 mol L-1 pH 4,7)
Sacarose 200 mmol L-1 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
Enzima (0,1 mg mL-1) 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
Absorbncia 0,093 0,196 0,398 0,634 0,812
Com base nestas informaes calcule:
a) a concentrao de invertase no meio de reao, expressa em g mL-1.

b) a atividade da invertase expressa em mol min-1.
c) a atividade da invertase expressa em U mL-1.
Represente graficamente os dados obtidos 20

9. Invertase hidrolisa outros carboidratos?
Especificidade a capacidade que uma enzima

possui de distinguir o seu substrato de outras molculas.
Ela define a afinidade da enzima por grupos especficos em
um determinado substrato. Por exemplo, tripsina hidrolisa
ligaes peptdicas, amdicas ou steres formados pela
lisina ou arginina. Por outro lado, succinato desidrogenase
catalisa unicamente a converso reversvel do succinato em
fumarato.
Para verificar se a invertase hidrolisa outros carboidratos, alm da sacarose,

siga o procedimento descrito abaixo.
Reagente (mL) Tubos

BrA Amido BrM Maltose BrL Lactose BrS Sacarose
Tampo acetato 0,9 0,7 0,9 0,7 0,9 0,7 0,9 0,7
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Amido 1% 0,3 0,3
Maltose 10 mmol L-1 0,3 0,3
Lactose 10 mmol L-1 0,3 0,3
Sacarose 250 mmol L-1 0,3 0,3

Adicione enzima (0,2 mL) no tubo Amido e marque o tempo.
21
Aps 30 segundos, adicione enzima no tubo Maltose.
Siga o mesmo intervalo de tempo para adicionar enzima nos tubos Lactose e Sacarose.
Enzima (0,05 mg mL-1) 0,2 0,2 0,2 0,2
Quando a reao do tubo Amido completar exatamente 5 minutos, adicione DNS.

Siga o mesmo intervalo de tempo para adicionar DNS nos tubos que receberam enzima.
Adicione DNS nos tubos definidos como brancos (Br).
DNS 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Adicione gua destilada em todos os tubos.
gua destilada 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3
Efetue as leituras (em 540 nm) dos tubos Amido, Maltose, Lactose e Sacarose
contra os seus respectivos controles.
Absorbncia 0,00 0,00 0,00 0,00

Clculos

Tubo Atividade
(mol min-1)
Amido
Maltose
Lactose
Interprete os resultados. Sacarose
22
Invertase: modelo clssico de cintica enzimtica
Bases tericas
Como voc sabe, enzimas

constituem eficientes catalisadores
biolgicos que aceleram as velocidades das
reaes sem, no entanto, sofrerem
transformaes. Elas so responsveis
pela ocorrncia e controle da maioria dos
processos metablicos celulares. Na estrutura da enzima (E) destaca-se uma pequena
regio denominada stio ativo, responsvel pela ao cataltica. A conformao correta
do stio ativo, induzida pelo substrato (S), de fundamental importncia na atividade
enzimtica. Em uma reao enzimtica, essa se liga ao substrato para formar o
complexo enzima-substrato (ES). A formao deste complexo leva a um estado de
transio que pode gerar o produto (P), que liberado da enzima. Como todo catalisador,
a enzima regenerada ao final da reao, como mostra o modelo simplificado acima.
A cintica enzimtica uma ferramenta essencial

da enzimologia. Ela consiste em medidas de
23
velocidade da reao catalisada por uma enzima, sob
diversas condies. Estas medidas tm duas
finalidades: a caracterizao da enzima e o
mecanismo da reao enzimtica. Este estudo
fornece considerveis informaes sobre as
caractersticas da reao catalisada, as quais so teis para melhor compreenso do
metabolismo. Cada enzima possui um conjunto de caractersticas prprias que se
manifestam na sua atividade cataltica. Como voc deve ter notado, vrios parmetros
(tempo de reao, pH, temperatura e quantidade de enzima no meio de reao)
relacionados s caractersticas da invertase, foram obtidos nos experimentos
anteriores. Alm destes parmetros, voc pode medir a dependncia da velocidade de
reao (V) enzimtica em relao concentrao do substrato ([S]), e dela obter
parmetros cinticos importantes.
O mecanismo bsico para a ao

cataltica de uma enzima est mostrado
direita. Ele descreve a reao onde ocorre
a converso reversvel de um nico
substrato em um nico produto. Os
smbolos k1, k-1, k2 e k-2 representam as constantes de velocidade das etapas de cada
uma das transformaes indicadas pelas setas. Devido importncia desta equao
deduz-se, de acordo com a hiptese de Michaelis-Menten, que ocorre a formao do
complexo ES. Assim, a velocidade de formao do produto depende da concentrao do
complexo ES, que por sua vez, depende da concentrao da enzima, da concentrao do
substrato, da relao k1/k-1 e de k2. A concentrao do complexo ES aumenta com o
aumento da concentrao de substrato at que toda a enzima esteja sob a forma de
complexo ES. Nestas condies, a velocidade da reao mxima (Vmax). Quando a
concentrao de substrato constante e em excesso, a velocidade de formao do
produto diretamente proporcional concentrao da enzima. Com base nisso, voc
pode avaliar a quantidade de enzima presente em lquidos biolgicos, tecidos, etc.
Como visto, a velocidade de uma reao enzimtica (V)

pode ser medida pela quantidade de substrato
transformado ou de produto formado por unidade de
tempo. A relao entre a velocidade da reao (V) e a
concentrao do substrato [S] pode ser mostrada
graficamente. Note que em baixa concentrao de
substrato quase a totalidade da enzima se encontra
em estado livre, e V ser proporcional a [S]. O
equilbrio de E + S ES ser deslocado para ES, a medida que a [S] aumenta. Quando
toda a enzima estiver presente como complexo ES a reao atinge sua velocidade
mxima e a concentrao de enzima livre infinitamente pequena. Nesta condio, a
enzima est saturada pelo substrato. Deste grfico, voc pode obter dois importantes
parmetros: a velocidade mxima de reao (Vmax), que funo da concentrao inicial
de enzima livre (E) e o Km. Este, conhecido como constante de Michaelis-Menten,
24
representa a [S] quando a reao ocorre com a metade de sua Vmax, uma caracterstica
relacionada com a afinidade da enzima pelo substrato. O parmetro Km pode ser
considerado o inverso de uma medida da afinidade entre a enzima e o substrato.
Portanto, quanto menor o valor de Km maior a afinidade. Entretanto, este tipo de grfico
no representa o modo mais preciso de se determinar os parmetros cinticos. Para
evitar imprecises na avaliao grfica de Michaelis-Menten, voc pode transformar os
dados e represent-los de acordo com o plote idealizado por Lineweaver-Burk, como
segue.
Uma equao geral para velocidade da reao enzimtica, conhecida como

equao de Michaelis-Menten, descrita como:
O inverso desta equao

corresponde equao da reta,
ou seja, y = ax + b, e chamada
de equao de Lineweaver-Burk.
A representao grfica de 1/V versus 1/[S],

chamado de grfico de duplo recproco, fornece uma
linha reta com inclinao Km/Vmax. A interseco no
eixo y 1/Vmax e a interseco no eixo x -1/Km. Com
os dados das interseces em mos, voc obtm os valores de Vmax e Km.
B. COMPORTAMENTO CINTICO DA INVERTASE

Nos prximos experimentos, voc determinar a atividade da invertase em
funo da concentrao do substrato e os efeitos de inibidores, com especial nfase
para a obteno dos parmetros cinticos Vmax e Km.
Objetivos
a) Determinar a atividade da invertase em funo da concentrao de

sacarose.
b) Determinar a atividade da invertase em funo da presena de

inibidores no meio de reao.
Protocolo
O fluxograma abaixo indica os procedimentos a serem adotados. 25
Extrato enzimtico
(fermento biolgico)
Atividade da invertase
Concentrao do
substrato
Inibio da
enzima
1. Como so determinados os parmetros cinticos Vmax e Km da invertase?
Como descrito anteriormente, a relao entre a

velocidade da reao enzimtica (V) e a concentrao do
substrato (S) pode ser representada diretamente num
grfico. A partir deste grfico possvel obter estimativas
preliminares de Vmax e de Km.
Para determinar estes importantes parmetros,

prepare uma curva de concentrao do substrato seguindo o
procedimento abaixo.
Reagente (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6 7 8
Tampo acetato
1,00 0,975 0,950 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Sacarose 250 mmol L-1 0,025 0,050 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
Mantenha os tubos temperatura ambiente.

Aps 30 segundos, adicione enzima no tubo 2. 26
Enzima (0,08 mg mL-1) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20

DNS 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

gua destilada 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30
Absorbncia 0,00
Clculos

Obtenha os valores de 1/[V] e insira na mesma tabela.
Etapa 2: Determinao da concentrao de sacarose no meio de reao
Calcule a concentrao de sacarose no meio de reao (tubo 2), considerando:

Concentrao inicial de sacarose = 250 mmol L-1
Volume inicial de sacarose = 0,025 mL
Volume final do meio de reao = 1,20 mL (contendo 0,975 mL de tampo acetato
+ 0,025 mL de sacarose + 0,20 mL de invertase).
A concentrao final de sacarose no meio de reao dada pela regra:
Ci Vi = Cf Vf
onde: Ci = concentrao inicial de sacarose; Vi = volume inicial de sacarose; Cf =

concentrao final de sacarose e Vf = volume final do meio de reao. Ento:
250 mmol L-1 0,025 mL = [sacarose] 1,20 mL
[sacarose] = (250 mmol L-1 0,025 mL) 1,20 mL
[sacarose] = 5,21 mmol L-1

27
Com base nesta descrio, calcule as concentraes de sacarose nos demais
tubos de reaes e insira na tabela abaixo. Complete a tabela com os valores de 1/V,
1/[S] e V/[S].
Resultados
Tubo V [S] 1/V 1/[S] V/[S]

(mol min-1) (mmol L-1)
1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
2
3
4
5
6
7
8
A. Confeco manual dos grficos
Voc dever obter os valores de Vmax e de Km seguindo os procedimentos abaixo.
a. Determinao da Vmax e do Km pelo grfico de Michaelis-Menten
Este procedimento consiste na

representao direta da velocidade da reao
(V) contra a concentrao de sacarose [S].
Plote os dados num papel milimetrado e
determine os valores aparentes de Vmax e de Km.
Insira os resultados na tabela adiante.
Note que Km representa a concentrao
de substrato na qual a velocidade da reao
metade da Vmax.
b. Determinao da Vmax e do Km pelo grfico de Lineweaver-Burk
Este procedimento consiste na linearizao da

equao de Michaelis-Menten, mostrada
anteriormente. O grfico de Lineweaver-Burk
consiste no duplo recproco dos dados de V e de 28
[S].
A equao do duplo
recproco dada
como:
Plote, num papel milimetrado, os dados de 1/V versus 1/[S]. Determine os

valores de Vmax e de Km e os insira na tabela. Note que a interseco no eixo y 1/Vmax e
a interseco no eixo x -1/Km.
c. Determinao da Vmax e do Km pelo grfico de Eadie-Hofstee
Este procedimento consiste na representao grfica da

velocidade de reao (V) contra a razo V/[S].
A equao de Eadie-Hofstee
dada como:
Plote os dados num papel milimetrado e determine os

valores de Vmax e de Km. Insira os resultados na tabela.
Note que a interseco no eixo y Vmax; a interseco no
eixo x Vmax/Km e a inclinao da reta -Km.
B. Confeco computadorizada dos grficos
Agora que voc confeccionou manualmente os grficos execute, para fins

comparativos, a mesma tarefa recorrendo a um programa computacional. Para isso, use o
pacote Sigmaplot 12.0, disponvel no Laboratrio de Informtica do Departamento.
Ao confeccionar seus grficos, voc deve ter notado que, exceto a
representao de Michaelis-Menten, todas so linearizadas. Para isso, foi necessrio
transformar os seus dados. Esse procedimento gera um problema. Pelo fato de os dados
experimentais nunca serem perfeitos, os pontos no descrevem retas to perfeitas. Em
outras palavras, a transformao distorce o erro experimental, pois a regresso linear
assume que a disperso de pontos em torno de uma linha segue uma distribuio
Gaussiana e que o desvio padro o mesmo em todos os valores de X. Todavia, estes
pressupostos raramente so verdadeiros aps a transformao dos dados. Assim, a
anlise dos parmetros cinticos por grficos linearizados pode gerar pequenos desvios
que influenciam os valores dos parmetros cinticos definitivos.
O procedimento de linearizao dos dados foi uma necessidade. Antes do
advento da anlise de regresso no linear, os investigadores tinham que transformar os
dados de curvas em linhas retas, para analis-los por regresso linear. Uma maneira de
fazer isso foi usar o grfico de Lineweaver-Burk, como voc j sabe.
Para evitar eventuais discrepncias nos valores definitivos da Vmax e do Km, voc
pode adotar um mtodo numrico como, por exemplo, o ajuste no linear de mnimos
quadrados. Este mtodo otimiza matematicamente o melhor ajuste para um conjunto de
dados tentando minimizar a soma dos quadrados das diferenas (ou resduos) entre o
valor estimado e os dados experimentais. Por exemplo, ele ajusta diretamente a equao 29
michaeliana aos dados. isso que o pacote computacional Sigmaplot faz. Na janela
Toolbox do programa voc acessa o item Enzyme Kinetics Wizard que executa este
tipo de procedimento sem maiores exigncias.
Em suma, se voc criar um grfico de Lineweaver-Burk (ou os correlatos) use-o
apenas para exibir seus dados, o que pode facilitar suas interpretaes, em especial nos
casos de inibies enzimticas. Lembre-se que nossos olhos e mente esto acostumados
a entender mais facilmente as retas que as curvas. Foi assim, do ponto de vista
evolutivo. Portanto, no use a inclinao e a interseco de uma linha de regresso linear
para determinar os valores de Vmax e Km. Se fizer isso, voc no obter valores precisos.
Enfim, use a regresso no linear para obter valores mais precisos de Vmax e de Km.
Com a ajuda do programa Sigmaplot, insira os dados experimentais de V e de [S]

e obtenha Vmax e Km, usando regresso no linear. Transfira os resultados obtidos para a
tabela abaixo e compare com os demais procedimentos.
C. Valores de Vmax e Km obtidos pelos diferentes procedimentos
Michaelis- Lineweaver- Eadie- Regresso no-linear

Menten Burk Hofstee (mnimos quadrados)
Vmax (mol min-1)

Km (mmol L
-1
)
Exerccio de fixao

equimolares (12,0 mmol L-1) de glicose e frutose, e dela obtido o Fator de Calibrao
(FC) igual a 8,5.
Reagente (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6 7 8
Tampo acetato
(0,05 mol L-1 pH 4,7) 1,00 0,975 0,950 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50
Sacarose 250 mmol L-1 0,025 0,050 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
Enzima (0,08 mg mL-1) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Absorbncia 0,14 0,27 0,46 0,63 0,71 0,76 0,79
a) a atividade da invertase (V) expressa em velocidade da reao (mol min-1).

b) a concentrao de sacarose ([S]) no meio de reao, expressa em mmol L-1.
c) os dados de 1/V e de 1/[S].
d) os dados de V/[S].
Represente graficamente os dados obtidos de acordo com Michaelis-Menten,

Lineweaver-Burk e Eadie-Hofstee e ajuste no linear de mnimos quadrados. 30
Obtenha os valores de Vmax e de Km, para cada tipo de grfico.
2. Como a invertase pode ser inibida?
Compostos capazes de interferir com a catlise,

diminuindo ou interrompendo uma reao enzimtica so
denominados inibidores. Estudos com inibidores
enzimticos fornecem valiosas informaes sobre os
mecanismos enzimticos, alm de desvendar vias
metablicas. Os inibidores so constitudos de duas
classes: irreversveis e reversveis.
Inibidores irreversveis ligam-se covalentemente com um

grupo funcional da enzima, o qual essencial a ela, ou
formam uma associao no covalente estvel. Isso
muito til para estudar mecanismos de reao. Por exemplo, identificar aminocidos com
funo chave no stio ativo por meio da sua ligao com o inibidor irreversvel.
Inibidores reversveis ligam-se a stios especficos da enzima; se removidos, a

atividade da enzima pode ser restaurada. Com base nisso, existem trs tipos de
inibio: 1) competitiva, quando o inibidor se liga no mesmo stio do substrato e evita a
ligao deste com a enzima. Ocorre a formao do complexo EI. No modelo michaeliano,
este inibidor no altera a Vmax, mas aumenta o Km 2) incompetitiva, quando o inibidor se
liga em um stio distinto do stio ativo do substrato, mas liga-se apenas ao complexo ES
formando ESI. Ele diminui ambos Vmax e Km. 3) mista, quando o inibidor se liga em um
stio distinto do stio ativo do substrato. Todavia, ele pode se ligar tanto enzima
(formando EI) quanto ao complexo ES (formando ESI). Ele diminui a Vmax e aumenta o
31
Km. H um caso especial, includo no tipo de inibio mista, denominado inibio no
competitiva, quando o inibidor se liga em um stio que no o stio ativo da enzima e, de
modo similar inibio mista, forma os complexos EI e ESI. Este inibidor diminui a Vmax
sem alterar o Km.
2.1. Inibio da invertase pelo sulfato de cobre
Em pequenas quantidades, metais pesados como

cobalto, mangans, molibdnio, vandio, zinco e cobre,
entre outros, so necessrios para as funes vitais
dos organismos vivos. Todavia, em excesso eles podem
ser prejudiciais. Por exemplo, o cobre pode reagir com
os grupos sulfidrilas (-SH) de uma protena. As ligaes
dissulfeto so crticas na formao de estruturas
tridimensionais de uma protena, fato este que
determinar a atividade de uma enzima. A destruio
de pontes dissulfetos pode causar prejuzos s enzimas
e, como consequncia, ao organismo vivo. Embora o
mecanismo de inibio da invertase por metais pesados
no tenha sido conclusivamente demonstrado, sabe-se
que esta enzima fortemente inibida por eles.
Para determinar os efeitos do sulfato de cobre (CuSO4) sobre a atividade da
invertase, siga o procedimento abaixo.
Reagente (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6
Tampo acetato
1,00 0,80 0,60 0,50 0,40 0,20
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
CuSO4 20 mmol L-1 0,20 0,30 0,40 0,60
Sacarose 250 mmol L-1 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20

Enzima (0,08 mg mL-1) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20

Adicione DNS seguindo o mesmo intervalo de tempo estipulado acima. 32
DNS 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
Aquea a 100C por 5 minutos.

Resfrie os tubos e adicione gua destilada em todos os tubos.
gua destilada 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30
Transfira os contedos para tubos cnicos.

Centrifugue a 2.500 rpm por 3 minutos.
Transfira os sobrenadantes para tubos de ensaio
Absorbncia 0,00
Clculos
Etapa 1: Determinao da atividade enzimtica (V)

Etapa 2: Determinao da concentrao de CuSO4 no meio de reao
Calcule a concentrao de CuSO4 no meio de reao (tubo 3), considerando:

Concentrao inicial de CuSO4 = 20 mmol L-1
Volume inicial de CuSO4 = 0,20 mL
0,20 mL de CuSO4 + 0,20 mL de sacarose + 0,20 mL de invertase).
A concentrao final de CuSO4 no meio de reao dada pela regra:
Ci Vi = Cf Vf
onde: Ci = concentrao inicial de CuSO4; Vi = volume inicial de CuSO4; Cf =

concentrao final de CuSO4 e Vf = volume final do meio de reao. Ento:
20 mmol L-1 0,20 mL = [CuSO4] 1,20 mL
[CuSO4] = (20 mmol L-1 0,20 mL) 1,20 mL
[CuSO4] = 3,33 mmol L-1

33
Com base nesta descrio, calcule as concentraes de CuSO4 nos demais tubos
de reaes e insira na tabela abaixo.
Tubo Atividade [CuSO4] Inibio
(mol min-1) (mmol L-1) (%)
1 0,00 0,00 0,00
Plote, em papel milimetrado, os valores de 3

atividade enzimtica (V) versus [CuSO4]. 4
Calcule a % de inibio causada pelo CuSO4 em
5
funo do experimento sem inibidor (tubo 2). Plote
os valores de % de inibio versus [CuSO4]. 6
Exerccio de fixao
Os dados da tabela abaixo se referem a um experimento sobre os efeitos do

sulfato de cobre na atividade da invertase de leveduras. O tempo da reao foi de 5
minutos. Uma curva padro foi preparada com concentraes equimolares (12 mmol L -1)
dos produtos da reao enzimtica (frutose + glicose), e dela foi obtido o Fator de
Calibrao (FC) igual a 8,0.
Reagente (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6
Tampo acetato
0,80 0,75 0,70 0,60 0,50 0,40
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
CuSO4 40 mmol L-1 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40
Sacarose 200 mmol L-1 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Enzima (0,1 mg mL-1) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Absorbncia 0,810 0,700 0,620 0,510 0,390 0,220
a) a atividade da invertase (V) expressa em mol min-1.

b) a concentrao de CuSO4 no meio de reao, expressa em mmol L-1.
c) calcule a % de inibio causada pelo CuSO4 em funo do experimento sem
inibidor (tubo 1).
34
Represente graficamente os dados obtidos como:
a) V versus [CuSO4]
b) % de inibio versus CuSO4
2.2. Inibio da invertase pela glicose
Glicose (C6H12O6, aldohexose) um

monossacardeo de ampla distribuio na
natureza e com importantes funes
metablicas. , juntamente com a frutose,
um produto da hidrlise da sacarose, pela
ao da invertase. Alguns estudos indicam
que a glicose atua como inibidor da
invertase de leveduras.
Determine a atividade da invertase em funo da presena de glicose, no meio de

reao, seguindo o procedimento abaixo.
Experimento sem inibidor
Reagente (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6 7 8
Tampo acetato
1,00 0,975 0,950 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Sacarose 250 mmol L-1 0,025 0,050 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
Experimento com inibidor
Reagente (mL) Tubos

1 2 3 4 5 6 7 8 35
Tampo acetato
0,80 0,775 0,750 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30
(0,05 mol L-1 pH 4,7)
Sacarose 250 mmol L-1 0,025 0,050 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
Glicose 66 mmol L-1 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20

Enzima (0,08 mg mL-1) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20

DNS 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

gua destilada 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30
Absorbncia 0,00
Absorbncia (Inibidor) 0,00
Clculos
Calcule as atividades da invertase, nas reaes sem e com glicose, seguindo os

passos descritos na Etapa 2 (Clculos) do experimento Calculando a atividade da
invertase e insira na tabela abaixo. Obtenha os valores de 1/[V] e insira na tabela.
Etapa 2: Determinao da concentrao de sacarose no meio de reao
Utilize os valores das concentraes de sacarose ([S]) e 1/[S], sumarizados na

tabela (Resultados) do experimento Determinando os parmetros cinticos Vmax e Km

1) Experimento sem inibidor
Tubo V [S] 1/V 1/[S]

-1
(mol min ) (mmol L-1)
1 0,00 0,00 0,00 0,00
2
6
36
7
2) Experimento com inibidor
Tubo V [S] 1/V 1/[S]

(mol min-1) (mmol L-1)
1 0,00 0,00 0,00 0,00
2
Plote, em papel milimetrado, os valores de 1/V versus 1/[S] e verifique o tipo de

inibio causada pela glicose.
Invertase: uma tcnica avanada
para determinar a atividade cataltica
de cintica enzimtica
Bases tericas
A cromatografia lquida de alta eficincia (do ingls: high performance liquid

chromatography ou HPLC) um mtodo fsico-qumico que consiste na separao dos
componentes de uma amostra pelo processo de partio entre duas fases: uma fase
estacionria, em geral slida, e outra mvel constituda de um lquido que flui atravs da
primeira. A fase estacionria compreende pequenas colunas, recheadas de materiais
especialmente preparados por onde a fase mvel impulsionada sob alta presso. A
grande variedade de combinaes entre as duas fases torna esta tcnica extremamente
verstil e de grande aplicabilidade. A cromatografia pode ser utilizada para a
identificao de compostos atravs da comparao com padres conhecidos, para a
purificao de compostos separando as substncias indesejveis e para a separao dos
componentes de uma mistura. Assim, ela tem a capacidade de realizar separaes e
anlises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vrios
tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia
e sensibilidade.
Os principais componentes deste tipo de cromatgrafo (muitas vezes chamado
de HPLC) so: a) o solvente, que constitui a fase mvel e pode ser de vrios tipos ou
37
misturas (gua, metanol e acetonitrila); b) uma bomba de alta presso que impulsiona a
fase mvel; c) um injetor, que permite a entrada da amostra no sistema; d) uma coluna,
que constitui a fase estacionria e composta de material inerte como octadecil (C18,
RP18, ODS), octil (C8, RP8) e amina (NH2), por onde a fase mvel atravessa por eluio;
e) um detector, que mede o sinal eletrnico de cada composto presente na amostra e f)
um registrador, em geral um computador contendo um software apropriado para o
registro dos sinais num grfico (cromatograma), indicando quais os compostos e as suas
quantidades. A figura abaixo esquematiza estes componentes.
Proposio
Como voc deve ter notado nos experimentos anteriores a atividade da invertase
foi determinada pela quantificao espectrofotomtrica dos produtos formados na
reao, ou seja, glicose e frutose. Para isso voc usou o cido 3,5-dinitrossaliclico
(DNS) como reagente. Este procedimento permitiu que voc quantificasse a mistura de
glicose e frutose produzida na reao, mas no a quantidade de cada monossacardeo.
No experimento a seguir voc tambm quantificar os produtos finais da reao

da invertase. Todavia, ao contrrio da tcnica espectrofotomtrica, cada
monossacardeo ser quantificado por cromatografia (HPLC). Neste tipo de
procedimento, sacarose (substrato), glicose e frutose (produtos) so quantificados
utilizando como fase mvel gua ultrapura e como fase estacionria uma coluna
SupelcogelTM Pb. Uma vez efetuada a corrida cromatogrfica, a identificao dos
componentes da reao enzimtica, na amostra, possvel pela comparao dos seus
tempos de reteno (Rt) com aqueles de padres de sacarose, glicose e frutose. Cada
composto quantificado de acordo com a rea do pico cromatogrfico e, por
conseguinte, possvel determinar a atividade da invertase.
Objetivos
Determinar a atividade da invertase frente ao substrato sacarose 38

medindo, por HPLC, as quantidades de produtos formados.
Expressar a atividade enzimtica em velocidade da reao (V).
Protocolo
O fluxograma abaixo indica os procedimentos a serem adotados.
Extrato de invertase
Determinao da
atividade enzimtica
por cromatografia
Procedimento experimental
Material
gua ultrapura
Extrato de invertase
HCl 5 mol L-1
Padres de sacarose, glicose e frutose (cada qual a 500 mol L-1)
Sacarose 250 mmol L-1
1. Determinao da atividade da invertase
a. Em um tubo de ensaio adicione 0,9

mL de tampo acetato 0,05 mol L-1 (pH 4,7) e
0,2 mL de sacarose 250 mmol L-1. Mantenha o
tubo temperatura ambiente.
b. Inicie a reao adicionando 0,1 mL

de extrato de invertase (0,05 mg mL-1) e
marque o tempo de 5 minutos. Aps este
tempo, interrompa a reao adicionando 50 L
de HCl 5 mol L-1.
c. Filtre a amostra atravs de um

filtro-seringa de 0,45 m.
d. Se necessrio, dilua a amostra em gua ultrapura.

39
e. Injete 40 L da amostra filtrada em um cromatgrafo lquido de alta
eficincia equipado com uma bomba, um injetor automtico e um detector de ndice de
refrao. Use uma coluna SupelcogelTM Pb (30 cm x 7,8 mm) temperatura de 800C. Use
gua ultrapura como fase mvel com velocidade do fluxo de 0,5 mL min-1.
f. Identifique os picos correspondentes a sacarose, glicose e frutose

comparando os seus tempos de reteno (Rt) com os de padres cromatogrficos
injetados em condies similares amostra. Para confirmar a presena dos carboidratos
injete-os como padres internos no meio de reao.
g. Anote os valores das reas integradas dos picos cromatogrficos

correspondentes a amostra e aos padres de sacarose, glicose e frutose.
Resultados
rea do pico
Padro de sacarose
Padro de glicose
Padro de fructose
Amostra - sacarose
Amostra glicose
Amostra - frutose
Clculos
Levando em conta as reas dos picos, a atividade da invertase determinada como:
Etapa 1: Determinao da concentrao de glicose na amostra.
Considere, como exemplo, os dados abaixo.
Concentrao do padro de glicose = 500 mol L-1

rea do padro de glicose = 100.000
rea da amostra de glicose = 900.000
Ento, a concentrao da amostra de glicose [Gli] dada pela regra:

500 mol L-1 ____________ 100.000
[Gli] ____________ 900.000
[Gli] = 4.500 mol L-1
Se o volume usado na reao da invertase foi de 1,20 mL, ento a concentrao

da amostra de glicose [Gli] no ensaio :
4.500 mol ____________ 1.000 mL

[Gli] ____________ 1,20 mL
[Gli] = 5,4 mol
Etapa 2: Determinao da concentrao de frutose na amostra.
Considere, como exemplo, os dados abaixo.

40
Concentrao do padro de frutose = 500 mol L-1
rea do padro de frutose = 29.000
rea da amostra de frutose = 580.000
Ento, a concentrao da amostra de frutose [Fru] dada pela regra:

500 mol L-1 ____________ 29.000
[Fru] ____________ 580.000
[Fru] = 10.000 mol L-1
Se o volume usado na reao da invertase foi de 1,20 mL, ento a concentrao

da amostra de frutose [Fru] no ensaio :
10.000 mol ____________ 1.000 mL

[Fru] ____________ 1,20 mL
[Fru] = 12 mol
Etapa 3: Determinao da concentrao total de glicose e frutose na amostra.
A concentrao da mistura glicose e frutose [Gli+Fru] no meio de reao obtida

pela soma dos resultados individuais.
[Gli+Fru] = 5,4 mol + 12 mol = 17,4 mol
Observao: Caso tenha efetuado diluio da amostra corrija o valor da [Gli+Fru].

Etapa 4: Atividade da invertase expressa como velocidade da reao (V)
Se o tempo da reao da invertase foi de 5 minutos, ento a velocidade da

reao (V) :
V = 17,4 mol 5 minutos

V = 3,48 mol min-1
Observao: Seguindo o mesmo procedimento, voc poder calcular a concentrao

de sacarose na amostra. De posse deste dado voc poder calcular,
percentualmente, o consumo de sacarose pela ao da invertase.
Exerccio de fixao
Num experimento de pesquisa voc determinou a atividade da invertase recorrendo

cromatografia lquida de alta eficincia, e os dados esto descritos abaixo.
a) Tempo da reao enzimtica = 10 minutos.
b) Volume do tampo acetato 0,05 mol L-1 (pH 4,7) = 0,8 mL
c) Volume de sacarose 250 mmol L-1 = 0,5 mL.
d) Volume do extrato enzimtico = 0,4 mL.
e) Concentrao do padro de glicose = 200 mol L-1
f) rea do padro de glicose = 52.500
g) rea da amostra de glicose = 652.160 41
h) Concentrao do padro de frutose = 250 mol L-1
i) rea do padro de frutose = 39.700
j) rea da amostra de frutose = 323.230
Calcule a atividade da invertase na amostra, expressando o resultado em mol min-1.

APNDICE
de cintica enzimtica
42
Esboando o Relatrio de Atividades
O Relatrio de Atividades dever ser entregue, por cada equipe de trabalho, no

prazo estabelecido no Cronograma entregue no primeiro dia de aula.
O Relatrio abranger as atividades referentes ao assunto Invertase, e dever

conter os seguintes tpicos:
1. Capa contendo informaes nome da disciplina, ttulo do relatrio, nomes dos

membros da equipe e ano de execuo.
2. Introduo e Objetivos. Descrio sobre cintica enzimtica e invertase, o qual

no dever ultrapassar trs pginas, com texto em Times New Roman, tamanho
12, justificado e espao entre linhas de 1,5 cm.
3. Mtodos. Descrio sucinta das tcnicas utilizadas, no havendo necessidade da

transcrio literal do texto contido na apostila. Trata-se apenas de um breve
resumo da maneira como o experimento foi efetuado.
43
4. Resultados e Discusso. Apresentao dos resultados em tabelas e grficos,
seguidos de discusso.
5. Concluses. Descrio a respeito do que a equipe concluiu sobre o assunto,

incluindo as dificuldades encontradas e as sugestes de melhoria.
No abuse das teclas Control + C e Control + V
SEJA CRIATIVO !
REFERNCIAS
Asare-Brown, E., Bullock, C. Simple practical investigations using invertase. Biochemical

Education 16(2): 98-100, 1988.
Bonfig, K.B., Gabler, A., Simon, U.K., Luschin-Ebengreuth, N., Hatz, M., Berger, S.,
Muhammad, N., Zeier, J., Sinha, A.K., Roitsch, T. Post-translational derepression of
invertase activity in source leaves via down-regulation of invertase inhibitor
expression is part of the plant defense response. Molecular Plant 3(6): 1037-1048,
2010.
Campbell M.K., Farrell, S.O. Bioqumica. Thomson Learning, 5a edio, 2007.
Combes, D., Monsan, P. Sucrose hydrolysis by invertase. Characterization of products

and substrate inhibition. Carbohydrate Research 117: 215-228, 1983.
Miller, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Analytical Chemistry 31(3): 426-428, 1959.
Petkowicz, C.L.O. et al. Bioqumica: Aulas Prticas. 7 edio, Editora UFPR, 2007.
44
Santos, A.F. Imobilizao de invertase comercial e de Saccharomyces cerevisiae em
sabugo de milho e bagao de cana-de-acar. Dissertao (Mestrado)
Universidade Estadual Paulista. Jlio de Mesquita Filho. Faculdade de Cincias
Farmacuticas. Programa de Ps Graduao em Alimentos e Nutrio. Araraquara,
2010, 93 f.
Voet, D., Voet, J.D., Pratt, C.W. Fundamentos de Bioqumica. Artmed, Porto Alegre,
2000.
Wang, N.S. Experiment 14: Enzyme kinetics of invertase via initial rate determination.
http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab14.htm

Apostila 2017 Versão Final Laboratório de Enzimologia

Enviado por

Dados do documento

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Apostila 2017 Versão Final Laboratório de Enzimologia

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Universidade Estadual de Maring

realizadas na disciplina Laboratrio de Enzimologia, compreendendo experimentos

clssicos de atividade enzimtica e anlise cintica.

Com ele, voc executar experimentos que visem avaliar as

caractersticas de uma enzima com o auxlio da espectrofotometria

e da cromatografia lquida de alta eficincia.

Todo o material est dividido em tpicos, representados pelos diferentes

experimentos. Cada tpico composto por Bases tericas, Proposio, Objetivos,

experimento. No final deste guia, voc encontrar um Apndice com o formato do

Relatrio de Atividades a ser confeccionado pela equipe de trabalho.

Lidar com enzimas um empolgante

desafio! Na prtica significa: pipetar,

pipetar e pipetar... Se voc errar, no

desanime. H sempre uma chance para

Aceite este desafio, concentre-se

Invertase: atividade cataltica ........................................................................................................... 3

Sacarose um dissacardeo composto de uma

Invertase (ou -D-frutofuranosidase; EC 3.2.1.26) uma enzima que catalisa a

O nome comum, invertase, se deve basicamente ao fato de que a hidrlise da

A figura ao lado mostra a estrutura tridimensional da invertase de

Nas prximas aulas voc conduzir

A. FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE DA INVERTASE 4

Nestes experimentos voc extrair a invertase de leveduras e realizar ensaios que

Extrair invertase de leveduras (fermento biolgico) e avaliar os

Expressar a atividade enzimtica em: a) velocidade da reao (V),

O fluxograma abaixo indica os procedimentos a serem adotados.

Pese 50 g de fermento seco e dissolva em 250 mL de

2. Quais os fatores que influenciam a atividade da invertase?

Como voc j sabe, invertase hidrolisa sacarose (um dissacardeo no redutor)

Tubo A: pipete 1,0 mL de tampo acetato 0,05 mol

Tubo B: pipete 0,6 mL de tampo acetato 0,05

Deixe os tubos temperatura ambiente. Adicione

Compare os dois tubos. O que voc notou?

Observe o tubo B. A seguir, leia com ateno o protocolo e verifique quais os

[glicose + frutose] tempo de reao

Diante do que voc observou neste procedimento algumas medidas sero

3. Como quantificar os produtos da reao da invertase? 7

Levando em conta que a reao enzimtica da hidrlise de sacarose produz

Reagente (mL) Tubos

Adicione DNS em todos os tubos.

DNS 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

Aquea a 100C por 5 minutos.

gua destilada 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30 3,30

Etapa 1: Determinao da concentrao de glicose + frutose no meio de reao

Concentrao inicial da mistura equimolar [glicose + frutose] = 12 mmol L-1.

Portanto, a [glicose + frutose] no meio dada pela regra:

onde: Ci = [glicose + frutose] inicial; Vi = volume inicial da mistura equimolar; Cf =

Aplique o mesmo raciocnio para os demais tubos. Anote os resultados.

Etapa 2: Obteno do fator de calibrao (FC)

Plote um grfico de Absorbncia versus [glicose +

Calcule o fator de calibrao (FC), expresso em

4. Como calculada a atividade da invertase?

Etapa 1: Determinao da concentrao de invertase no meio de reao.

Calcule a concentrao da enzima no meio de reao do tubo B, considerando:

onde: Ci = concentrao inicial de invertase; Vi = volume inicial de invertase; Cf =

0,05 mg mL-1 0,40 mL = [invertase] 1,20 mL

Com base nesta informao calcule a atividade da invertase como segue.

Etapa 2: Atividade da invertase expressa como velocidade da reao (V)

O termo atividade enzimtica designa a prpria atividade cataltica da enzima

[glicose + frutose] = FC A540

Se o volume final do meio de reao foi 1,2 mL, ento:

4,68 mol ____________ 1,0 mL

Se o tempo de reao foi de 5 minutos, ento a velocidade da reao (V) :

V = [glicose + frutose] tempo da reao