Coordenadoria de Biotecnologia

Curso de Bioquímica

Práticas: Cinética enzimática em placa de 96 poços

Alunos: Jorge Barros, Lucas Santos e Nathan Coelho

Turma: QM 161

Professores: Fernanda Kamp e Márcio Loureiro

Data da realização da prática: 01/10/18

Data da entrega do relatório: 05/11/18

Avaliação:

Critério: Nota:
Apresentação
Introdução
Objetivos
Métodos
Resultados
Discussão
Bibliografia
Total:
 I. Introdução

Uma das partes mais importantes do organismo humano são os catalisadores

biológicos, que atuam desde a digestão de alimentos até a duplicação do DNA e são
necessárias para acelerar reações químicas que nele ocorrem. Esses catalisadores
biológicos são chamados de enzimas, unidades geralmente proteicas (com
exceção das ribozimas, que são formadas por RNA’s) de alta especificidade que
abaixam a energia de ativação (energia inicial necessária para que reações químicas
ocorram). Sem eles, muitas reações demorariam um tempo imensamente maior (cerca
de 106 a 1012 vezes maior) ou até mesmo poderiam não ocorrer. 
A enzima pode possuir ainda cofator e coenzima, como se pode observar na imagem
abaixo: 

 
Figura 1: Estrutura de uma holoenzima genérica.

É possível observar nesta enzima a presença de cofator e coenzima, que são

estruturas que auxiliam na ligação com o substrato e/ou formação do produto, alterando
o sítio catalítico e acelerando o processo de quebra do substrato. Cofatores geralmente
estão presentes na forma de íons inorgânicos, como magnésio por exemplo. Já as
coenzimas são moléculas orgânicas derivadas de vitaminas. Entretanto, não são
estruturas necessárias para todas as enzimas. 
 
  

Figura 2:   Representação genérica do funcionamento de uma enzima.

Como é possível observar na imagem acima sobre um mecanismo genérico do

funcionamento das enzimas, toda enzima possui um sítio ativo que é altamente
específico, ou seja, reage com uma substância específica (chamados substratos). O
modo com que a enzima se ajusta ao seu substrato se chama ajuste induzido, e faz com
que as interações sejam mais efetivas. A enzima age sobre o substrato por meio de
múltiplas interações fracas de aminoácidos específicos que são otimizadas no estado de
transição. Porém, vale ressaltar que esta interação enzima-substrato não é perfeita pois,
caso fosse, seria formado um complexo de baixa energia e, consequentemente, o estado
de transição não seria atingido. 

Figura 3: Modelo genérico do ajuste induzido, onde a enzima, ao se ligar com o

substrato, realiza uma série de ajustes conformacionais para se adaptar e otimizar suas
interações. 
  
Figura 4: gráfico energético da catalise da glicose.

Neste gráfico é possível observar que na linha vermelha (a reação sem enzima) é
demandada uma energia de ativação muito maior para que seja realizada a formação dos
produtos. Já na linha azul mostra-se a reação com enzima, que é notoriamente um
processo mais favorável pois demanda uma energia inicial menor, diminuindo o tempo
de reação. 
Para que se possa entender o mecanismo de reação das enzimas, bem como suas
melhores condições de trabalho e velocidades, tem-se o estudo da cinética enzimática. 

Figura 5: Representação das etapas de ligação da enzima com substrato e

formação do produto.

Para esse estudo, deve-se ter compreensão destes três estágios que regem as
interações da enzima “E” com o substrato “S” a fim de formar o produto “P”. Na
primeira etapa, ocorre o encontro de E com S. A transição da primeira para a segunda
etapa é reversível e regida pela constante K1. Na segunda etapa é quando a enzima se
deforma e as interações fracas de seus aminoácidos se formam com S, no intuito de ter
um melhor estado de transição. Nesta etapa, o complexo E-S é formado. Para que se
possa atingir a terceira etapa, demanda-se uma grande quantidade de tempo (esta é a
etapa lenta da reação). Portanto, essa etapa rege a velocidade da reação. Por fim, o
produto é liberado. Percebe-se que esta etapa não é reversível pois o produto formado
não é semelhante o suficiente para que reaja com a enzima no sentido inverso. 
A velocidade das reações de catálise enzimática é dada pela variação da
concentração de substrato sobre um determinado período de tempo. Portanto, conclui-se
que quanto maior a quantidade de substrato, maior a velocidade inicial de uma reação,
como pode ser observado no gráfico abaixo: 

Figura 6: gráfico que representa a velocidade da reação dado uma determinada

concentração de substrato. Modelo de Michaelis-Menten.

É possível observar no gráfico o valor de velocidade máxima, que é quando todas as

enzimas estão com seus sítios ativos ocupados, ou seja, saturadas. Também se observa o
valor de meio Vmáx, que representa a constante de Michaelis (Km), que nada mais é do
que o nível de afinidade da enzima com o substrato. Quanto menor o valor dessa
constante, maior o nível de afinidade enzima-substrato. A velocidade inicial (V0) pode
ser calculada a partir de: 
  Como toda proteína, as enzimas também possuem condições ideais de pH,
temperatura e concentração para que possam ter maior efetividade. 
 A concentração do substrato, como já visto, aumenta a velocidade das reações
enzimáticas devido a fórmula que foi apresentada. Isso porque, quanto mais substrato,
maior a quantidade de produto que será formado. 
A temperatura também altera a atividade enzimática, pois cada enzima possui uma
temperatura ideal para atuar. Em média, a temperatura ideal de atuação das enzimas do
corpo humano é de aproximadamente 37 graus Celsius. Essa temperatura promove a
quantidade ideal de choques entre a enzima e o substrato. Porém, caso essa temperatura
aumente, pode ocasionar a desnaturação das enzimas, causando perda no formato desta,
inutilizando-a. Problemas em diversos âmbitos para o organismo humano podem ser
observados quando há febre devido a essa desnaturação enzimática. 
Alterações no pH ideal de funcionamento geram desnaturação enzimática. Essa
dificuldade se dá devido as alterações que podem ocorrer nas cadeias laterais dos
aminoácidos do sítio ativo, gerando problemas no momento de ligação enzima-
substrato. 
Além desses fatores que, caso alterados dos padrões, podem dificultar a formação do
complexo enzima-proteína, inibidores podem ser introduzidos ao sistema, impedindo
temporariamente ou permanentemente que a ligação E-S seja formada. Podem ser
divididos em dois grupos: 
Reversíveis: como o próprio nome já diz, são reversíveis pois, depois de um dado
período de tempo, a enzima pode se soltar dele, recuperando sua atividade enzimática.
Neste grupo existem subdivisões. Dentre elas: 
Inibidores enzimáticos reversíveis competitivos: por serem estruturas parecidas com
o substrato da enzima, esta classe de inibidor compete com o substrato pelo sítio ativo
da enzima. Esse tipo de inibição altera a constante de Michaelis da enzima sem alterar a
velocidade máxima. 
Inibidores enzimáticos reversíveis não competitivos: se ligam a um lugar diferente do
sítio ativo da enzima somente quando o substrato já está ligado a enzima ou quando a
enzima está sozinha. Isso faz com que o sítio ativo se deforme ao ponto de não
transformar o substrato em produto. Diminui a velocidade máxima sem alterar a
constante de Michaelis. 
Inibidores enzimáticos reversíveis incompetitivos: atua da mesma forma que os
inibidores não competitivos, porém somente podem se ligar a enzima quando esteja
catalisando um substrato. A constante de Michaelis e a velocidade diminuem. 
Inibidores enzimáticos reversíveis mistos: semelhantes a inibição não competitiva,
porém aumenta o Km e diminui a velocidade máxima devido a diferença das constantes
de ligação da enzima livre e da enzima conjugada com o substrato.

II. Objetivo

Como objetivo foram feitas quantificações transportadas para gráficos das

influências enzimáticas em diversas situações como influência da temperatura, pH e
curso temporal de catálise tendo como base os modelos cinéticos de Michaelis-Menten e
de Lineweaver-Burk.

III. Materiais e Métodos

III.A Materiais
 Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris-HCl pH
9,5
 Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM em tampão Tris-HCl pH
9,5.
 Solução tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, 8,5 e 9,5
 Solução de Na2HPO4 ___ mM em tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5 (sol.
tampão Tris-Pi-HCl)
 Soluções tampão borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5
 Soluções tampão citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5
 Solução de NaOH 2 M
 Solução de enzima: fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1) ___ μg/mL (Sigma
Fine Chemicals)
 Pipetador automático 20-100 μL
  Pipetador automático 200-1000 μL
 Tubos de ensaio
 Vortex
 Banho de gelo (0 C)
 Banho-maria (25 C)
 Banho-maria (37 C)
 Banho-maria (68 C)
 Placa de 96 poços para leitor de elisa

III.B Métodos

Construção da curva padrão de PNPeu ach

Transferiu-se, com auxílio de pipeta e pró-pipete, alíquotas das soluções indicadas
para tubos de ensaio devidamente rotulados seguindo a tabela I.
Tabela I: Preparo do meio reacional do ensaio construção da curva padrão do PNP.
Solução Tampão Solução de
Tubo nº padrão de Tris-HCl, NaOH
PNP (µL) pH 9,5 (µL) 2M (µL)
B - 800 200
1 75 725 200
2 150 650 200
3 225 575 200
4 300 500 200
5 375 425 200
6 450 300 200
7 525 275 200

Em seguida, homogeneizou-se os tubos manualmente e transferiu-se 200 µL para

uma placa de 96 poços para posterior leitura em 405 nm.

Curso Temporal
Preparou-se o meio de reação transferindo, com auxílio de uma micropipeta,
alíquotas das soluções indicadas para um poço da placa de 96 poços devidamente
identificada segundo a tabela II.
Tabela II: Preparo do meio reacional do ensaio de curso temporal.
Tampão Tris-HCl 0,2 PNPP 1 mM ( µL) Pré-incubar por 5 Enzima ( µL)
M pH 9,5 ( µL) minutos a 37 ºC
 125 62,5 12,5

Por fim, colocou-se a placa no leitor e procedeu-se a leitura por 60 minutos,

tomando-se leituras de absorbância a cada 3 minutos. O valor de absorbância obtido no
tempo 0 minutos é tido como valor de branco para este ensaio, pois neste momento
ainda não há presença de produto.

Influência da temperatura
Transferiu-se, com auxílio de micropipetas, alíquotas das soluções indicadas para
tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela III, exceto a solução de enzima
e de NaOH. Em seguida, pré-incubou-se os tubos durante 5 minutos nas respectivas
temperaturas.
Utilizando uma micropipeta, adicionou-se a solução de enzima aos tubos 1 a 4 em
intervalos de 5 segundos, determinando o horário exato de início do ensaio. Em seguida,
homogeneizou-se os tubos manualmente. Incubou-se todos os tubos nas respectivas
temperaturas por 15 minutos. Aos tubos branco, adicionou-se a enzima somente depois
da adição de NaOH.
Por fim, paralisou-se a reação adicionando NaOH 2M aos tubos de 1 a 4 em
intervalos de 5 segundo, homogeneizando os tubos manualmente em seguida e
transferiu-se 200 μL para uma placa de 96 poços para leitura posterior em 405 nm,
utilizando o tubo “branco” de cada um dos tampões como referência de calibração para
o aparelho.
Tabela III: Preparo do meio reacional do ensaio de influência da temperatura.
Tampão
Solução de
Tris-HCl PNPP 1 Temperatura Enzima
Tubo nº NaOH
pH9,5 mM (μL) (ºC) (μL)
(μL)
(μL)
1B 500 250 4 50 200
1 500 250 4 50 200
2B 500 250 ambiente 50 200
2 500 250 ambiente 50 200
3B 500 250 37 50 200
3 500 250 37 50 200
4B 500 250 68 50 200
4 500 250 68 50 200

Influência do pH
 Transferiu-se, com auxílio de micropipetas, alíquotas das soluções indicadas para
tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela IV, exceto a solução de enzima
e de NaOH. Em seguida, utilizando uma micropipeta, adicionou-se a solução de enzima
aos tubos 1 a 9 em intervalos de 5 segundos, determinando o tempo exato de início de
ensaio, e homogeneizou-se os tubos manualmente. Aos tubos branco, a enzima só foi
adicionada depois da adição da solução de NaOH. Por fim, incubou-se todos os tubos
em temperatura ambiente por 15 minutos.
Paralisou-se a reação adicionando NaOH 2M aos tubos de 1 a 9 em intervalos de 5
segundos e homogeneizou-se os tubos manualmente. Por fim, transferiu-se 200 μL para
uma placa de 96 poços para leitura posterior em 405 nm, utilizando o tubo “branco” de
cada um dos tampões como referência de calibração para o aparelho.
Tabela IV: Preparo do meio reacional do ensaio de influência do pH.
Solução
Solução Solução tampão PNPP
Tubo tampão Enzima NaOH
tampão Tris- Borato-NaOH 10 mM
nº Citrato-HCl (μL) (μL)
HCl (μL) (μL) (μL)
(μL)
pH pH pH pH pH pH pH pH pH
5,5 6,5 7,5 7,5 8,5 9,5 9,5 10,5 11,5
B 1-3 500 25 50 200
B 4-6 500 25 50 200
B 7-9 500 25 50 200
1 500 25 50 200
2 500 25 50 200
3 500 25 50 200
4 500 25 50 200
5 500 25 50 200
6 500 25 50 200
7 500 25 50 200
8 500 25 50 200
9 500 25 50 200

Curva do Substrato
Transferiu-se, com auxílio de micropipetas, alíquotas das soluções indicadas para
tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto a solução de
enzima e de NaOH.
Utilizando uma micropipeta, adicionou-se a solução de enzima aos tubos 1 a 13 em
intervalos de 5 segundos, determinando o horário exato de início do ensaio e, em
seguida, homogeneizou-se os tubos manualmente. Nos tubos branco, colou-se a enzima
somente depois da adição da solução de NaOH.
Posteriormente, incubou-se todos os tubos em temperatura ambiente por 15 minutos
e após este período paralisou-se a reação adicionando NaOH 2M aos tubos de 1 a 13 em
intervalos de 5 segundos. Homogeneizou-se os tubos manualmente.
Por fim, transferiu-se 200 μL para uma placa de 96 poços para leitura posterior em
405 nm, utilizando o tubo “branco” de cada um dos tampões como referência de
calibração para o aparelho.
Tabela V: Preparo do meio reacional do ensaio construção da curva do substrato.
Tampão
PNPP 1 Mm Solução de
Tubo nº Tris-HCl pH Enzima (μL)
(μL) NaOH (μL)
9,5
B 725 25 50 200
1 725 25 50 200
2 700 50 50 200
3 675 75 50 200
4 650 100 50 200
5 600 150 50 200
6 550 200 50 200
7 500 250 50 200
8 450 300 50 200
9 375 375 50 200
10 300 450 50 200
11 225 525 50 200
12 150 600 50 200
13 75 675 50 200

Influência do inibidor
Transferiu-se, com auxílio de micropipetas, alíquotas das soluções indicadas para
tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto a solução de
enzima e de NaOH.
Utilizando uma micropipeta, adicionou-se a solução de enzima aos tubos 1 a 13 em
intervalos de 5 segundos, determinando o horário exato de início do ensaio e, em
seguida, homogeneizou-se os tubos manualmente. Nos tubos branco, colou-se a enzima
somente depois da adição da solução de NaOH.
Posteriormente, incubou-se todos os tubos em temperatura ambiente por 15 minutos
e após este período paralisou-se a reação adicionando NaOH 2M aos tubos de 1 a 13 em
intervalos de 5 segundos. Homogeneizou-se os tubos manualmente.
 Por fim, transferiu-se 200 μL para uma placa de 96 poços para leitura posterior em
405 nm, utilizando o tubo “branco” de cada um dos tampões como referência de
calibração para o aparelho.
Tabela VI: Preparo do meio reacional do ensaio de influência do inibidor.
Tampão
PNPP 1 Mm Inibidor Solução de
Tubo nº Tris-HCl pH Enzima (μL)
(μL) (μL) NaOH (μL)
9,5
B 650 25 50 50 200
1 650 25 50 50 200
2 625 50 50 50 200
3 600 75 50 50 200
4 575 100 50 50 200
5 525 150 50 50 200
6 475 200 50 50 200
7 425 250 50 50 200
8 375 300 50 50 200
9 300 375 50 50 200
10 225 450 50 50 200
11 150 525 50 50 200
12 75 600 50 50 200
13 0 675 50 50 200

IV. Resultados
Construção da curva padrão de PNP
Os resultados obtidos a partir das adições descritas na metodologia (tabela I) estão
dispostos na tabela VII:
Tabela VII: Resultados do ensaio da construção da curva padrão de PNP.
Tampão Nmoles de ABS. 405 ABS. 405
Solução Solução de
Tris-HCl, PNP nm nm
Tubo nº padrão de NaOH corrigida
pH 9,5
PNP (µL) 2M (µL)
(µL)
B - 800 200 0,00 0,069 -
1 75 725 200 7,5 0,118 0,049
2 150 650 200 15 0,202 0,133
3 225 575 200 22,5 0,266 0,197
4 300 500 200 30 0,344 0,275
5 375 425 200 37,5 0,402 0,333
6 450 300 200 45 0,483 0,414

7 525 275 200 52,5 0,566 0,497

 Curso Temporal
Os resultados obtidos a partir das adições descritas na metodologia (tabela II) estão
dispostos na tabela abaixo.

Tabela VIII: Resultados do ensaio de curso temporal.

Abs. 405 nm Concentração
Tempo (min) Abs. 405 nm
corrigida (nmoles)
0 (branco) 0,0681 - -
3 0,1435 0,0754 7,57
6 0,2198 0,1517 15,2
9 0,291 0,2229 22,4
12 0,3597 0,2916 29,3
15 0,423 0,3549 35,6
18 0,4845 0,4164 41,8
21 0,542 0,4739 47,6
24 0,5966 0,5285 53,1
27 0,6483 0,5802 58,2
30 0,6972 0,6291 63,2
33 0,7434 0,6753 67,8
36 0,7877 0,7196 72,2
39 0,8295 0,7614 76,4
42 0,8698 0,8017 80,5
45 0,9081 0,84 84,3
48 0,9449 0,8768 88,0
51 0,9801 0,912 91,6
54 1,014 0,9459 95,0
57 1,0467 0,9786 98,2
60 1,078 1,0099 101,4

Influência da temperatura
Os resultados obtidos a partir das adições descritas na metodologia (tabela III) estão
dispostos na tabela abaixo.
Tabela IX: Resultados do ensaio de influência de temperatura.
Tampão Abs. 405
Solução
Tris-HCl PNPP 1 Temperatura Enzima nm
Tubo nº de NaOH
pH9,5 mM (μL) (ºC) (μL)
(μL)
(μL)
1B 500 250 4 50 200 0,0545
1 500 250 4 50 200 0,1117
2B 500 250 ambiente 50 200 0,0567
2 500 250 ambiente 50 200 0,2985
3B 500 250 37 50 200 0,0573
3 500 250 37 50 200 0,3345
 4B 500 250 68 50 200 0,0565
4 500 250 68 50 200 0,1359

Influência do pH
Os resultados obtidos a partir das adições descritas na metodologia (tabela IV) estão
dispostos na tabela abaixo.

Tabela X: Resultados do ensaio de influência de pH.

Solução Abs. 405
Solução Solução tampão PNPP
Tubo tampão Enzima NaOH nm
tampão Tris- Borato-NaOH 10 mM
nº Citrato-HCl (μL) (μL)
HCl (μL) (μL) (μL)
(μL)
pH pH pH pH pH pH pH pH pH
- - - - -
5,5 6,5 7,5 7,5 8,5 9,5 9,5 10,5 11,5
B 1-3 500 25 50 200 0,0579
B 4-6 500 25 50 200 0,0634
B 7-9 500 25 50 200 0,0544
1 500 25 50 200 0,0795
2 500 25 50 200 0,0984
3 500 25 50 200 0,0963
4 500 25 50 200 0,1353
5 500 25 50 200 0,1949
6 500 25 50 200 0,2638
7 500 25 50 200 0,0901
8 500 25 50 200 0,0712
9 500 25 50 200 0,0653

Curva do Substrato
Os resultados obtidos a partir das adições descritas na metodologia (tabela V) estão
dispostos na tabela abaixo.
Tabela XI: Resultados do ensaio de obtenção da curva do substrato.
Tampão Abs. 405 nm
PNPP 1 Mm Solução de
Tubo nº Tris-HCl pH Enzima (μL)
(μL) NaOH (μL)
9,5
1 725 25 50 200 0,076
2 700 50 50 200 0,129
3 675 75 50 200 0,1702
4 650 100 50 200 0,201
5 600 150 50 200 0,2357
 6 550 200 50 200 0,2668
7 500 250 50 200 0,2847
8 450 300 50 200 0,3017
9 375 375 50 200 0,3164
10 300 450 50 200 0,3267
11 225 525 50 200 0,3371
12 150 600 50 200 0,3519
13 75 675 50 200 0,3639

Influência do inibidor
Os resultados obtidos a partir das adições descritas na metodologia (tabela VI) estão
dispostos na tabela abaixo.
Tabela XII: Resultado do ensaio de influência do inibidor.
Tampão Solução de Abs. 405
PNPP 1 Inibidor Enzima
Tubo nº Tris-HCl NaOH nm
Mm (μL) (μL) (μL)
pH 9,5 (μL)
1 650 25 50 50 200 0,0298
2 625 50 50 50 200 0,0528
3 600 75 50 50 200 0,0787
4 575 100 50 50 200 0,0976
5 525 150 50 50 200 0,1177
6 475 200 50 50 200 0,1427
7 425 250 50 50 200 0,1597
8 375 300 50 50 200 0,1894
9 300 375 50 50 200 0,2094
10 225 450 50 50 200 0,2322
11 150 525 50 50 200 0,2461
12 75 600 50 50 200 0,2599
13 0 675 50 50 200 0,2744

V. Discussão
VI. Bibliografia